横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価

要約

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

要約

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

概要

筋萎縮性側索硬化症（ALS）は、上位と下位運動ニューロンとその結果としての筋肉麻痺の両方の損失に関連する衰弱運動ニューロン疾患です。診断時には、患者の生存率は、平均でのみ2〜5年¹です。横隔膜運動ニューロン（PhMN）の損失は、ALSの病因の重要なコンポーネントです。患者は、最終的には、振動板のPhMN神経支配、インスピレーション^2,3の主要な筋肉の損失に起因する死亡します。外傷性脊髄損傷（SCI）は、関連する呼吸困難の深刻な問題です。 SCIの約12,000の新しい症例が原因で脊髄への外傷性損傷に毎年⁴起こります。場所、種類及び重症度に対する疾患の不均一性にもかかわらず、SCIの症例の大部分は、多くの場合、衰弱し、永続的な呼吸障害をもたらす頸髄に外傷を伴います。 ALSおよびSCIに加えて、他の中枢神経系（CNS）疾患は、W関連付けることができi番目の横隔膜呼吸不全^5,6。

横隔神経は、同側半ダイアフラムを神経支配し、それは同側頸髄のC3-C5レベルに位置PhMN細胞体から発生する遠心性運動神経です。 PhMN出力は吻側腹呼吸器グループ^（rVRG）7として知られているエリアに脳幹から延髄脊髄の入力を降順によって制御されます。 rVRG-PhMNダイアフラム回路は、吸気呼吸の制御、ならびに他の非換気ダイヤフラムの動作の中心です。この回路に影響を与える様々な外傷と神経変性疾患は、呼吸機能および患者の生活の質の顕著な低下につながることができます。ダイヤフラム神経筋接合部（NMJ）でrVRG、PhMN生存、横隔神経の整合性と適切な神経支配からPhMNsに入力を降順通常の絞り機能に必要なすべてのです。これは、技術を使用することが重要であること定量的ALS、SCIおよび他のCNS ​​疾患のげっ歯類モデルにおいてインビボでこの回路を評価することができます。

このプロトコルでは、目標は、電気生理学的および形態学的レベルの両方で振動板のPhMN神経支配を評価するための実験的なツールを記述することです。複合筋活動電位（CMapを）指定された運動神経の全ての遠心性運動ニューロンの軸索を刺激した後、ターゲットの筋線維の脱分極誘発さの応答を分析することによって記録されています。この技術は、PhMNs ⁸半横隔膜の神経支配の機能を定量化するために麻酔したラットおよびマウスにおいてインビボで使用することができます。原因CMapを、すべての同時記録（あるいは、少なくとも、多くの/ほとんどの）全体の半横隔膜の筋線維を表すという事実のために、それはまた、疾患を追跡するために、絞りNMJで、個々の運動軸索と筋線維の表現型を調べるために有用です - このような部分やcompleなどと治療関連の形態学的変化TE除神経、再生発芽および再支配。これは筋肉⁹を通して個々のNMJの詳細な形態学的評価に続いて、振動板の全体マウント免疫組織化学（IHC）を介して達成することができます。 CMapをを組み合わせ、NMJ分析は、定量的にCNSおよびPNS疾患の齧歯類モデルで横隔膜神経支配を研究するための強力なアプローチを提供します。

プロトコル

実験手順は、トーマス·ジェファーソン大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、欧州共同体理事会指令（63分の2010 / EU、609分の86 / EECおよび87から848 / EEC）に準拠して実施し、のためのNIHガイドました脳科学研究における動物の使用に関する神経科学のポリシーの管理と使用実験動物の、および社会。

1.複合筋活動電位（CMapを）

1. 動物の準備：
   1. 効果にまたは注射（ケタミン、キシラジン、アセプロマジン）によって供給される1〜2％で吸入（イソフルラン）を用いてラットを麻酔。 95.0 mgのケタミン/ kgのキシラジンの10.0ミリグラム/ kgのアセプロマジンの0.075ミリグラム/ kgで次のように注射用麻酔の投与量です。
      注：我々は、正常に吸入および注射麻酔薬の両方を使用し、このCMAP記録プロトコルを行う際問わないで、近づきます。
   2. 動物は、適切なAで維持されなければなりません手術前nesthetic深さは、手術の結論を介して、開始され、術後のブプレノルフィンまで有効になっています。引っ込め応答が誘発されていないことを決定するために、簡単なつま先のピンチによって適切な麻酔を確認してください。さらに、綿棒で角膜反射をテストします。外科的手順では、麻酔深度が軽すぎるとなっていることを示唆している、心拍数や呼吸数が増加していないことを決定します。
   3. 麻酔下ながら乾燥を防止するために、動物の目に獣医軟膏を適用します。
   4. 外科医は手術を開始する前に、消毒剤（クロルヘキシジンスクラブ）で彼女/彼の手を洗う必要があります。外科医は、滅菌手袋、フェイスマスク、ガウンまたはクリーン白衣を着用してください。すべての機器を洗浄し、手術前にオートクレーブ処理されるべきです。滅菌が完了したことを確認するために、機器のレベルでオートクレーブする前に、機器のキット内の滅菌インジケータストリップを追加します。外科医べきストリップ上の行全体が手術を開始する前に、黒であることを確認します。同様に、オートクレーブテープを示すとボックスの外側をテープで固定します。手術は、同じ日に、いくつかの動物で行われる場合には、手術の間に器具を清掃し、ガラスビーズ滅菌器で滅菌します。必要に応じて、適切な時間に滅菌器具のハンドルを置く滅菌止血剤で楽器を除去、無菌フィールド内で冷却し、その後の官能性末端を配置することによってガラスビーズ滅菌器内器具の両端を滅菌適当な時間のためのガラスビーズ滅菌器への器具。
   5. 動物を麻酔した後、ダウン背面に外科的ボード上となるようにテープを上に向け、腹部の場所は、外科用ボードに、動物の前肢を保護するために使用することができます。
   6. 頭蓋底で始まる腹面の尾側を剃るし、正中線の両側腹部周辺はSHであることを確認AVED半ダイアフラムが記録されているに応じて。皮膚の剃毛表面にポビドンヨードを適用します。
2. CMAPの録音のための準備：
   1. 尾への動物の準備、場所接地電極を皮下に続いて（ 図1）。
   2. 反対下腹部に参照電極を皮下に配置します。
   3. 自己接着面ストリップまたはディスク記録電極（表面帯状電極の寸法：0.5×3センチ）の上に導電性ゲルを配置し、その後、一方的な肋骨縁に沿って横方向に表面電極を配置します。
   4. 経皮0.5センチメートル離れて気管に横方向および鎖骨に優れた刺激電極を配置します。皮膚を通して約1.0センチメートル深い電極を挿入します。その場所は、その後の刺激と一緒に移動しないように手で電極を固定します。
      注：付着点の部位の皮膚に対して90°の角度刺激電極N。
3. 複合筋活動電位（CMAP）録音：
   1. コンピュータ支援データ分析に続いて刺激/アンプを使用して電気生理学的記録を入手します。
   2. シングルプル刺激の刺激パラメータは、0.5ミリ秒、1.0 Hzの超最大パルスでなければなりません。刺激の振幅はV 6.0の間と8.0（ 図2A）である必要があります。
      注：この実験の中で、動物間で同じ振幅で刺激強度を使用しています。目的は、刺激の最小の振幅を用いて、応答振幅を最大にすることです。それは刺激の時に発生する初期応答が、刺激アーティファクトであることに注意することが重要です。また、ケアは、その後急速CMAP応答が続いて刺激アーティファクト、後に安定/フラットベースラインが先行するCMAPの応答を得るために注意すべきです。そのような応答を得るためには、刺激の位置を変更する必要があるかもしれない、および/または記録電極。
   3. 刺激の間に30秒待ってから、平均応答（ 図2B - C）を得るために一列に10刺激を繰り返します。ベースラインからピークに振幅を測定（ 図2A）。横隔神経/ダイアフラムが活性化されていないときに、動物の呼吸サイクルのフェーズ中に横隔神経刺激を行っています。手順は、反対側の半振動板に同じ動物に繰り返すことができます。
   4. NMJ染色が行われる場合、最終的なCMAP記録セッションの後、動物を灌流。毎週（または任意の間隔で）約一回、同じ動物で繰り返しCMAPの録音を行っています。
   5. 生存CMAPの記録に続いて、動物が覚醒し、sternallyリカンベントまで回復中に循環温水暖房パッドに回復し、継続的に監視することができます。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。
   6. 一度sternallyリカンベント、（その後一日一回）最初の48時間、動物ごとに12時間を監視します。手術後の体重および流体損失安定するまで動物は（弛緩性皮膚、だる）を脱水していると思われる場合は、流体（;皮下;注射1〜2 mlのサイトは回転で1日2回、乳酸リンゲル液）を管理。彼らはワイヤーバー蓋フィーダに到達できない場合は食べることを奨励するために、必要に応じて急性術後期間中に小さな皿で軟化した食品と動物を提供します。
   7. 手術の終了前には0.05mg / kgの用量でブプレノルフィンを投与し、その後12時間間隔で、最初の24時間（その後痛み/ストレスの兆候に依存）皮下注射を介して、（サイトが回転します）。痛みや苦痛の徴候は​​、その後に気づいている場合は、ブプレノルフィンで動物を扱います。痛み/苦痛を示す兆候は、活性の欠如、発声、（脱水）を食べたり飲ん不足、過度の体重減少、ガード、EXCを含みます能格かじるまたは切開部位でスクラッチ。痛みや苦痛を決定する際に使用される追加の基準は、外来刺激に無反応、一時的またはいわれのない発声、こじつけまたは異常呼吸、永続的な赤褐色鼻な眼放電、マークされた立毛を含みます。また、病気の動物を示唆する不衛生の証拠を監視します。動物がまだ処理の72時間後に苦痛であることが観察された場合、動物を安楽死させる（上記概説疼痛/ストレス条件に応じて、受信した後、鎮痛プロトコルは、上記）。

2.ダイアフラム神経筋接合部（NMJ）の分析

1. 動物の解剖：
   1. 動物に注射用麻酔の過剰摂取の管理（：;腹腔内投与0.225ミリグラム/ kgで30.0ミリグラム/ kgのアセプロマジンで285.0ミリグラム/ kgのキシラジンでケタミン3回は、上記使用した用量）。過量投与に続いて、すべての動物は安楽死の第二の方法（開胸）Tを有していなければなりませんOの死を確認してください。死は、心臓や呼吸停止を観察することによって、動物の固定および拡張生徒に注目することによって確認する必要があります。
   2. メスや解剖ハサミが尾側正中線に沿ってzyphoidプロセスから切除を拡張して開腹を行っています。慎重にメスや鉗子を使用して、基礎となる筋肉から皮膚や結合組織を分離します。
   3. zyphoidプロセスを引き上げながら、振動板が骨の周囲に付着したままであることを確認して、全体の振動板を除去するために、解剖ハサミを使用しています。それはダイヤフラム全体の成功解剖を可能にする、横隔膜筋への損傷を防ぐことができますし、その後の染色のために筋肉をクリーニングに役立つように、これは重要です。
      注：必要であれば、この時点で、動物を灌流することができます。
2. 振動板のクリーニングと染色：
   1. 全体解剖ダイアフラムを突き止める、優れた表面がガラス100ミリメートルペトリ皿中にシリコーンゴムに、上向きに実体顕微鏡を用いて20分間 - （PBS、1％リン酸緩衝生理食塩水で行った）、4％パラホルムアルデヒド。それはピンと張ったようにダイヤフラムを伸ばし、昆虫ピンを使用して、横隔膜筋自体（ 図3）をピン止めを避けるために、周囲の組織を突き止めます。
   2. 慎重に＃5鉗子と小さなはさみで筋肉の唯一の優れた表面から結合組織をきれいに。
      注：特に指定のない限り、この染色プロトコルは、ゆっくりと光から覆われ、室温でロッキングのすべての後続のステップを実行してください。横隔膜筋が常に完全に乾燥を避けるために、液体中に浸漬されていることを確認します。
   3. 染色の前に、全ての必要な試薬調製：1×PBS、2％ウシ血清アルブミン（BSA）/ PBSを、0.1 M 1×PBS中の2％BSA / PBS、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で行われたグリシン、および0.2％TBP（0.2 2％BSA / PBS）中の％トリトンX100。 -20℃でメタノール - クールを事前にしてください。
   4. 1×PBS中で10分間の洗浄3倍。
   5. 2で行われた（0.1 Mグリシンでインキュベート30分間％のBSA / PBS）。
   6. 15分間RBTX（ローダミン結合αブンガロトキシン）溶液中でインキュベートします。ローダミン結合アルファブンガロトキシン1：1×PBSで400希釈を次のようにRBTXのためのソリューションです。
      注：このプロトコルでは、ローダミンを用いているが、選択した任意のフルオロフォアは、染色のために使用することができます。
   7. 1×PBS中で10分間の洗浄3倍。
   8. -20℃の冷凍庫では、5分間MeOHでインキュベートします。
      注：冷凍庫に筋肉を置く前にメタノールを追加し、直ちにインキュベーション期間の後溶液を除去しないでください。
   9. 1×PBS中で10分間の洗浄3倍。
   10. 1時間0.2％のTBPのブロック（0.2％トリトンを2％BSA / PBS製）。
   11. ロッキングしながら4℃で一晩、一次抗体溶液（0.2％でTBP）とインキュベートします。抗体の希釈液を次のようにSV2（1:10）とSMI-312（1：1,000）。
   12. 0.2％TBPで10分間3回洗浄します。
   13. FGM1（FITC結合ヤギ抗マウスIgGの1：100希釈を用いた二次抗体とインキュベートします1; 1時間揺動しながら、0.2％TBP）で行われました。
       注：染色のためのプロトコルの残りの光から保護します。
   14. 1×PBSで10分間洗浄3倍。
   15. 前取り付け、カバースリップに筋肉の優れた（上記参照）の表面上に再クリーン周囲の結合組織。
       注：それはきれいにした後、染色した後、すぐにサンプルをマウントすることをお勧めします。必要な場合は、サンプルは、1×PBSでカバー蒸発を防ぐためにパラフィルムで包み、毎日PBSを変えて、1週間まで4℃で保存してもよいです。
   16. スライドガラス上にマウントされると、非hardsetベクタシールドでカバースリップ。乾燥を防ぐために、明確なマニキュアでカバースリップの端をシールします。店舗スライドは長期的に、-20℃で段ボールスライドフォルダに平らに。
3. 分析と共焦点イメージング：
   1. 定量的染色の形態を分析し、直立エピ蛍光を用いて、20Xと40X倍率下半ダイアフラムマウント顕微鏡。
      注：ダイヤフラムは全体のマウントの方法で染色し、分析されているので、筋肉が非常に厚いです。静止画像は、非共焦点蛍光顕微鏡を用いて撮影されたときその結果、蛍光染色の大部分は、完全に焦点から外れています。このような理由から、これはあなたが常に適切に個々のNMJのそれぞれの形態を識別するために「上」と「下」の筋肉を介して集中することができますように顕微鏡でリアルタイムでNMJ分析を実施することをお勧めします。彼らは、シナプス後受容体クラスターへの空間的関係にある組織を通って移動すると、このアプローチを使用して、人は簡単に個々の運動軸索の軌跡をたどることができます。
   2. 筋肉の腹対背の長さを測定することにより、特定の脊髄レベル（ 図4H）からの地形神経支配のパターンに基づいて、分析のための3つの別々のセクションに筋肉を分割。
   3. 筋肉やMOVの腹側領域で始まります背る、表面筋線維上にある顔のNMJアンすべてを分析します。 RBTXが原因で標識するために使用され、より大きな抗体に比べて、毒素の小さなサイズに筋肉へのより深い浸透（これは貧しい抗体の浸透に解釈が困難な場合があるように、より深い表面から第3-4繊維よりも筋肉繊維を分析しないでくださいニューロン）。
   4. ニューロンの事前端子軸索の直径が太く、神経末端の全ての領域が完全に下にある筋肉アセチルコリン受容体（AChRs）と重複している場合、完全なように、各NMJを特定します。
   5. 基礎となる筋肉AChRsの任意の領域が神経終末を対応する占有されていない場合は、部分的除神経のように各NMJを特定します。
   6. 筋肉AChRsには、対応する神経終末を持っていない場合は、1つは、神経末端の欠如はのために単純ではないことを確認することができますように（それは、焦点の同じフィールドで標識されたニューロンと他のNMJを持つことも重要である完全に除神経として各NMJを特定うんちR筋肉のその領域における抗体の浸透）。
   7. 乗算神経支配のように複数のプレターミナル軸索神経支配個々NMJがある場合（これは、この接合部での神経再生の除神経、おそらく試みのいくつかのレベルがあったことを示している）各NMJを特定します。
   8. NMJは、神経終末とその下AChRs間の完全なオーバーラップを持っていますが、（これはまた、神経再生における除神経と試みのいくつかのレベルの指標である）シンプレ端子軸索を持っているかのように薄く神経支配各NMJを特定します。
   9. 各動物のための上記のNMJカテゴリーのすべてのための3識別された領域のそれぞれについて分析を行います。同じ実験群の他の動物からの結果と、各動物からのデータを平均します。マウス半ダイアフラムにおけるラットヘミダイヤフラム筋肉および150〜200に約200〜300の接合部は、実験群当たり少なくとも3（好ましくは5〜6以上）の動物で定量化する必要があります。
   10. 高解像度の共焦点画像を入手し、使用共焦点顕微鏡でパブリケーションのD、。
   11. 20〜40ミクロ​​ンの深さ0.3μmのステップサイズでZ-スタックを取得し、全体のシナプスプロファイルが含まれていることを確認するために、各接合部の上下に追加の光学切片を収集します。
   12. 最大強度の予測にZシリーズの画像を再構成するために収集ソフトウェアを使用してください。

結果

大人のSprague-Dawleyラットは、C4脊髄レベル^10〜12のいずれかで椎弓切除のみ（非損傷対照）または一方的なヘミ挫傷SCIを受けました。 5週間後の手術では、椎弓切除術/損傷部位に半絞り同側から記録ピークCMAP振幅が大きく、椎弓切除のみの制御（ 図2B）と比較して、SCIラット（ 図2C）に減少しました。半ダイアフラムのすべてのNMJは対照非罹患野生型ラット（ ...

ディスカッション

呼吸機能が呼吸、特に絞り神経支配を標的治療法の開発、外傷性SCIとALSの両方に妥協されるように、臨床的に^5,6に関連しています。総合呼吸機能を研究するために、組み合わされたアプローチの方法が使用されるべきです。 CMapを外部の横隔神経刺激を介して振動板の機能神経支配の程度を測定するが、延髄脊髄の呼吸ドライブ⁸内因性ではありません。また、これらの記録は...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	Fisher	T353-500	Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4
1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4	Invitrogen	10010049
2% Bovine serum albumin (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS
0.1M Glycine	Sigma-Aldrich	G-7126	Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin	Invitrogen	T1175	Concentration 1:400
SMI-312	Sternberger Monoclonals	SMI312	Concentration 1:1,000
SV2	Developmental Studies Hybridoma Bank	SV2-Supernatant	Concentration 1:10
FITC goat anti-mouse IgG1	Roche	3117731001	Concentration 1:100
Silicone rubber	Sylgard, Dow Corning	Part # 184	Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs
Vectashield fluorescent mounting medium	Vector laboratories	H-1000	This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.
Small Spring Scissors	Fine Science Tools	15002-08
Dissection forceps	Fine Science Tools	11295-51
Software for CMAP recordings	Scope 3.5.6; ADI
Disk surface electrodes	Natus neurology	019-409000
Subdermal needle electrodes	Natus neurology	019-453100
Conductive gel	Aquasonic	122-73720
Stimulator/recording system for CMAP recordings	ADI Powerlab 8SP stimulator
Amplifier for CMAP recordings	BioAMP