Высокая пропускная способность измерения внеклеточной ДНК-релиз и количественный NET Формирование в нейтрофилах человека<em&gt; In Vitro</em

Резюме

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Аннотация

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation.

Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

Введение

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.¹ The core of NETs is nuclear DNA.¹ This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.¹ The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.² NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.^3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release.

Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.^3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.¹ Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.¹ MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.^1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.² NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).⁶ Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.⁶

Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

протокол

Совет Институциональный Обзор Университета штата Джорджия одобрил исследование предмет человека для сбора периферической крови здоровых добровольцев (УЗА # 2012-10769-06). ^5,7,8 Добровольцы подписали требуемую форму информированного согласия перед взятия крови. Исследования, проведенные в этой статье, в соответствии с этическими принципами для медицинских исследований с участием человека, закрепленных в Декларации Хельсинки.

1. Выделение нейтрофилов из периферической крови человека (Рисунок 1)

Примечание: Есть несколько способов, чтобы изолировать нейтрофилов из периферической крови. Следующий протокол обеспечивает одну возможность. Этот протокол дает большое количество неактивированных нейтрофилов человека, способные высвобождать от внешней сетей не стимуляции. Используйте 40 мл цельной крови получали от здоровых добровольцев венопункцией. ^7,9

1. Алиготе 20 мл крови на две 50 мл конические пробирки. Добавляют 10 мл 6% декстрана. Осторожно перемешать.
2. Через 20 мин передачи лейкоцитарной-RICч верхняя фаза без принятия каких-либо осаждали красных кровяных клеток в чистые 50 мл конические пробирки, и заполнить его стерильной PBS.
3. Центрифуга при 400 мкг в 10 мин. Ресуспендируют осадок в 4 мл стерильной PBS.
4. Приготовьте 5-ступенчатый перколлом градиент 85% -80% -75% -70% -65% в двух 15 мл конические пробирки и слой 2 мл лейкоцитарной суспензии на вершине каждого градиента.
5. Центрифуга 800 мкг в течение 30 мин с тормозами прочь.
6. Соберите все клетки (нейтрофилы) в слоях на 75% / 80% и 70% интерфейс / 75%.
7. Вымойте клетки дважды в PBS (350 XG, 10 мин, RT) и подсчет клеток с использованием гемоцитометра.

2. Измерение кинетики внеклеточной ДНК-релиз Использование микропланшетов Флуориметр

Примечание: Этот метод позволяет измерять изменения в флуоресценции мембран непроницаемый для ДНК-связывающего краситель , указывающего высвобождения ДНК на формате микропланшетов 96-луночного (рисунок 2).

1. Приготовьте суспензию нейтрофилов в аналитической среде (HBSS +1% (об / об) аутологичной сыворотки + 5 мМ глюкозы) в концентрации 2 х 10 ⁶ клеток / мл.
2. Добавьте 5 мкмоль / л мембраны непроницаемой ДНК-связывающего красителя. Осторожно перемешать.
3. Аликвотные нейтрофилы человека (50 мкл / лунку) в 96-луночный черный, прозрачный дно микропланшетов. Убедитесь, что анализ среда охватывает всю нижнюю часть скважины. Если нет, то нажмите на пластину аккуратно на стороне.
4. Нагреть планшет, содержащий нейтрофилы в течение 10 мин при 37 ° С.
5. В то же время приготовления растворов стимулов при двойном их конечных концентрациях, которые будут использоваться (в 37 ° C теплой среде для анализа). В качестве положительного контроля используют NET нейтрофилов человека с 100 нМ форбол-миристат-ацетата (PMA) в течение 4 часов , чтобы вызвать максимальное высвобождение NET. ^5,8 PMA стимуляции в течение 4 ч обеспечивает максимальное высвобождение NET в то время как спонтанное NET образование остается низким ^5,8.
6. Приготовьте микропланшет флуориметра для измерения (4 ч, 37 ° C, 530 нм для возбуждения и 590 нм для эмиссии).
7. Стимулируют нейтрофилы путем добавления 50 мкл раствора стимул к 50 мкл суспензии нейтрофилов. С помощью 0,5 мкг / мл сапонина в одной скважине для измерения максимального сигнала высвобождения ДНК.
8. Поместите пластину в считывающее устройство и измерения изменений флуоресценции в течение 4 ч при каждые 2 мин с не встряхивая.
9. Для анализа данных, вычисляют нормализованные увеличение флуоресценции с течением времени.
   1. Вычитание базовой линии флуоресценции от значений конечных точек для всех скважин , включая сапонины (рис 2А, В). Рост сапонина флуоресценции должен быть самым высоким сигналом. Это называется "максимального высвобождения ДНК" (фиг.2А).
   2. Рассчитать процент высвобождения ДНК в неизвестных образцах путем деления увеличения флуоресценции неизвестных образцов максимального высвобождения ДНК.
   3. Средние результаты повторах и представить их в виде "% максимального высвобождения ДНК" (рис 2С).

3. Количественное NET формывания МРО-ДНК и ДНК-HNE ИФА

Примечание: Эти анализы модифицированного (МРО-ДНК) или установлена ​​(гидроксиноненал-ДНК) в нашей лаборатории количественной оценки NET образования путем измерения уровней МРО-ДНК и комплексов ДНК ^{гидроксиноненал-5.}

1. Шерсть 96-луночного высокой вяжущей способностью ELISA пластины в течение ночи с антителами захвата (50 мкл / лунку): анти-MPO (1: 2000 разведение) или анти-гидроксиноненал (1: 2000).
2. Мытье ELISA планшеты три раза PBS (200 мкл / лунку) и блокировать их с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% человеческого сывороточного альбумина в течение 2 ч при комнатной температуре (200 мкл / лунку). Промыть три раза PBS.
3. Семенной нейтрофилы на 96-луночные микропланшеты при плотности 100000 клеток / лунку в 100 мкл среды для анализа, а также стимулировать формирование чистого. Инкубируйте клетки: 4 часа 37 ° C.
4. Выполните ограниченное ДНКазную пищеварение путем добавления 2 ед / мл ДНКазы к нейтрофильных супернатантов, хорошо перемешать. Храните их при комнатной температуре.
5. Остановить ДНКазы через 15 мин путем добавления 11 мкл 25 мМ EGTA (конечная концентрация 2,5 мМ). Хорошо перемешать. Собирают суpernatants в чистых микроцентрифужных труб. Образцы Спин, чтобы избавиться от остатков клеток при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Передача их супернатантов в чистые микроцентрифужных труб. Держите их на льду до готовности.
6. Используйте аликвоту предварительно подготовленную "NET стандарта".
   Примечание: NET-стандарт представляет собой смесь ДНКазы-переваренной супернатантах PMA-стимулированных нейтрофилов, полученных по меньшей мере, 5 различных, независимых людей-доноров.
   1. Для того, чтобы использовать один и тот же стандарт, в течение длительного времени, собирать и аликвоту большой объем нейтрофильных супернатантах от каждого отдельного донора. Сбор, например, 2 мл ДНКазы переваривается супернатантах РМА-стимулированных нейтрофилах приведет к 200 аликвот (10 мкл каждый) достаточно на 200 ELISA пластин. Данные , характеризующие NET стандарт найдены на рисунке 5.
   2. Стимулируют нейтрофилов человека с 100 нМ РМА в течение 4 ч и применять ДНКазы переваривать их супернатантах в соответствии шагов 3,4-3,5.
   3. Сбор, бассейн, аликвоту (10 мкл) и свободногоге (-20 ° C) нейтрофильные супернатанты.
   4. Для приготовления «NET-стандарт", оттепель одну аликвоту / донора, полученного по меньшей мере, пять отдельных доноров, смешать их и держать их на льду.
   5. Откажитесь размороженные образцы и использовать свежие из них для следующего эксперимента.
   6. Подготовьте 1: 2 серийное разведение NET-стандарта в PBS + EGTA.
7. Развести DNase1-усваиваются образцы (стандартные и неизвестные супернатантов) 20 раз в PBS + EGTA и аликвоту их на ELISA планшеты, покрытые антителами захвата.
8. Выдержите ELISA пластины в течение ночи при 4 ° С и промойте их три раза PBS.
9. Нанести раствор антитела обнаружения (100 мкл / лунку): пероксидазу хрена, конъюгированный анти-ДНК-антитела (1: 500, мышь). Выдержите в течение 1 ч в темноте.
10. После четырех промывок PBS добавляют субстрата пероксидазы TMB: 100 мкл / лунку, 30 мин. Синий окраска является показателем активности пероксидазы (NETS настоящее время).
11. Остановить реакцию добавлением 100 мкл / лунку 1 М HCl.голубые решения будут желтеть (рис 5А).
12. Измерить оптическую плотность при 450 нм с использованием микропланшет-фотометр.
13. Для анализа данных расчета количества МРО-ДНК или комплексов гидроксиноненал-ДНК по сравнению с чистым стандартом.
    1. Вычитание значения оптической плотности фона в среде для анализа из всех образцов.
    2. Участок значения оптической плотности (Х-ось) разбавленных стандартных образцов с их относительной NET контента (Y-ось) (рис 5А).
    3. Используя ненасыщенного диапазон стандартной кривой установить линию тренда (использовать лучше всего подходят экспоненциальную от используемого программного обеспечения) (Рисунок 5А). Уравнение этой линии тренда определяет преобразование значений ОП для количественного количества сетками.
    4. Вставьте измеренные значения ОП неизвестных в уравнении тренда линии от 3.13.3 , которая даст количество НЭО в неизвестном образце в процентах от NET-стандарта (рис 5А).
    5. подсчитыватьсредние повторах (трехкратном повторе) и представить окончательные данные как "количества МРО-ДНК или гидроксиноненал-ДНК комплексов (% от стандарта)" (Рисунок 5С).

Результаты

Цифры , приведенные в этой рукописи описывают метод выделения нейтрофилов, экспериментальных процедур и нынешних представительных результатов с объяснением анализа данных. На рисунке 1 показаны последовательные стадии подготовки человеческого нейтрофило?...

Обсуждение

НРТ представляют захватывающий новый механизм , с помощью которого нейтрофилы убивают болезнетворные микроорганизмы. ¹ Хотя литература НЭО непрерывно расширяется в течение последних десяти лет с момента их открытия, несколько важных вопросов , связанных с их ролью в биологии, ме...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)	Millipore	07-496	1:2,000x coated
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon Microplate Spectrophotometer	Biotek
Gen5 All-in-One microplate software	Biotek		analytical tool (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0.2% final concentration/volume
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Use 10 mM final concentration.
1 M glucose	Sigma		Use 5 mM final concentration.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
ELISA Plate	Greiner bio-one	655061
Conical tubes 15 ml	Thermoscientific	339650
Conical tubes 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8.5-9.5)	Sigma	P 1644	Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 media	Corning Cellgro	17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom	Costar	3603