High Throughput medição de Extracelular DNA lançamento e Formação NET quantitativa em neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

Resumo

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Resumo

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation.

Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

Introdução

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.¹ The core of NETs is nuclear DNA.¹ This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.¹ The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.² NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.^3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release.

Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.^3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.¹ Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.¹ MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.^1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.² NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).⁶ Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.⁶

Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

Protocolo

O Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Geórgia aprovou o estudo humano sujeitos a recolha de sangue periférico de voluntários saudáveis ​​(UGA # 2012-10769-06). ^5,7,8 Os voluntários assinaram o termo de consentimento necessária antes de tirar sangue. A pesquisa realizada neste artigo está em conformidade com as diretrizes éticas para pesquisas médicas envolvendo seres humanos da Declaração de Helsinki.

1. Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano (Figura 1)

Nota: Existem várias maneiras para isolar os neutrófilos a partir de sangue periférico. O protocolo a seguir fornece uma possibilidade. Este protocolo resulta um grande número de neutrófilos não activados humanos capazes de libertar rede sobre a estimulação externa. Use 40 ml de sangue total obtido a partir de voluntários saudáveis ​​por punção venosa. ^7,9

1. Alíquota de 20 ml de sangue em dois tubos de 50 ml cônico. Adicionar 10 ml de dextrano a 6%. Misture delicadamente.
2. Após 20 min de transferência do leucócito-rich fase superior sem tomar quaisquer glóbulos vermelhos peletizadas para limpar 50 ml tubos cônicos, e preenchê-lo com PBS estéril.
3. Centrifugar a 400 xg, 10 min. Ressuspender o sedimento em 4 ml de PBS estéril.
4. Preparar um gradiente de Percoll de 5 passos de 85% -80% -75% -70% -65% em dois tubos de 15 mL cónicos e camada 2 ml de suspensão de leucócitos no topo de cada gradiente.
5. Centrífuga 800 xg por 30 min com freios fora.
6. Recolha todas as células (neutrófilos) nas camadas do 75% / 80% e interface de 70% / 75%.
7. Lavar as células duas vezes em PBS (350 xg, 10 min, RT) e contagem de células utilizando um hemocitómetro.

2. Medição da cinética de ADN extracelular de lançamento Usando uma microplaca de Fluorímetro

Nota: Este método permite a medição das alterações na fluorescência de um corante indicador de libertação de ADN em um formato de microplacas de 96 poços de ligação do ADN de membrana impermeável (Figura 2).

1. Prepara-se uma suspensão de neutrófilos em meio de ensaio (HBSS +1% (v / v) + glucose no soro autólogo a 5 mM) a uma concentração de 2 X 10 ⁶ células / ml.
2. Adicionar 5 umol / L de corante a membrana impermeável de ligação de ADN. Misture delicadamente.
3. neutrófilos humanos alíquota (50 pL / cavidade) em 96 cavidades, de fundo transparente preto microplacas. Certifique-se o meio de ensaio cobre a totalidade do fundo do poço. Se não, toque ligeiramente a placa do lado.
4. Aquecer a placa contendo neutrófilos durante 10 min a 37 ° C.
5. Nesse meio tempo preparar soluções de estímulos com o dobro de suas concentrações finais a ser utilizado (em C meio de ensaio quente 37 °). Como um controlo positivo NET usar neutrófilos humanos com 100 nM de forbol-miristato-acetato (PMA), durante 4 horas para desencadear liberação líquida máxima. ^5,8 PMA estimulação durante 4 horas garante a liberação NET máxima enquanto a formação NET espontânea permanece baixa ^5,8.
6. Prepara-se o fluorímetro de microplacas durante a medição (4 h, 37 ° C, 530 nm para excitação e 590 nm para emissão).
7. Estimulam os neutrófilos através da adição de solução de 50 ul de estímulo para 50 ul de suspensões de neutrófilos. Use 0,5 ug / ml de saponina em um poço para medir sinal de liberação DNA máxima.
8. Coloque placa no leitor e medir as mudanças na fluorescência durante 4 horas a cada 2 min sem agitação.
9. Para análise de dados, calcular o aumento normalizado na fluorescência ao longo do tempo.
   1. Linha de base de fluorescência Subtrair os valores de ponto final para todos os poços incluindo saponina (Figura 2A, B). Aumento na fluorescência saponina deve ser o sinal mais alto. Ele é referido como "libertação máxima de ADN" (Figura 2A).
   2. Calcular as percentagens de libertação de ADN em amostras desconhecidas dividindo aumentos na fluorescência de amostras desconhecidas por libertação máxima de ADN.
   3. Média de resultados de repetições e apresentá-los como "% de libertação de DNA máxima" (Figura 2C).

3. Quantificação do Formulário NETção por MPO-ADN e ADN-HNE ensaios ELISA

Nota: Estes ensaios (MPO-DNA) modificado ou estabelecida (HNE-DNA) em nosso laboratório quantificar formação NET medindo os níveis de MPO-DNA e complexos de DNA-HNE ^5.

1. Revestimento de 96 poços de alta capacidade de ligação de placas de ELISA durante a noite com anticorpos de captura (50 uL / ​​poço): anti-MPO (1: 2000 de diluição) ou anti-HNE (1: 2000).
2. Lavagem ELISA placas três vezes com PBS (200 ul / poço) e bloqueá-los com 5% de BSA e 0,1% de albumina de soro humano durante 2 horas à temperatura ambiente (200 ul / poço). Lavar três vezes com PBS.
3. neutrófilos das sementes sobre microplacas de 96 poços a uma densidade de 100.000 células / poço em 100 ul de meio de ensaio, e estimular a formação de rede. Incubar as células: 4 horas para 37 ° C.
4. Realizar uma digestão DNase limitada por adição de 2 U / ml DNase para sobrenadantes de neutrófilos, misture bem. Mantê-los à temperatura ambiente.
5. Pare a ADNase após 15 min por adição de 11 uL de EGTA 25 mM (concentração final 2,5 mM). Misture bem. Recolha supernatants em tubos de microcentrífuga limpo. amostras de rotação para se livrar de detritos de células a 300 xg por 5 min a RT. Transferir os seus sobrenadantes para tubos de microcentrífuga limpo. Mantê-los em gelo até estar pronta.
6. Use uma alíquota de uma previamente preparado "padrão NET".
   Nota: O NET-padrão é uma mistura de sobrenadante digerido-DNase de neutrófilos PMA-estimuladas obtidas a partir de pelo menos 5 diferentes doadores humanos, independentes.
   1. Para usar o mesmo padrão para um longo período de tempo, recolher e aliquotar um grande volume de sobrenadantes de neutrófilos a partir de cada um dos doadores. Recolha de, por exemplo, 2 ml de sobrenadantes digeridos DNase de neutrófilos estimulados com PMA-resultará em alíquotas de 200 (10 ul cada) suficiente para 200 placas de ELISA. Os dados que caracterizam o padrão NET são encontrados na Figura 5.
   2. Estimular a neutrófilos humanos com 100 nM PMA durante 4 horas e aplicar DNase digerir a seus sobrenadantes de acordo passos 3,4-3,5.
   3. Recolha, piscina, alíquota (10 ul) e livreze sobrenadantes (-20 ° C) de neutrófilos.
   4. Para preparar o "NET-padrão", descongelar uma alíquota / doador obtido a partir de pelo menos cinco doadores diferentes, misturá-los e mantê-los no gelo.
   5. Descarte amostras descongeladas e usar os frescos para o próximo experimento.
   6. Prepare uma diluição 1: serial 2 do NET-padrão em PBS + EGTA.
7. Diluir as amostras digeridas (DNase1-padrão e desconhecidos) sobrenadantes de 20 vezes em PBS + EGTA e aliquotar-los em placas de ELISA revestidas com anticorpos de captura.
8. Incubar as placas de ELISA durante a noite a 4 ° C e lava-se três vezes com PBS.
9. Aplicar a solução anticorpo de detecção (100 ul / poço): peroxidase de rabanete anticorpo anti-ADN cavalo conjugado (1: 500, de ratinho). Incubar durante 1 hora no escuro.
10. Depois de quatro lavagens com PBS, adicionar substrato de peroxidase TMB: 100 ul / poço, 30 min. coloração azul é uma indicação de atividade da peroxidase (redes presentes).
11. Parar a reacção pela adição de 100 ul / poço de HCl 1 M. osoluções azuis ficará amarela (Figura 5A).
12. Ler a absorvância a 450 nm usando um fotómetro de microplacas.
13. Para análise dos dados, calcular a quantidade de MPO-DNA ou complexos de DNA-HNE comparação com o padrão NET.
    1. Subtrair o valor de densidade óptica de fundo do meio de ensaio de todas as amostras.
    2. Traçar os valores de absorvância (eixo X) de amostras-padrão diluído contra o seu conteúdo líquido relativa (eixo Y) (Figura 5A).
    3. Utilizando a gama nonsaturated desta curva padrão estabelecer uma linha de tendência (usar melhor ajuste exponencial a partir do software utilizada) (Figura 5A). A equação desta linha de tendência determina a conversão dos valores de DO para quantitativos quantidades de redes.
    4. Insira os valores de DO medidos das incógnitas na equação da linha de tendência de 3.13.3 que vai dar a quantidade de redes na amostra desconhecida em percentagem do NET-padrão (Figura 5A).
    5. Calcularmédias de repetições (triplicado) e apresentar os dados finais como "quantidade de MPO-DNA ou complexos de DNA-HNE (% do normal)" (Figura 5c).

Resultados

Os números desta manuscrito descrever o método de isolamento de neutrófilos, procedimentos experimentais e apresentar resultados representativos com explicação da análise dos dados. A Figura 1 mostra as etapas sequenciais de preparação de neutrófilos humanos. Este protocolo representa apenas uma forma possível de isolamento de neutrófilos. Ela produz grandes quantidades de neutrófilos que descansa capazes de libertar rede sobre a estimulação. A Figu...

Discussão

NET representar um novo mecanismo fascinante pelo qual neutrófilos matar agentes patogênicos. ¹ Embora a literatura de redes tem sido continuamente expandindo ao longo dos últimos dez anos desde a sua descoberta, várias questões importantes relacionadas com o seu papel na biologia, mecanismo e regulação permanecem obscuras. metodologia adequada tem de ser desenvolvido para medir a NET, esse mecanismo antimicrobiano muito original. Este artigo descreve métodos que podem ser utilizados para quantificar ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)	Millipore	07-496	1:2,000x coated
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon Microplate Spectrophotometer	Biotek
Gen5 All-in-One microplate software	Biotek		analytical tool (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0.2% final concentration/volume
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Use 10 mM final concentration.
1 M glucose	Sigma		Use 5 mM final concentration.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
ELISA Plate	Greiner bio-one	655061
Conical tubes 15 ml	Thermoscientific	339650
Conical tubes 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8.5-9.5)	Sigma	P 1644	Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 media	Corning Cellgro	17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom	Costar	3603