Funcional e morfológica de Avaliação de Diafragma Innervation por frênico Neurônios Motores

Resumo

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Resumo

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Introdução

Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) é uma doença debilitante neurónio motor associado com a perda de ambos os neurónios motores superiores e inferiores e consequente paralisia muscular. Após o diagnóstico, a sobrevida do paciente é, em média, apenas 2-5 anos ^1. Frênico perda do neurônio motor (PhMN) é um componente crítico da patogénese da ALS. Os pacientes morrem em última análise, devido à perda de PhMN inervação do diafragma, o músculo primário de inspiração ^2,3. Traumática lesão medular (LM) é também um problema grave com dificuldades respiratórias associadas. Aproximadamente 12.000 novos casos de SCI ocorrem cada ano ⁴ devido a danos traumáticos à medula espinal. Apesar da heterogeneidade da doença no que diz respeito à localização, tipo e gravidade, a maioria dos casos de SCI envolver trauma da medula espinhal cervical, o que muitas vezes resulta em compromisso respiratório debilitante e persistente. Além de ALS e SCI, outra doenças do sistema nervoso central (SNC) pode ser associado wdisfunção respiratória diafragmática om ^5,6.

O nervo frênico é um nervo motor eferente que inerva o hemi-diafragma ipsilateral e que se origina a partir de corpos celulares PhMN localizados nos níveis de C3-C5 do ipsilateral medula espinhal cervical. PhMN saída é controlado pelo descendente de entrada bulbospinal do tronco cerebral em uma área conhecida como o grupo rostral ventral respiratória (rVRG) ^7. O circuito rVRG-PhMN-diafragma é fundamental para o controle da respiração inspiratória, assim como outros comportamentos de diafragma não-ventilatórios. Vários ferimentos traumáticos e doenças neurodegenerativas que afectam este circuito pode levar a uma profunda diminuição da função respiratória e qualidade de vida do paciente. Descendente de entrada para PhMNs da sobrevivência rVRG, PhMN, a integridade do nervo frênico e inervação adequada na junção neuromuscular do diafragma (MNJ) são todos necessários para a função diafragma normal. Por conseguinte, é importante que empregam técnicaspode avaliar quantitativamente este circuito in vivo em modelos de roedores de ALS, SCI e outras doenças do SNC.

Com este protocolo, o objetivo é descrever ferramentas experimentais para avaliar PhMN inervação do diafragma tanto no eletrofisiológico e níveis morfológicos. Potenciais de ação muscular composto (MCs) são registadas ao estimular todos os axônios do neurônio motor eferente de um determinado nervo motor e, em seguida, analisar a resposta despolarização elicitada dos myofibers alvo. Esta técnica pode ser utilizado in vivo em ratos anestesiados e ratos para quantificar inervação funcional da hemi-diafragma por PhMNs ^8. Devido ao facto de CMAPs representam gravação simultânea de todos (ou pelo menos a maioria) de muitos / miofibras de todo o hemi-diafragma, que é também útil para analisar os fenótipos de axónios motores individuais e miofibras no MNJ diafragma, a fim de controlar a doença - e terapia relevantes alterações morfológicas, tais como parcial e complete desnervação, surgimento de regeneração e reinervação. Isto pode ser conseguido através de toda a montagem imuno-histoquímica (IHQ) do diafragma, seguido por avaliação morfológica detalhada de NMJs individuais em todo o músculo ^9. Combinando CMAPs e análise MNJ fornece uma abordagem poderosa para estudar quantitativamente inervação do diafragma em modelos de roedores de doença do SNC e SNP.

Protocolo

Procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê de Thomas Jefferson University cuidados com os animais e uso institucional e conduzida em conformidade com a directiva Comunidades Europeias Conselho (2010/63 / UE, 86/609 / CEE e 87-848 / CEE), o Guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório, ea Sociedade de Políticas de Neurociência do Uso de Animais em Neuroscience Research.

1. potenciais de ação composto do músculo (MCs)

1. Preparando o animal:
   1. Anestesiar o rato usando um inalante (isoflurano) em 1-2% entregue ao efeito ou por injecção (cetamina, xilazina, acepromazina). Dosagem de anestesia injectável é a seguinte: 95,0 mg / kg de cetamina, 10,0 mg / kg de xilazina, 0,075 mg / kg de acepromazina.
      NOTA: Nós usamos com sucesso tanto inalantes e anestésico injetável abordagens durante a realização deste protocolo gravação CMAP, sem preferência.
   2. O animal deve ser mantida a um a apropriadoprofundidade nesthetic antes da cirurgia é iniciado, através da celebração de cirurgia, e até buprenorfina pós-operatório se tornar efectiva. Confirme anestesia adequada por breve pitada dedo do pé para determinar que uma resposta de retirada não é provocada. Além disso, teste do reflexo corneal com um cotonete. Durante todo o procedimento cirúrgico, determinar que a frequência cardíaca e respiratória não aumentaram, o que sugere que a profundidade da anestesia tornou-se muito clara.
   3. Aplique uma pomada veterinário sobre os olhos do animal para evitar a secura sob anestesia.
   4. O cirurgião deve lavar seu / suas mãos com um desinfetante (clorexidina esfoliação) antes de iniciar a cirurgia. O cirurgião deve usar luvas estéreis, máscara e bata ou jaleco limpo. Todos os instrumentos devem ser lavadas e autoclavada antes da cirurgia. Adicionar uma tira indicadora de esterilização dentro do kit instrumento antes da autoclavagem ao nível dos instrumentos para verificar que a esterilização é completa. O cirurgião deveverificar se toda a linha na faixa é preto antes de iniciar a cirurgia. Tape o exterior da caixa com fita de autoclave, indicando assim. Se a cirurgia é para ser executada em vários animais no mesmo dia, limpe os instrumentos entre cirurgias e esterilizar no esterilizador talão de vidro. Se necessário, esterilizar ambas as extremidades do instrumento no esterilizador esferas de vidro, colocando o punho do instrumento no esterilizador durante o tempo adequado, a remoção do instrumento com uma pinça hemostática estéril, resfriando-o em um campo estéril e em seguida, colocando a extremidade funcional de o instrumento para o esterilizador talão de vidro para o período de tempo apropriado.
   5. Uma vez que animal é anestesiado, lugar a bordo cirúrgico com a superfície dorsal para baixo e abdômen virado para cima para que a fita pode ser usada para proteger os membros anteriores do animal a bordo cirúrgico.
   6. Raspar caudalmente superfície ventral começando na base do crânio, e assegurar que a área em torno abdómen de cada lado da linha média é shaved dependendo do hemi-diafragma está a ser gravada. Aplicar povidona-iodo para a superfície da pele raspada.
2. Preparação para gravações CMAP:
   1. Após a preparação animal, lugar eletrodo terra subcutaneamente em cauda (Figura 1).
   2. Coloque o eletrodo de referência por via subcutânea na região abdominal inferior contralateral.
   3. Coloque gel condutor na superfície tira auto-adesiva ou eletrodo de gravação de disco (dimensões do eletrodo tira superfície: 0,5 x 3 cm), e em seguida, coloque eletrodo de superfície transversalmente ao longo da margem costal unilateral.
   4. Coloque eléctrodos de estimulação transcutânea 0,5 centímetros além laterais a traqueia e superiores à clavícula. Insira os eletrodos aproximadamente 1,0 cm de profundidade através da pele. Obtenha os eletrodos por mão de modo que sua localização não se move com estímulos subsequentes.
      NOTA: Ângulo de eléctrodos de estimulação de 90 ° em relação à pele no local de insertion.
3. Potenciais de ação muscular composto (CMAP) gravações:
   1. Obter registos electrofisiolicos utilizando um estimulador / amplificador seguido de análise de dados assistida por computador.
   2. Os parâmetros de estímulo de estimulação única tração deve ser de 0,5 ms, leguminosas supramaximais 1,0 Hz. A amplitude do estímulo deve situar-se entre 6,0 e 8,0 V (Figura 2A).
      NOTA: Dentro de um experimento, use uma intensidade do estímulo com a mesma amplitude através animais. O objectivo é o de maximizar a amplitude de resposta, utilizando a amplitude mínima de estimulação. É importante notar que a resposta inicial que ocorre no momento da estimulação é um artefacto de estimulação. Além disso, deve ser tomado cuidado para se obter uma resposta CMAP que é precedido por uma linha de base estável / plana depois de o artefacto de estimulação, que é seguida pela resposta rápida CMAP. A fim de se obter uma tal resposta, pode ser necessário para reposicionar a estimulação e / oueletrodos de registro.
   3. Espere 30 segundos entre os estímulos, e repita 10 estimulações em uma fila para obter a resposta média (Figura 2B - C). Medir a amplitude de linha de base para o pico (Figura 2A). Realizar a estimulação do nervo frênico durante a fase de ciclo respiratório do animal quando o nervo frênico / diafragma não está ativado. O procedimento pode ser repetido no mesmo animal para o hemi-diafragma contralateral.
   4. Após a sessão de gravação CMAP final, perfundir o animal se a coloração MNJ será conduzida. Realizar gravações CMAP repetidamente no mesmo animal, aproximadamente uma vez por semana (ou no intervalo de escolha).
   5. Na sequência de sobrevivência gravações CMAP, permitir animal possa recuperar em uma almofada de aquecimento de água quente circulante e monitorar continuamente, durante a recuperação, até reclinada acordado e sternally. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
   6. Uma vez sternally reclinada, monitorar o animal a cada 12 horas para a primeira 48 horas (diariamente a partir daí). Se o animal parece ser desidratado (pele flácida, apatia), administrar fluidos (solução de Ringer com lactato; subcutaneamente; 1-2 ml por injeção, com os sites rodado, 2 vezes por dia) até peso pós-cirúrgico e perda de líquido se estabilize. Fornecer animais com comida amolecida em pequenos pratos durante o período pós-operatório agudo, se necessário, para incentivar comer se eles não podem alcançar o alimentador bar tampa fio.
   7. Administrar a buprenorfina na dose de 0,05 mg / kg antes do final da cirurgia e, em seguida, em intervalos de 12 h durante as primeiras 24 horas (dependente e sinais de dor / estresse posteriormente) por injecção subcutânea (local rodado). Se os sinais de dor ou angústia são notados em seguida, tratar os animais com buprenorfina. Sinais indicativos de dor / sofrimento incluem a falta de atividade, vocalizações, a falta de comer ou beber (desidratação), perda excessiva de peso, guardando, excessive roer ou coçar no local da incisão. Os critérios adicionais utilizados na determinação dor e angústia incluem falta de resposta aos estímulos externos, vocalização transitória ou não provocado, respiração difícil ou anormal, secreção naso-ocular castanho-avermelhado persistente, piloereção marcado. Também acompanhar evidência de falta de higiene que sugeriria animais doentes. Se um animal continua a ser observado em perigo após 72 horas de tratamento (de acordo com os critérios de dor / pressões acima apresentadas, e depois de ter recebido o protocolo descrito acima analgésico) sacrificar o animal.

2. Diafragma Junção Neuromuscular (MNJ) Análise

1. Dissecação de animais:
   1. Administrar ao animal uma overdose de anestesia injectável (3 vezes a dose usada acima: cetamina em 285,0 mg / kg, xilazina, a 30,0 mg / kg, acepromazina em 0,225 mg / kg; administrado por via intraperitoneal). Após sobredosagem, todos os animais devem ter um segundo método de eutanásia (toracotomia) to garantir a morte. A morte deveria ser confirmada pela observação de parada cardíaca e respiratória e observando pupilas fixas e dilatadas do animal.
   2. Realizar uma laparotomia com bisturi ou tesoura de dissecção estendendo-se a excisão do processo zyphoid caudalmente ao longo da linha média. Separe cuidadosamente pele e do tecido conjuntivo subjacente do músculo usando bisturi e pinças.
   3. Enquanto puxa-se sobre o processo de zyphoid, usar tesouras de dissecação para remover o diafragma inteiro, garantindo que o diafragma permanece ligado ao osso circundante. Isto é importante uma vez que irá evitar danos no músculo do diafragma, irá permitir a dissecção de sucesso de todo o diafragma e vai ajudar na limpeza do músculo para a coloração subsequente.
      NOTA: neste momento, animal pode ser perfundido, se necessário.
2. Limpeza e coloração do diafragma:
   1. Fixar para baixo todo dissecado o diafragma, de superfície superior voltada para cima, a borracha de silicone em um vidro de 100 milímetros placa de Petri em4% de paraformaldeído (1% feita em tampão fosfato salino - PBS) durante 20 min, utilizando um estereomicroscópio. Esticar o diafragma para torná-lo tenso, e utilizando os pinos de insectos, o pino para baixo o tecido circundante para evitar a fixação do próprio músculo do diafragma (Figura 3).
   2. Limpar cuidadosamente o tecido conjuntivo a partir de apenas a superfície superior do músculo com # 5 fórceps e uma tesoura pequena.
      NOTA: Realizar todas as etapas subseqüentes deste protocolo de coloração de balanço lentamente à temperatura ambiente coberto de luz, a menos que especificado em contrário. Certifique-se de que o músculo diafragma é sempre completamente submerso no líquido para evitar ressecamento.
   3. Antes da coloração, preparar todos os reagentes necessários: 1x PBS, 2% de albumina de soro bovino (BSA) / PBS, 0,1 M de glicina feitas em 2% de BSA / PBS, 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS 1x, e 0,2% TBP (0,2 % de Triton X100 em 2% de BSA / PBS). Certifique-se de pré-cool metanol a -20 ° C.
   4. Lavar 3x durante 10 minutos em PBS 1x.
   5. Incubar em 0,1 M de glicina (apresentado em 2% De BSA / PBS) durante 30 min.
   6. Incubar em solução RBTX (conjugada com rodamina α-bungarotoxina) durante 15 min. Solução para RBTX é como se segue: conjugada com rodamina bungarotoxina alfa 1: 400 de diluição em PBS 1x.
      NOTA: Neste protocolo, rodamina é usado, mas qualquer fluoróforo de escolha pode ser utilizado para a coloração.
   7. Lavar 3x durante 10 minutos em PBS 1x.
   8. Em -20 ° C congelador, incubar com MeOH durante 5 min.
      NOTA: Não adicionar MeOH antes de colocar muscular no congelador e retire imediatamente solução após o período de incubação.
   9. Lavar 3x durante 10 minutos em PBS 1x.
   10. Bloco em 0,2% TBP durante 1 h (0,2% de Triton feitas em 2% de BSA / PBS).
   11. Incubar com solução de anticorpo primário (em 0,2% TBP) a 4 ° C durante a noite enquanto a sacudir. As diluições de anticorpos como se segue: SV2 (1:10) e SMI-312 (1: 1.000).
   12. Lavar 3x durante 10 min com 0,2% TBP.
   13. Incubar com anticorpo secundário usando diluição 1: 100 de anti-IgG de ratinho FGM1 (de cabra conjugado com FITC1; feita em 0,2% TBP) de balanço enquanto durante 1 h.
       NOTA: Ao abrigo da luz para o resto do protocolo para a coloração.
   14. Lavar 3x durante 10 min com PBS 1x.
   15. Re-limpo circundante tecido conjuntivo no superiores (ver acima) superfície de músculo antes da montagem e montagem de lâminas.
       NOTA: Recomenda-se limpar e, em seguida, montar amostra imediatamente após a coloração. No entanto, se necessário, a amostra pode ser coberta em 1x PBS, envoltos em parafilme para evitar a evaporação e armazenada a 4 ° C durante até 1 semana, com a mudança de PBS diariamente.
   16. Após a montagem em lâmina de vidro, lamela com não-hardset Vectashield. Selar bordas da lamela com unha polonês claro para evitar a secagem para fora. Armazenar os slides que encontram-se apartamento em pastas de slides de papelão em -20 ° C para o longo prazo.
3. Análise e confocal de imagem:
   1. Quantitativamente analisar a morfologia do manchada e montada hemi-diafragma sob 20X e 40X de ampliação usando uma epifluorescência verticalmicroscópio.
      Observação: Como o diafragma é manchado e analisados ​​de forma inteira de montagem, o músculo é muito grosso. Consequentemente, a maior parte da coloração por fluorescência é completamente fora de foco, quando uma imagem estática é feita utilizando microscopia confocal de fluorescência não. Por esta razão, é melhor para realizar a análise JNM em tempo real sobre o microscópio, pois isso permite focar constantemente "para cima" e "para baixo" através do músculo para identificar correctamente a morfologia de cada um dos NMJs individuais. Usando essa abordagem, pode-se facilmente seguir a trajetória de axônios motores individuais como eles se movem através do tecido em relação espacial com os clusters de receptores pós-sinápticos.
   2. Medindo o comprimento ventral-a-dorsal do músculo, dividir o músculo em três secções separadas para análise com base em padrões de inervação topográficos de níveis medulares específicas (Figura 4H).
   3. Começando na região ventral do músculo e moving dorsal, analisar todos en NMJs cara localizados em fibras musculares superfície. Não analise fibras musculares mais profundo do que os primeiros 3-4 fibras da superfície como a interpretação pode ser difícil devido à pobre penetração anticorpo (RBTX penetra muito mais profundo no músculo, devido ao pequeno tamanho da toxina em comparação com os anticorpos maiores usadas para rotular neurônios).
   4. Identificar cada JNM como se intacta do axónio pré-terminal do neurónio é espessa em diâmetro e todas as regiões do terminal do nervo completamente sobrepõem com os receptores de acetilcolina muscular subjacente (AChRs).
   5. Identificar cada MNJ como parcialmente desnervado se qualquer região dos AChRs musculares subjacentes está desocupada com correspondente terminal nervoso.
   6. Identificar cada MNJ como completamente desnervado se os AChRs musculares não têm terminação nervosa correspondente (também é importante ter outros NMJs com neurónios marcados no mesmo campo de foco, para que se possa ter certeza da falta de terminal do nervo não é simplesmente devido à cocôr penetração anticorpo em que a região do músculo).
   7. Identificar cada JNM como multiplicar inervado se houver mais do que uma pré-terminal axonal inervação um JNM indivíduo (isto indica que houve algum nível de desnervação e tentativas susceptíveis de reinnervation nesta junção).
   8. Identificar cada MNJ tão fina inervados se o MNJ tem sobreposição completa entre o terminal do nervo e AChRs subjacentes, mas tem um axônio pré-terminal thin (isso também é indicativo de algum nível de denervação e tentativas de reinervação).
   9. Realizar uma análise para cada uma das três regiões identificadas para todas as categorias acima JNM para cada animal. Calcular a média dos dados de cada animal, com os resultados de outros animais do mesmo grupo experimental. Aproximadamente 200-300 junções em ratos hemi-diafragma muscular e 150-200 no rato hemi-diafragma deve ser quantificada em pelo menos 3 (de preferência 5-6 ou mais) animais por grupo experimental.
   10. Obter imagens de alta resolução confocal, usod para publicação, com um microscópio confocal.
   11. Obter ácido Z-pilhas no tamanho 0,3 uM passo de 20-40 uM profundidades, e recolher secções ópticas adicionais acima e abaixo de cada junção para assegurar que todo o perfil sináptica está incluído.
   12. Use um software de aquisição de reconstruir imagens z-série em projeções intensidade máxima.

Resultados

Adulto ratos Sprague-Dawley receberam laminectomy somente (controle ileso) ou unilateral hemi-SCI contusão na medula espinhal nível C4 ^10-12. Ao fim de 5 semanas após a cirurgia, o pico de amplitude CMAP gravado a partir do hemi-diafragma ipsilateral ao local da laminectomia / lesão foi significativamente reduzida em ratos SCI (Figura 2C), em comparação com o controlo só de laminectomia (Figura 2B). Todos os NMJs no hemi-diafragma foi completamente intacta no controlo ...

Discussão

Como a função respiratória é comprometida em ambos traumático SCI e ALS, desenvolver terapias que visem a respiração e, especificamente, a inervação do diafragma são clinicamente relevantes ^5,6. A fim de estudar de forma abrangente função respiratória, deve ser utilizado um método de abordagem combinada. CMAPs medir o grau de inervação funcional do diafragma por meio da estimulação do nervo frênico externo, mas o impulso respiratório bulbospinal não endógeno ^8. Além disso, es...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	Fisher	T353-500	Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1x PBS, adjust pH to 7.4
1x Phosphate buffered saline, pH 7.4	Invitrogen	10010049
2% Bovine serum albumin (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Dissolve 2 g BSA into 100 ml of 1x PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (blocking buffer)	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	Dissolve 0.2 ml/100 ml 2% BSA/PBS
0.1 M Glycine	Sigma-Aldrich	G-7126	Add 0.185 g to 25 ml of 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin	Invitrogen	T1175	Concentration 1:400
SMI-312	Sternberger Monoclonals	SMI312	Concentration 1:1,000
SV2	Developmental Studies Hybridoma Bank	SV2-Supernatant	Concentration 1:10
FITC goat anti-mouse IgG1	Roche	3117731001	Concentration 1:100
Silicone rubber	Sylgard, Dow Corning	Part # 184	Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30 mm, 60 mm, 100 mm) depending on needs
Vectashield fluorescent mounting medium	Vector laboratories	H-1000	This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.
Small spring scissors	Fine Science Tools	15002-08
Dissection forceps	Fine Science Tools	11295-51
Software for CMAP recordings	Scope 3.5.6; ADI
Disk surface electrodes	Natus neurology	019-409000
Subdermal needle electrodes	Natus neurology	019-453100
Conductive gel	Aquasonic	122-73720
Stimulator/recording system for CMAP recordings	ADI Powerlab 8SP stimulator
Amplifier for CMAP recordings	BioAMP