Alto Rendimiento de medición de ADN extracelular de salida y la formación neta cuantitativa en neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

Resumen

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Resumen

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation.

Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

Introducción

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.¹ The core of NETs is nuclear DNA.¹ This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.¹ The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.² NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.^3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release.

Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.^3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.¹ Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.¹ MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.^1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.² NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).⁶ Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.⁶

Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

Protocolo

La Junta Institucional de la Universidad de Georgia Revisión aprobó el estudio de sujetos humanos para recoger la sangre periférica de voluntarios sanos (UGA # 2012-10769-06). ^5,7,8 voluntarios firmaron el consentimiento informado necesario antes de la extracción de sangre. La investigación realizada en este artículo está en conformidad con las directrices éticas para la investigación médica en seres humanos de la Declaración de Helsinki.

1. Aislamiento de los neutrófilos de sangre periférica humana (Figura 1)

Nota: Hay varias maneras de aislar los neutrófilos de sangre periférica. El siguiente protocolo proporciona una posibilidad. Este protocolo produce un gran número de neutrófilos no activadas humanos capaces de liberar TNE a la estimulación externa. Utilice 40 ml de sangre entera obtenida de voluntarios sanos por punción venosa. ^7,9

1. Alícuota de sangre 20 ml en dos tubos cónicos de 50 ml. Añadir 10 ml de dextrano al 6%. Mezclar suavemente.
2. Después de 20 minutos, la transferencia de leucocitos-rich fase superior sin tomar ninguna glóbulos rojos sedimentados en limpios de 50 ml tubos cónicos, y llenarlo con PBS estéril.
3. Centrifugar a 400 xg 10 min. Resuspender pellet en 4 ml de PBS estéril.
4. Preparar un 5 a paso Percoll gradiente de 85% -80% -75% -70% -65% en dos tubos de 15 ml cónicos y capa 2 ml de suspensión de leucocitos en la parte superior de cada gradiente.
5. Centrifugadora 800 xg durante 30 min con frenos estarán desactivados.
6. Recoge todas las células (neutrófilos) en las capas en el 75% / 80% y la interfaz 70% / 75%.
7. Lavar las células dos veces en PBS (350 xg, 10 min, RT) y contar las células usando un hemocitómetro.

2. Medición de la Cinética de ADN extracelular de liberación utilizando una microplaca Fluorimétrico

Nota: Este método permite la medición de cambios en la fluorescencia de una membrana impermeable al colorante indicativo de la liberación de ADN en un formato de microplaca de 96 pocillos de unión a ADN (Figura 2).

1. Preparar una suspensión de neutrófilos en medio de ensayo (HBSS +(V / v) 1% de suero autólogo + glucosa 5 mM) a una concentración de 2 x 10 ⁶ células / ml.
2. Añadir 5 mol / L del colorante de unión a ADN impermeable membrana. Mezclar suavemente.
3. neutrófilos humanos alícuota (50 l / pocillo) en 96 pocillos de fondo negro, transparente microplacas. Asegúrese de que el medio de ensayo cubre todo el fondo del pozo. Si no, toque suavemente la placa en el lateral.
4. Calentar los neutrófilos placa que contiene de 10 minutos a 37 ° C.
5. Mientras tanto preparar soluciones de estímulos al doble de sus concentraciones finales a utilizar (en 37 ° C medio de ensayo en caliente). Como control positivo neto utilizar los neutrófilos humanos con 100 nM de forbol-miristato-acetato (PMA) durante 4 horas para desencadenar la liberación máxima NET. ^5,8 estimulación de PMA durante 4 horas asegura la liberación máxima NET NET mientras que la formación espontánea sigue siendo baja ^5,8.
6. Preparar el fluorímetro de microplaca para la medición (4 hr, 37 ° C, 530 nm para la excitación y 590 nm para la emisión).
7. Estimular neutrófilos mediante la adición de solución de estímulo 50 l 50 l suspensiones de neutrófilos. Utilizar 0,5 mg / ml de saponina en un pocillo para medir la señal máxima de liberación de ADN.
8. Colocar la placa en el lector y medir los cambios en la fluorescencia durante 4 horas a cada 2 minutos sin agitación.
9. Para el análisis de datos, calcular los aumentos en la fluorescencia normalizados a través del tiempo.
   1. Restar de fluorescencia base de los valores de punto final para todos los pozos que incluye saponina (Figura 2A, B). Aumento de la fluorescencia saponina debe ser la señal más alta. Se conoce como "la liberación de ADN máxima" (Figura 2).
   2. Calcular los porcentajes de liberación de ADN en muestras desconocidas dividiendo los aumentos en la fluorescencia de muestras desconocidas por la liberación máxima de ADN.
   3. Los resultados promedio de las réplicas y los presentan como "% de la liberación máxima de ADN" (Figura 2C).

3. La cuantificación de la Forma NETación por MPO-ADN y ADN-HNE ensayos ELISA

Nota: Estos ensayos (MPO-ADN) modificado o establecido (HNE-ADN) en nuestro laboratorio cuantificar la formación neta midiendo los niveles de MPO-ADN y complejos de ADN ^HNE-5.

1. Escudo de 96 pocillos de alta unión a placas de ELISA de capacidad durante la noche con anticuerpos de captura (50 l / pocillo): anti-MPO (dilución 1: 2000) o anti-HNE (1: 2000).
2. Lavar las placas de ELISA tres veces con PBS (200 l / pocillo) y bloquearlas con BSA al 5% y albúmina de suero humano 0,1% durante 2 horas a RT (200 l / pocillo). Lavar tres veces con PBS.
3. neutrófilos semilla en microplacas de 96 pocillos a una densidad de 100.000 células / pocillo en 100 l de medio de ensayo, y estimular la formación de NET. Se incuban las células: 4 h para 37 ° C.
4. Realizar una digestión DNasa limitada mediante la adición de 2 U de DNasa / ml de sobrenadante de neutrófilos, mezclarlos bien. Mantenerlos a temperatura ambiente.
5. Detener la DNasa después de 15 minutos mediante la adición de 11 l mM EGTA 25 (concentración final 2,5 mM). Mezclar bien. recoger supernatants en tubos de microcentrífuga limpios. muestras de giro para deshacerse de los restos de células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Transferir sus sobrenadantes en tubos de microcentrífuga limpios. Mantenerlos en hielo hasta que esté listo.
6. Se utiliza una alícuota de un preparado previamente "estándar NET".
   Nota: El NET-estándar es una mezcla de sobrenadantes de DNasa-digerido de neutrófilos estimulados por PMA obtenidos a partir de al menos 5 donantes humanos diferentes e independientes.
   1. Para utilizar el mismo estándar para un largo tiempo, recoger y alícuota un gran volumen de sobrenadantes de neutrófilos de cada donante individual. El cobro por ejemplo 2 ml de sobrenadantes de DNasa-digerido de neutrófilos estimulados por PMA dará lugar a alícuotas de 200 (10 l cada uno) suficientes para 200 placas de ELISA. Datos que caracterizan el estándar NET se encuentran en la Figura 5.
   2. Estimular los neutrófilos humanos con PMA 100 nM durante 4 horas y aplicar DNasa digerir a sus sobrenadantes europea Según los pasos 3.4-3.5.
   3. Recoger, piscina, alícuota (10 l) y libresobrenadantes ze (-20 ° C) de neutrófilos.
   4. Para preparar el "NET-estándar", descongelar una alícuota / donante obtenida de al menos cinco donantes por separado, mezclar y mantenerlos en hielo.
   5. Desechar las muestras descongeladas y el uso de los frescos para el siguiente experimento.
   6. Preparar una dilución 1: 2 en serie de la red estándar en PBS + EGTA.
7. Diluir muestras digeridas-Dnase1 (estándar y los sobrenadantes desconocidos) 20 veces en PBS + EGTA y alícuota ellos en placas de ELISA recubiertas con anticuerpos de captura.
8. Incubar las placas de ELISA durante la noche a 4 ° C y los lavar tres veces con PBS.
9. Aplicar la solución de anticuerpo de detección (100 l / pocillo): peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo anti-ADN (1: 500, de ratón). Incubar durante 1 hora en la oscuridad.
10. Después de cuatro lavados con PBS añadir sustrato de peroxidasa TMB: 100 l / pocillo, 30 min. coloración azul es una indicación para la actividad de la peroxidasa (TNE) presentes.
11. Detener la reacción mediante la adición de 100 l / pocillo de HCl 1. lossoluciones azules se vuelven amarillas (Figura 5A).
12. Leer la absorbancia a 450 nm utilizando un fotómetro de microplacas.
13. Para el análisis de los datos, el cálculo de la cantidad de MPO-ADN o ADN-HNE complejos en comparación con el estándar NET.
    1. Restar el valor de densidad óptica de fondo del medio de ensayo de todas las muestras.
    2. Representar gráficamente los valores de absorbancia (eje X) de las muestras patrón diluidas en contra de su contenido neto relativo (eje Y) (Figura 5).
    3. El uso de la gama no saturado de esta curva estándar de establecer una línea de tendencia (utilizar mejor ajuste exponencial del software utilizado) (Figura 5). La ecuación de esta línea de tendencia determina la conversión de los valores de DO a lo cuantitativo cantidades de los TNE.
    4. Introduzca los valores de DO medidos de las incógnitas en la ecuación de la línea de tendencia de 3.13.3 que le dará la cantidad de TNE en la muestra desconocida como porcentaje del precio neto estándar (Figura 5A).
    5. Calcularpromedios de repeticiones (por triplicado) y presentar los datos finales como "cantidad de MPO-ADN o complejos de HNE-ADN (%) de la norma" (Figura 5C).

Resultados

Las cifras en este manuscrito se describe el método de aislamiento de neutrófilos, los procedimientos experimentales, y presentar los resultados representativos con la explicación de análisis de datos. La figura 1 muestra las etapas secuenciales de la preparación de neutrófilos humanos. Este protocolo representa sólo una manera posible de aislamiento de neutrófilos. Se produce grandes cantidades de neutrófilos en reposo capaces de liberar TNE a la estimulación....

Discusión

TNE representan un fascinante nuevo mecanismo por el cual los neutrófilos matar los agentes patógenos. ¹ Aunque la literatura de los TNE ha sido cada vez más importante en los últimos diez años desde su descubrimiento, varias cuestiones importantes relacionadas con su papel en la biología, el mecanismo y la regulación siguen sin estar claros. metodología adecuada tiene que ser desarrollado para medir los TNE, este mecanismo antimicrobiano muy singular. Este artículo describe métodos que se pueden ut...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)	Millipore	07-496	1:2,000x coated
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon Microplate Spectrophotometer	Biotek
Gen5 All-in-One microplate software	Biotek		analytical tool (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0.2% final concentration/volume
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Use 10 mM final concentration.
1 M glucose	Sigma		Use 5 mM final concentration.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
ELISA Plate	Greiner bio-one	655061
Conical tubes 15 ml	Thermoscientific	339650
Conical tubes 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8.5-9.5)	Sigma	P 1644	Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 media	Corning Cellgro	17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom	Costar	3603