Evaluación funcional y morfológica de Diafragma Inervación por frénico neuronas motoras

Resumen

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Resumen

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Introducción

Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad de la motoneurona debilitante asociada con la pérdida de las neuronas motoras superiores e inferiores y la consiguiente parálisis muscular. Tras el diagnóstico, la supervivencia del paciente es en promedio de sólo 2.5 años ^1. Pérdida frénico motoneurona (PhMN) es un componente crítico de la patogénesis de la ELA. Los pacientes mueren en última instancia debido a la pérdida de PhMN inervación del diafragma, el músculo principal de inspiración ^2,3. Lesión medular traumática (SCI) es también un problema serio con dificultades respiratorias asociadas. Aproximadamente 12.000 nuevos casos de SCI se producen cada año ⁴ debido a daño traumático de la médula espinal. A pesar de la heterogeneidad de la enfermedad con respecto a la ubicación, el tipo y la gravedad, la mayoría de los casos de SCI implica trauma en la médula espinal cervical, que a menudo resulta en compromiso respiratorio debilitante y persistente. Además de ALS y SCI, otro sistema nervioso central (SNC) enfermedades se puede asociar wdisfunción respiratoria diafragmática ITH ^5,6.

El nervio frénico es un nervio motor eferente que inerva el hemi-diafragma ipsilateral y que se origina en los cuerpos celulares PhMN ubicados en los niveles de C3-C5 del mismo lado de la médula espinal cervical. Salida PhMN es controlado por descender de entrada bulboespinal del tronco cerebral en un área conocida como el grupo rostral ventral respiratoria (rVRG) ^7. El circuito rVRG-PhMN-diafragma es central para el control de la respiración de inspiración, así como otros comportamientos de diafragma no ventilatorios. Diversas lesiones traumáticas y enfermedades neurodegenerativas que afectan a este circuito pueden conducir a una profunda disminución de la función respiratoria y la calidad de vida del paciente. Descendente de entrada para PhMNs de la supervivencia rVRG, PhMN, la integridad del nervio frénico y la inervación adecuada en la unión neuromuscular diafragma (NMJ) son todos necesarios para la función normal del diafragma. Por tanto, es importante emplear técnicas quepuede evaluar cuantitativamente este circuito in vivo en modelos de roedores de ALS, SCI y otras enfermedades del SNC.

Con este protocolo, el objetivo es describir las herramientas experimentales para evaluar PhMN inervación del diafragma, tanto a nivel electrofisiológico y morfológicos. Los potenciales de acción muscular compuesto (CMAPs) se registran mediante la estimulación de todos los axones de la neurona motora eferente de un nervio motor dado y luego analizar la respuesta de despolarización elicitada de las miofibras de destino. Esta técnica se puede utilizar in vivo en ratas y ratones anestesiados para cuantificar la inervación funcional de la hemi-diafragma por PhMNs ^8. Debido al hecho de que CMAPs representan la grabación simultánea de todos (o al menos muchos / la mayoría) miofibras del todo-hemi diafragma, es útil examinar también los fenotipos de los axones motores individuales y miofibras en la UNM diafragma con el fin de realizar un seguimiento de la enfermedad - y terapia relevante cambios morfológicos como parcial y compledenervación te, surgimiento de regeneración y reinervación. Esto se puede lograr a través de todo el montaje inmunohistoquímica (IHC) de la membrana, seguido por la evaluación morfológica detallada de NMJs individuales a lo largo del músculo ^9. Combinando CMAPs y análisis UNM proporciona un enfoque poderoso para estudiar cuantitativamente inervación diafragmática en modelos de roedores de enfermedad del SNC y SNP.

Protocolo

Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité de la Universidad Thomas Jefferson cuidado de los animales institucional y el uso y llevaron a cabo en cumplimiento de la Directiva Comunidades Europeas (2010/63 / UE, 86/609 / CEE y 87 a 848 / CEE), la Guía del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y la Sociedad para las Políticas de Neurociencia en el uso de animales en Investigación de Neurociencia.

1. Potenciales de Acción Compuesto musculares (CMAPs)

1. Preparación del animal:
   1. Anestesiar la rata utilizando un inhalante (isoflurano) a 2.1% entregado al efecto o por inyección (ketamina, xilazina, acepromacina). La dosificación de la anestesia inyectable es la siguiente: 95,0 mg / kg de ketamina, 10,0 mg / kg de xilazina, 0,075 mg / kg de acepromazina.
      NOTA: Nosotros usamos con éxito tanto de inhalantes y anestésico inyectable enfoques al realizar este protocolo grabación CMAP, sin preferencia.
   2. El animal debe mantenerse a la una apropiadase inicia la profundidad nesthetic antes de la cirugía, a través de la conclusión de la cirugía, y hasta la buprenorfina postoperatorio ha surtido efecto. Confirmar anestesia adecuada por breve pizca dedo del pie para determinar que una respuesta de retirada no se provoca. Además, probar el reflejo corneal con un hisopo de algodón. A lo largo del procedimiento quirúrgico, determinan que la frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria no han aumentado, lo que sugiere que la profundidad de la anestesia se ha convertido en demasiado clara.
   3. Aplique un ungüento veterinario en los ojos del animal para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
   4. El cirujano debe lavar su / sus manos con un desinfectante (matorrales clorhexidina) antes de comenzar la cirugía. El cirujano debe usar guantes estériles, mascarilla y bata o bata de laboratorio limpio. Todos los instrumentos deben lavarse y esterilizarse en autoclave antes de la cirugía. Añadir una tira de indicador de esterilización en el interior del kit de instrumento antes de la esterilización en autoclave a nivel de los instrumentos para verificar que la esterilización es completa. El cirujano debeverifique que toda la línea en la tira es negro antes de comenzar la cirugía. Pegue la parte exterior de la caja con cinta de autoclave indicando también. Si la cirugía se va a realizar en varios animales en el mismo día, la limpieza de los instrumentos entre cirugías y esterilizar en un esterilizador de perlas de vidrio. Si es necesario, esterilizar ambos extremos del instrumento en el esterilizador de perlas de vidrio mediante la colocación de la empuñadura del instrumento en el esterilizador durante el tiempo apropiado, la eliminación del instrumento con una pinza hemostática estéril, enfriándolo en un campo estéril y luego colocando el extremo funcional de el instrumento en el esterilizador de cuentas de vidrio para el período de tiempo adecuado.
   5. Una vez que los animales se anestesiaron, lugar a bordo quirúrgica con la superficie dorsal hacia abajo y el abdomen hacia arriba de modo que la cinta puede ser usado para asegurar las extremidades anteriores de animales a bordo quirúrgico.
   6. Afeitado caudalmente superficie ventral a partir de la base del cráneo, y asegúrese de que el área alrededor del abdomen a cada lado de la línea media es shaved dependiendo de qué se está grabando hemi-diafragma. Aplicar de povidona yodada a la superficie de afeitado de la piel.
2. Preparación para las grabaciones CMAP:
   1. Después de la preparación de los animales, el lugar electrodo de masa por vía subcutánea en la cola (Figura 1).
   2. Coloque el electrodo de referencia por vía subcutánea en la región abdominal inferior contralateral.
   3. Coloque gel conductor sobre la tira superficie autoadhesiva o electrodo de grabación en disco (dimensiones de superficie de la banda de electrodos: 0,5 x 3 cm), y luego colocar electrodo de superficie transversalmente a lo largo del reborde costal unilateral.
   4. Coloque electrodos de estimulación transcutánea 0,5 cm aparte laterales a la tráquea y superior a la clavícula. Inserte los electrodos de aproximadamente 1,0 cm de profundidad a través de la piel. Asegure los electrodos a mano por lo que su ubicación no se mueve con estimulaciones posteriores.
      NOTA: Ángulo electrodos de estimulación 90 ° con respecto a la piel en el sitio de insertion.
3. Potenciales de acción muscular compuesto (CMAP) grabaciones:
   1. Obtener registros electrofisiológicos utilizando un estimulador / amplificador seguido por el análisis de datos asistido por ordenador.
   2. Los parámetros de estímulo de la estimulación de tracción única debe ser 0,5 mseg, legumbres supramáximos 1,0 Hz. La amplitud del estímulo debe estar entre 6,0 y 8,0 V (Figura 2A).
      NOTA: En un experimento, utilice una intensidad del estímulo con la misma amplitud a través de los animales. El objetivo es maximizar la amplitud de la respuesta mediante el uso de la amplitud mínima de estimulación. Es importante tener en cuenta que la respuesta inicial que se produce en el momento de la estimulación es un artefacto de estimulación. Además, se debe tener cuidado para obtener una respuesta CMAP que está precedida por una línea de base estable / plana después de que el artefacto de estimulación, que es seguido por la respuesta CMAP rápida. Con el fin de obtener una respuesta tal, puede ser necesario cambiar la posición de la estimulación y / oelectrodos de registro.
   3. Espere 30 segundos entre estímulos, y repita 10 estímulos en una fila para obtener el promedio de respuesta (Figura 2B - C). Medir la amplitud de la línea de base a pico (Figura 2A). Llevar a cabo la estimulación del nervio frénico durante la fase de ciclo respiratorio del animal cuando el nervio frénico / diafragma no está activado. El procedimiento se puede repetir en el mismo animal para el hemi-diafragma contralateral.
   4. Después de la sesión de grabación CMAP final, perfundir los animales si se llevará a cabo la tinción de UNM. Realizar grabaciones CMAP repetidamente en el mismo animal, aproximadamente una vez cada semana (o al intervalo de elección).
   5. Después de supervivencia grabaciones CMAP, permite animal para recuperar en un cojín caliente de calentamiento de agua circulante, y continuamente vigilar durante la recuperación hasta que despierta y recostada sternally. No devuelva un animal que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente.
   6. Una vez sternally reclinada, controlar al animal cada 12 h durante las primeras 48 horas (una vez al día a partir de entonces). Si el animal parece ser deshidratado (piel flácida, apatía), administrar líquidos (solución de Ringer con lactato; vía subcutánea; 1-2 ml por inyección, con los sitios de girar; 2 veces al día) hasta que el peso post-quirúrgico y la pérdida de fluido se estabiliza. Proporcionar los animales con comida blanda en platos pequeños durante el período postoperatorio agudo si es necesario para alentar a comer si no pueden alcanzar el alimentador de alambre barra de tapa.
   7. Administrar la buprenorfina a una dosis de 0,05 mg / kg antes del final de la cirugía y luego a intervalos de 12 hr para la primera 24 hr (y dependiente de signos de dolor / estrés a partir de entonces) a través de inyección subcutánea (sitio de girar). Si los signos de dolor o angustia se notan a partir de entonces, tratar a los animales con buprenorfina. Los signos indicativos de dolor / malestar incluyen la falta de actividad, vocalizaciones, la falta de comer o beber (deshidratación), pérdida de peso excesiva, guardando, excessive roer o arañar en el sitio de la incisión. Criterios adicionales utilizados en la determinación de dolor y angustia incluyen la falta de respuesta a estímulos externos, vocalización transitoria o no provocado, respiración dificultosa o anormal, descarga naso-ocular persistente de color marrón rojizo, piloerección marcada. Monitorear también la evidencia de la falta de higiene que sugiera animales enfermos. Si los animales se observa todavía estar en peligro después de 72 h de tratamiento (de acuerdo con los criterios de dolor / estrés delinear anteriormente, y después de recibir el protocolo analgésico descrito anteriormente) sacrificar al animal.

2. Diafragma unión neuromuscular (UNM) Análisis

1. La disección de animales:
   1. Administrar el animal de una sobredosis de anestesia inyectable (3 veces dosis utilizada anteriormente: ketamina a 285,0 mg / kg, xilazina a 30,0 mg / kg, acepromazina a 0.225 mg / kg; administrado por vía intraperitoneal). A raíz de una sobredosis, todos los animales deben tener un segundo método de eutanasia (toracotomía) to asegurar la muerte. La muerte debe ser confirmado por la observación de un paro cardíaco y respiratorio y señalando pupilas fijas y dilatadas del animal.
   2. Llevar a cabo una laparotomía con bisturí o tijeras de disección se extiende la escisión del proceso zyphoid caudalmente a lo largo de la línea media. Separe con cuidado de la piel y el tejido conectivo del músculo subyacente utilizando bisturí y pinzas.
   3. Mientras tira para arriba en el proceso zyphoid, utilizar tijeras de disección para eliminar toda diafragma, lo que garantiza que el diafragma permanece unido al hueso circundante. Esto es importante ya que evitará daños en el músculo del diafragma, permitirá la disección éxito de todo el diafragma y ayudará en el músculo de limpieza para la tinción posterior.
      NOTA: En este punto, animal puede ser perfundido si es necesario.
2. Limpieza y tinción de la membrana:
   1. Precisar toda diseccionado el diafragma, superficial superior hacia arriba, a la goma de silicona en un vaso plato de 100 mm de Petri en4% de paraformaldehído (1% hecha en solución salina tamponada con fosfato - PBS) durante 20 min usando un estereomicroscopio. Estirar el diafragma para que sea tensa, y el uso de pasadores de insectos, precisar el tejido circundante para evitar el fijar el propio músculo diafragma (Figura 3).
   2. Limpiar con cuidado el tejido conectivo de sólo la superficie superior del músculo con # 5 pinzas y tijeras pequeñas.
      NOTA: Llevar a cabo todos los pasos posteriores de este protocolo de tinción meciéndose lentamente a temperatura ambiente protegido de la luz a menos que se especifique lo contrario. Asegúrese de que el músculo del diafragma siempre está completamente sumergido en el líquido para evitar la desecación.
   3. Antes de la tinción, preparar todos los reactivos necesarios: 1x PBS, 2% de albúmina de suero bovino (BSA) / PBS, 0,1 M de glicina hecho en 2% de BSA / PBS, 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS 1x, y 0,2% TBP (0,2 % de Triton X100 en 2% BSA / PBS). Asegúrese de comprobar la validez de metanol frío a -20 ° C.
   4. Lavar 3x durante 10 min en PBS 1x.
   5. Incubar en 0,1 M de glicina (hecho en 2% De BSA / PBS) durante 30 min.
   6. Incubar en RBTX solución (conjugado con rodamina α-bungarotoxina) durante 15 min. Solución para RBTX es como sigue: rodamina conjugado bungarotoxina alfa 1: 400 dilución en PBS 1x.
      NOTA: En este protocolo, Rodamina se utiliza, pero cualquier fluoróforo de elección se puede utilizar para la tinción.
   7. Lavar 3x durante 10 min en PBS 1x.
   8. En -20 ° C congelador, incubar con MeOH durante 5 min.
      NOTA: No agregue MeOH antes de colocar el músculo en el congelador, y retire inmediatamente la solución tras el período de incubación.
   9. Lavar 3x durante 10 min en PBS 1x.
   10. Bloquear en 0,2% TBP para 1 hr (0,2% Triton hizo en 2% BSA / PBS).
   11. Incubar con solución de anticuerpo primario (en 0,2% TBP) a 4 ° C durante la noche mientras se balancea. Las diluciones de anticuerpos según se indica: SV2 (1:10) y SMI-312 (1: 1000).
   12. Lave 3x durante 10 minutos con 0,2% PDD.
   13. Incubar con el anticuerpo secundario usando 1: 100 dilución de FGM1 (cabra conjugado con FITC anti-ratón IgG1; hecho en un 0,2% PDD) mientras se balancea durante 1 hora.
       NOTA: Proteger de la luz para el resto del protocolo para la tinción.
   14. Lavar 3x durante 10 min con PBS 1x.
   15. Vuelva a limpiar tejido conectivo circundante en el superior (ver arriba) superficie de músculo antes del montaje y cubreobjetos.
       NOTA: Se recomienda limpiar y luego montar la muestra inmediatamente después de la tinción. Sin embargo, si es necesario, la muestra puede ser cubierto en 1x PBS, envuelto en Parafilm para evitar la evaporación y se almacenó a 4 ° C durante hasta 1 semana, con el cambio de PBS diariamente.
   16. Tras el montaje en portaobjetos de vidrio, con cubreobjetos no Hardset Vectashield. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente para evitar la desecación. Diapositivas de las tiendas situadas plana en carpetas de cartón de diapositivas en -20 ° C para el largo plazo.
3. Análisis y confocal de imágenes:
   1. Analizar cuantitativamente la morfología del manchado y montado hemi-diafragma bajo magnificación 20X y 40X usando un epifluorescencia verticalmicroscopio.
      NOTA: Debido a que el diafragma se tiñe y se analiza en todo el montaje de forma, el músculo es bastante grueso. En consecuencia, la mayor parte de la tinción de fluorescencia es completamente fuera de foco cuando se toma una imagen estática mediante microscopía de fluorescencia confocal no. Por esta razón, lo mejor es llevar a cabo el análisis NMJ en tiempo real en el microscopio, ya que le permite centrarse en constante "arriba" y "abajo" a través del músculo para identificar correctamente la morfología de cada uno de los NMJs individuales. Con este enfoque, se puede seguir fácilmente la trayectoria de los axones motores individuales a medida que se mueven a través del tejido en relación espacial de los grupos de receptores post-sinápticos.
   2. Mediante la medición de la longitud-ventral a dorsal del músculo, el músculo dividir en 3 secciones separadas para el análisis basado en los patrones de inervación topográficos de los niveles específicos de la médula espinal (Figura 4H).
   3. Comenzando en la región ventral del músculo y moving dorsal, analizar todos en NMJs cara situadas en las fibras musculares superficie. No analizar fibras de músculos más profundos que los primeros 3-4 fibras de la superficie como interpretación puede ser difícil debido a la penetración de anticuerpo más pobre (RBTX penetra mucho más profunda en el músculo debido al pequeño tamaño de la toxina en comparación con los anticuerpos más grandes utilizados para etiquetar neuronas).
   4. Identificar cada NMJ como intacta si el axón pre-terminal de la neurona es gruesa de diámetro y todas las regiones de la terminal nerviosa completamente superponen con los receptores de acetilcolina del músculo subyacentes (AChR).
   5. Identifique cada NMJ parcialmente denervado si cualquier región de los AChR musculares subyacentes no está ocupado con sus correspondientes terminales nerviosas.
   6. Identifique cada NMJ tan completamente denervado si los AChR musculares no tienen terminal nerviosa correspondiente (que también es importante contar con otros NMJs con neuronas marcadas en el mismo campo de concentración, por lo que uno puede estar seguro de la falta de terminación nerviosa no se debe simplemente a poor penetración anticuerpo en esa región del músculo).
   7. Identificar cada UNM como se multiplican inervado si hay más de un inervan axón pre-terminal de un individuo NMJ (esto indica que ha habido un cierto grado de denervación y probables intentos de reinervación en este cruce).
   8. Identifique cada NMJ lo más finas inervado si la UNM tiene superposición completa entre el terminal nerviosa y AChR subyacentes, pero tiene un axón pre-terminal delgada (esto también es indicativo de un cierto nivel de denervación y reinervación intentos).
   9. Llevar a cabo análisis para cada una de las 3 regiones identificadas para todas las categorías NMJ anteriores para cada animal. La media de los datos de cada animal con los resultados de otros animales del mismo grupo experimental. Aproximadamente 200-300 uniones en ratas hemi diafragma muscular y 150-200 en el ratón hemi-diafragma deben cuantificarse en al menos 3 (preferiblemente 5-6 o más) animales por grupo experimental.
   10. Obtener imágenes de alta resolución confocal, el usod para su publicación, con un microscopio confocal.
   11. Obtener Z-pilas en 0,3 micras tamaño de paso para 20-40 micras profundidades, y recoger secciones ópticas adicionales por encima y por debajo de cada unión para asegurar que todo el perfil sináptica está incluido.
   12. Utilice software de adquisición de reconstruir imágenes z-series en proyecciones de máxima intensidad.

Resultados

Adultos ratas Sprague-Dawley recibieron o bien laminectomía solamente (control no lesionado) o unilateral hemi-contusión SCI a nivel de la médula espinal C4 ^10-12. A las 5 semanas después de la cirugía, el pico CMAP amplitud registrada de la hemi-diafragma ipsilateral al sitio laminectomía / lesión se redujo significativamente en ratas SCI (Figura 2C) en comparación con el control-laminectomía solamente (Figura 2B). Todos NMJs en el hemi-diafragma estaban completamen...

Discusión

Como la función respiratoria se ve comprometida en tanto SCI traumático y la ELA, el desarrollo de terapias que se dirigen a la respiración y, específicamente, la inervación del diafragma son clínicamente relevantes ^5,6. Con el fin de estudiar exhaustivamente la función respiratoria, se debe utilizar un método de enfoque combinado. CMAPs miden el grado de inervación funcional de la membrana a través de la estimulación del nervio frénico externa, pero el impulso respiratorio bulboespinal no endóge...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	Fisher	T353-500	Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4
1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4	Invitrogen	10010049
2% Bovine serum albumin (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS
0.1M Glycine	Sigma-Aldrich	G-7126	Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin	Invitrogen	T1175	Concentration 1:400
SMI-312	Sternberger Monoclonals	SMI312	Concentration 1:1,000
SV2	Developmental Studies Hybridoma Bank	SV2-Supernatant	Concentration 1:10
FITC goat anti-mouse IgG1	Roche	3117731001	Concentration 1:100
Silicone rubber	Sylgard, Dow Corning	Part # 184	Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs
Vectashield fluorescent mounting medium	Vector laboratories	H-1000	This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.
Small Spring Scissors	Fine Science Tools	15002-08
Dissection forceps	Fine Science Tools	11295-51
Software for CMAP recordings	Scope 3.5.6; ADI
Disk surface electrodes	Natus neurology	019-409000
Subdermal needle electrodes	Natus neurology	019-453100
Conductive gel	Aquasonic	122-73720
Stimulator/recording system for CMAP recordings	ADI Powerlab 8SP stimulator
Amplifier for CMAP recordings	BioAMP