Misura High Throughput di extracellulare DNA di uscita e quantitativa NET Formazione in neutrofili umani<em&gt; In Vitro</em

Riepilogo

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Abstract

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation.

Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

Introduzione

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.¹ The core of NETs is nuclear DNA.¹ This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.¹ The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.² NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.^3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release.

Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.^3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.¹ Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.¹ MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.^1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.² NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).⁶ Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.⁶

Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

Protocollo

L'Institutional Review Board della Università della Georgia ha approvato lo studio soggetto umano per raccogliere sangue periferico di volontari sani (UGA # 2012-10769-06). ^5,7,8 I volontari hanno firmato il modulo di consenso informato richiesto prima di prelievo di sangue. La ricerca svolta in questo articolo è in conformità con le linee guida etiche per la ricerca medica che coinvolge soggetti umani della Dichiarazione di Helsinki.

1. Isolamento di neutrofili dal sangue periferico umano (Figura 1)

Nota: Ci sono diversi modi per isolare neutrofili dal sangue periferico. Il protocollo che segue fornisce una possibilità. Questo protocollo produce un gran numero di neutrofili non attivati ​​umani capaci di liberare NET dopo stimolazione esterna. Utilizzare 40 ml di sangue intero ottenuto da volontari sani mediante prelievo venoso. ^7,9

1. Aliquota del sangue 20 ml in due provette da 50 ml coniche. Aggiungere 10 ml 6% destrano. Mescolare delicatamente.
2. Dopo 20 min di trasferimento del leucociti-rich fase superiore senza prendere i globuli rossi pellet in clean 50 ml provette coniche, e riempire con PBS sterile.
3. Centrifugare a 400 xg 10 min. Risospendere il pellet in 4 ml di PBS sterile.
4. Preparare un 5-passo gradiente di Percoll 85% -80% -75% -70% -65% in due provette da 15 ml coniche e strato 2 ml di sospensione di leucociti in cima ad ogni sfumatura.
5. Centrifuga 800 xg per 30 minuti con freni sbloccati.
6. Raccogliere tutte le cellule (neutrofili) negli strati al 75% / 80% e l'interfaccia 70% / 75%.
7. Lavare le cellule due volte in PBS (350 xg, 10 min, RT) e contare le cellule utilizzando un emocitometro.

2. Misura di Cinetica di extracellulare DNA di uscita Utilizzando un micropiastre fluorimetro

Nota: Questo metodo consente la misurazione delle variazioni nella fluorescenza di una membrana impermeabile DNA-binding dye indicativa di rilascio DNA su un formato micropiastra a 96 pozzetti (Figura 2).

1. Preparare una sospensione di neutrofili nel terreno di coltura (HBSS +1% (v / v) di siero autologo + 5 mM di glucosio) ad una concentrazione di 2 x 10 ⁶ cellule / ml.
2. Aggiungere 5 mmol / L del impermeabile tintura DNA-binding membrana. Mescolare delicatamente.
3. Aliquota neutrofili umani (50 pl / pozzetto) sui 96 pozzetti nero, fondo trasparente micropiastre. Assicurarsi che il terreno di coltura copre l'intero fondo del pozzo. In caso contrario, toccare delicatamente la piastra sul lato.
4. Riscaldare i neutrofili piatto contenente per 10 minuti a 37 ° C.
5. Nel frattempo preparare soluzioni di stimoli al doppio della loro concentrazioni finali da utilizzare (in 37 ° C terreno di coltura caldo). Come utilizzare un controllo positivo netto neutrofili umani con 100 nM forbolo-miristato-acetato (PMA) per 4 ore a innescare il rilascio massima NET. ^5,8 stimolazione PMA per 4 ore assicura rilascio massima NET mentre la formazione NET spontanea rimane bassa ^5,8.
6. Preparare il fluorimetro micropiastra per la misurazione (4 ore, 37 ° C, 530 nm per l'eccitazione e 590 nm per l'emissione).
7. Stimolare neutrofili con l'aggiunta di una soluzione di stimolo 50 ml a 50 sospensioni neutrofili microlitri. Utilizzare 0,5 mg / ml saponina in un pozzetto per misurare segnale di rilascio del DNA massima.
8. Mettere piatto in lettore e misurare le variazioni di fluorescenza per 4 ore ad ogni 2 min senza agitazione.
9. Per l'analisi dei dati, calcolare gli aumenti normalizzati a fluorescenza nel tempo.
   1. Sottrarre basale fluorescenza dai valori endpoint per tutti i pozzetti compresi saponina (Figura 2A, B). Aumento della saponina fluorescenza dovrebbe essere il segnale più alto. Si è indicato come "rilascio DNA massima" (Figura 2A).
   2. Calcolare le percentuali di rilascio di DNA nei campioni sconosciuti dividendo aumenti di fluorescenza dei campioni sconosciuti dal rilascio del DNA massima.
   3. Risultati medi di repliche e li presentano come "% del rilascio di DNA massima" (Figura 2C).

3. La quantificazione della Forma NETzione da MPO-DNA e HNE-DNA ELISA saggi

Nota: Questi test modificato (MPO-DNA) o stabilito (HNE-DNA) nel nostro laboratorio di quantificare la formazione NET misurando i livelli di MPO-DNA e complessi HNE-DNA ^5.

1. Coat 96 pozzetti di alto vincolante capacità piastre per una notte con anticorpi di cattura (50 ml / pozzetto): anti-MPO (1: 2.000 diluizione) o anti-HNE (1: 2.000).
2. Lavare le piastre ELISA tre volte con PBS (200 pl / pozzetto) e bloccarli con 5% di BSA e 0,1% di albumina di siero umano per 2 ore a temperatura ambiente (200 pl / pozzetto). Lavare tre volte con PBS.
3. neutrofili seme su 96 pozzetti ad una densità di 100.000 cellule / pozzetto in 100 microlitri terreno di coltura, e stimolare la formazione NET. Incubare le cellule: 4 ore per i 37 ° C.
4. Eseguire un digestione DNasi limitata con l'aggiunta di 2 U / ml DNasi per supernatanti neutrofili, mescolare bene. Tenerli a temperatura ambiente.
5. Arrestare il DNasi dopo 15 min con l'aggiunta di 11 ml di 25 mM EGTA (concentrazione finale 2,5 mm). Mescolare bene. raccogliere supernatants in tubi microcentrifuga pulite. campioni Spin per sbarazzarsi di detriti cellulari a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire le loro surnatanti in tubi microcentrifuga pulito. Tenerli in ghiaccio fino al momento.
6. Utilizzare una aliquota di un preparato in precedenza "standard NET".
   Nota: Il NET-standard è un mix di surnatanti DNasi-digerito di neutrofili PMA-stimolati ottenuti da almeno 5 diversi donatori umani indipendenti.
   1. Per utilizzare lo stesso standard per lungo tempo, raccogliere e un'aliquota un grande volume di surnatanti neutrofili dal singolo donatore. Raccolta per esempio 2 ml di surnatanti DNasi-digerito di neutrofili PMA-stimolati si tradurrà in 200 aliquote (10 ml ciascuno) sufficienti per 200 piastre ELISA. Dati che caratterizzano lo standard NET si trovano in figura 5.
   2. Stimolare neutrofili umani con 100 nM PMA per 4 ore e applicare DNasi digerire ai loro surnatanti secondo passi 3.4-3.5.
   3. Raccogliere, piscina, aliquota (10 ml) e la connessionesurnatanti ze (-20 ° C) dei neutrofili.
   4. Per preparare il "NET-standard", disgelo un'aliquota / donatore ottenuto da almeno cinque donatori separati, mescolarli e tenerli in ghiaccio.
   5. Eliminare i campioni scongelati e usare quelli freschi per il prossimo esperimento.
   6. Preparare una diluizione 1: 2 di serie del NET standard in PBS + EGTA.
7. Diluire i campioni DNase1-digerite (standard e supernatanti sconosciuti) 20 volte in PBS + EGTA e li aliquota su piastre ELISA rivestiti con anticorpi di cattura.
8. Incubare le piastre ELISA per tutta la notte a 4 ° C e lavarli tre volte con PBS.
9. Applicare la soluzione anticorpo di rilevazione (100 l / pozzetto): perossidasi di rafano coniugato anticorpo anti-DNA (1: 500, mouse). Incubare per 1 ora al buio.
10. Dopo quattro lavaggi con PBS aggiungere TMB substrato della perossidasi: 100 ml / pozzetto, 30 min. Colorazione blu è un'indicazione per l'attività perossidasi (NET presenti).
11. Arrestare reazione aggiungendo 100 microlitri / pozzetto 1 M HCl. IlLe soluzioni blu si accende di colore giallo (Figura 5A).
12. Leggere l'assorbanza a 450 nm con un fotometro per micropiastre.
13. Per l'analisi dei dati, calcolare la quantità di MPO-DNA o complessi HNE-DNA rispetto allo standard NET.
    1. Sottrarre il valore di densità ottica sfondo del terreno di coltura da tutti i campioni.
    2. Tracciare i valori di assorbanza (asse X) dei campioni di riferimento diluiti contro il loro contenuto netto relativa (asse Y) (Figura 5A).
    3. Utilizzando la gamma insaturi di questa curva standard stabilire una linea di tendenza (usare soluzione migliore esponenziale dal software utilizzato) (Figura 5A). L'equazione di questa linea di tendenza determina la conversione dei valori di DO per quantitativi quantità di reti.
    4. Inserire i valori OD misurati dei incognite nell'equazione trend-line da 3.13.3 che darà la quantità di reti nel campione sconosciuto come percentuale del prezzo netto standard (Figura 5A).
    5. Calcolaremedie di repliche (triplicato) e presentare i dati finali come "quantità di MPO-DNA o complessi HNE-DNA (% del campione)" (figura 5c).

Risultati

Le figure in questo manoscritto descrivono il metodo di isolamento dei neutrofili, procedure sperimentali, e presentano risultati rappresentativi con spiegazione di analisi dei dati. La Figura 1 mostra le fasi sequenziali di preparazione neutrofili umani. Questo protocollo rappresenta solo un modo possibile di isolamento dei neutrofili. Si produce grandi quantità di neutrofili in grado di rilasciare NET sulla stimolazione di riposo. La figura 2 mostra c...

Discussione

NET rappresentano un affascinante romanzo meccanismo attraverso il quale i neutrofili uccidere gli agenti patogeni. ¹ Sebbene la letteratura di NET ha continuato ad ampliarsi nel corso degli ultimi dieci anni dalla loro scoperta, diverse questioni importanti relative al loro ruolo nella biologia, meccanismo e regolazione rimangono poco chiari. metodologia appropriata deve essere sviluppato per misurare NET, questo meccanismo antimicrobico molto singolare. Questo articolo vengono descritti metodi che possono e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)	Millipore	07-496	1:2,000x coated
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon Microplate Spectrophotometer	Biotek
Gen5 All-in-One microplate software	Biotek		analytical tool (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0.2% final concentration/volume
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Use 10 mM final concentration.
1 M glucose	Sigma		Use 5 mM final concentration.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
ELISA Plate	Greiner bio-one	655061
Conical tubes 15 ml	Thermoscientific	339650
Conical tubes 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8.5-9.5)	Sigma	P 1644	Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 media	Corning Cellgro	17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom	Costar	3603