胞外DNA释放的高通量测量和人中性粒定量NET形成<em&gt;体外</em

摘要

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

摘要

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation.

Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

引言

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.¹ The core of NETs is nuclear DNA.¹ This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.¹ The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.² NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.^3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release.

Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.^3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.¹ Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.¹ MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.^1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.² NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).⁶ Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.⁶

Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

研究方案

佐治亚大学的机构审查委员会批准的人类主体研究，以收集来自健康志愿者（UGA＃2012-10769-06）外周血^。5,7,8志愿者签署抽血前所需的知情同意书。在这篇文章中进行的研究符合涉及赫尔辛基宣言人体医学研究的伦理准则。

1.人外周血中性粒细胞的分离（图1）

注意:有几种方法分离自外周血的中性粒细胞。以下方案提供了一种可能性。该协议产生大量能够对外界刺激释放教师的非激活的人中性粒细胞。使用40毫升由静脉穿刺健康志愿者获得的全血^。7,9

1. 分装20毫升血液进入两个50毫升锥形管。加入10 mL 6％右旋糖酐。轻轻混匀。
2. 经过20分钟转移白细胞RICħ上层相而不采取任何沉淀的红细胞成清洁50ml锥形管中，并用无菌PBS填满它。
3. 离心机在400 xg离心10分钟。在4毫升重悬沉淀无菌PBS。
4. 制备85％的5个步骤的Percoll梯度-80％-75％-70％-65％在两个15毫升锥形管和层2毫升白细胞悬浮液在每个梯度的顶端。
5. 离心机800 XG与刹车关闭30分钟。
6. 收集在75％/ 80％的所有细胞（中性粒细胞）在所述层和70％/ 75％的界面。
7. 在PBS中洗涤细胞两次（350 XG，10分钟，RT）和使用血球计数细胞。

2.使用微孔板荧光计外DNA释放的动力学测量

注意:此方法能够在不可透过膜的DNA结合在96孔微孔板格式指示的DNA释放的染料（ 图2）的荧光变化的测量。

1. 制备悬浮液在测定培养基嗜中性粒细胞（HBSS +1％（V / V）的自体血清+ 5mM葡萄糖）以2×10 ^6个细胞/ ml的浓度。
2. 添加5微摩尔/升的膜不可渗透的DNA结合染料。轻轻混匀。
3. 等分试样的人类嗜中性粒细胞（50μl/孔）到96孔黑色，透明底微板。确保测定培养基覆盖井的整个底部。如果没有，轻轻敲击侧面的板。
4. 预热10分钟的含板中性白细胞在37℃。
5. 在此期间，在它们的最终浓度的两倍制备刺激方案中使用（在37℃的温水测定培养基）。作为阳性NET控制使用人嗜中性粒用100nM佛波醇肉豆蔻乙酸酯（PMA）4小时触发最大净释放^。-5,8- PMA刺激4小时，确保最大净释放而自发NET形成仍然很低^5,8。
6. 制备微孔板荧光计进行测定（4小时，37℃，激发530nm处和用于发射590纳米）。
7. 通过加入50μl的刺激溶液至50μl嗜中性粒细胞悬浮液刺激嗜中性粒细胞。使用0.5微克/毫升皂素于一体的测量最大DNA释放信号。
8. 将板阅读器，并测量每2分钟没有晃动的荧光变化4小时。
9. 进行数据分析，计算随时间的荧光归增加。
   1. 从端点值减去基线荧光所有井包括皂苷（ 图2A，B）。上升皂素荧光应该是最高的信号。它被称为"最大的DNA释放"（ 图2A）。
   2. 由最大DNA释放除以未知样品的荧光增大计算未知样品中的DNA释放百分比。
   3. 重复的平均结果之和作为"最大的DNA释放％"（ 图2C）。

3. NET表单的定量通过通货膨胀MPO-DNA和HNE-DNA化验ELISA

注意:在我们的实验室这些测定改性（MPO-DNA）或建立（HNE-DNA）通过测量MPO-DNA和HNE-DNA复合物的水平的定量NET形成^5。

1. 涂层的96孔高结合过夜捕捉抗体（50μl/孔）的能力的ELISA平板:抗MPO（1:2,000稀释度）或抗HNE（1:2,000）。
2. 洗涤ELISA板三次，用PBS（200μl/孔）并在室温用5％BSA和0.1％人血清白蛋白阻断它们为2小时（200μl/孔）。用PBS洗涤三次。
3. 在96孔微孔板以100,000个细胞/孔在100μl测定培养基的密度种子嗜中性粒细胞，并刺激网的形成。孵育细胞:4小时37℃。
4. 加入2 U / ml的DNA酶中性粒细胞上清液进行有限的DNA酶消化，以及混合。让他们在室温。
5. 通过加入11微升25mM的EGTA（最终浓度2.5毫摩尔）停止15分钟后的DNA酶。拌匀。苏收集pernatants干净的离心管。自旋样品在300 xg离心除掉细胞碎片在RT 5分钟。转让其上清液到干净的离心管。让他们在冰，直到准备。
6. 使用预先制备的"NET标准"的等分试样。
   注意:NET-标准是由至少5个不同的，独立人供体获得的PMA刺激嗜中性粒细胞的DNA酶消化的上清液的混合。
   1. 要使用相同的标准很长一段时间，收集并从每个捐赠者分装大量中性粒细胞上清。收集例如2毫升PMA刺激嗜中性粒细胞的DNA酶消化的上清液将导致200等份（各10微升）足以为200 ELISA板。数据表征NET标准在图5中。
   2. 刺激人中性粒细胞用100nM PMA 4小时，并应用DNA酶消化，以根据步骤3.4-3.5其上清液。
   3. 收集，游泳池，分装（10微升）和自由泽（-20°C），中性粒细胞上清液。
   4. 为了准备"网标"，从解冻至少五个独立的供体获得一个等份/供体，将它们混合，并保持他们在冰上。
   5. 丢弃解冻的样品，并使用新鲜的下一个实验。
   6. 准备1:PBS + EGTA网标准的2系列稀释。
7. 稀释DNase1消化的样品（标准和未知上清液）20倍的PBS + EGTA和分装它们涂有捕获抗体ELISA板。
8. 孵育过夜ELISA板在4℃下，并用PBS洗三次。
9. 应用检测抗体溶液（100μl/孔）:辣根过氧化物酶缀合的抗DNA抗体（1:500，鼠标）。孵育在黑暗1小时。
10. 洗涤四次后，用PBS加TMB过氧化物酶底物:100微升/孔，30分钟。蓝颜色是过氧化物酶活性（母语存在）的指示。
11. 通过加入100μl/孔的1M HCl终止反应。该蓝色的解决方案会变成黄色（ 图5A）。
12. 在使用微板光度计450nm处读取吸光度。
13. 进行数据分析，计算相对于NET标准的MPO-DNA或HNE-DNA复合物的量。
    1. 减去从所有样品的测定培养基的背景光密度值。
    2. 绘制针对其相对净含量（Y轴）（ 图5A）将稀释的标准样品的吸光度值（X轴）。
    3. 使用该标准曲线的非饱和范围建立趋势线（采用最佳指数拟合从所使用的软件）（ 图5A）。这条趋势线的方程式决定OD值转化为定量母语的金额。
    4. 插入未知数的测量OD值到从3.13.3趋势线方程，这将使未知样品为NET-标准（ 图5A）的百分比在教师的量。
    5. 计算重复的（一式三份）平均值，并提交最终的数据（ 图5C）"MPO-DNA或HNE-DNA复合物（标准的百分比）的量。"

结果

在这个手稿附图描述嗜中性粒细胞分离，实验程序和数据分析的解释本代表性结果的方法。 图1示出人中性粒细胞的制备的顺序步骤。该协议仅表示嗜中性粒细胞分离的可能的方式。它会产生大量的休息能够刺激后释放的外籍英语教师的中性粒细胞。 图2显示了基于荧光的DNA释放试验是如何工作的。使用DNA释放的荧光酶标仪动力学在人嗜中性粒细?...

讨论

英语教师代表是中性粒细胞杀死病原体^。1虽然教师的文学过去十年里，因为他们发现，与他们的生物学，机制和调控作用，一些重要的问题仍不清楚不断扩大在一个迷人的新机制。适当的方法已被开发来衡量英语教师，这非常独特的抗菌机理。本文介绍了可用于定量英语教师在高通量的方式方法。第一测定如下的膜不透DNA结合染料的荧光的动力学。此法提供了大量的斜坡上，距离中性粒?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)	Millipore	07-496	1:2,000x coated
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon Microplate Spectrophotometer	Biotek
Gen5 All-in-One microplate software	Biotek		analytical tool (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0.2% final concentration/volume
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Use 10 mM final concentration.
1 M glucose	Sigma		Use 5 mM final concentration.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
ELISA Plate	Greiner bio-one	655061
Conical tubes 15 ml	Thermoscientific	339650
Conical tubes 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8.5-9.5)	Sigma	P 1644	Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 media	Corning Cellgro	17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom	Costar	3603