Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Zusammenfassung

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Zusammenfassung

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation.

Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

Einleitung

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.¹ The core of NETs is nuclear DNA.¹ This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.¹ The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.² NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.^3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release.

Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.^3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.¹ Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.¹ MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.^1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.² NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).⁶ Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.⁶

Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

Protokoll

Die Institutional Review Board der University of Georgia genehmigt das menschliche Subjekt Studie peripheren Blut von gesunden Freiwilligen (UGA # 2012-10769-06) zu sammeln. ^5,7,8 Freiwilligen unterzeichnet die erforderliche Einverständniserklärung vor der Blutentnahme. Die Forschung in diesem Artikel ausgeführt ist in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien für die medizinische Forschung am Menschen von der Deklaration von Helsinki.

1. Isolierung von Neutrophilen aus peripherem menschlichem Blut (Figur 1)

Hinweis: Es gibt mehrere Möglichkeiten, Neutrophile aus peripherem Blut zu isolieren. Das folgende Protokoll stellt eine Möglichkeit. Dieses Protokoll liefert eine große Anzahl von nicht-aktivierten menschlichen Neutrophilen der Lage NETs auf externe Stimulation freigesetzt wird. Verwenden Sie 40 ml Vollblut von gesunden Freiwilligen durch Venenpunktur. ^7,9

1. Aliquotieren 20 ml Blut in zwei 50 ml konischen Röhrchen. 10 ml 6% Dextran. Vorsichtig mischen.
2. Nach 20 min Transfer der Leukozyten-rich obere Phase ohne pelle roten Blutkörperchen in saubere 50 ml konische Röhrchen nehmen, und füllen Sie es mit sterilem PBS auf.
3. Zentrifuge bei 400 xg 10 min. Pellet in 4 ml sterilem PBS.
4. Bereiten Sie einen 5-stufigen Percollgradienten von 85% -80% -75% -70% -65% in zwei 15 ml konischen Röhrchen und Schicht 2 ml Leukozyten-Suspension auf der jeweils Gradienten.
5. Zentrifuge 800 × g für 30 min mit Bremsen aus.
6. Sammle alle Zellen (Neutrophile) in den Schichten an der 75% / 80% und 70% / 75% Schnittstelle.
7. Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS (350 · g, 10 min, RT) und zählen Zellen eine Zählkammer.

2. Messung der Kinetik der extrazellulären DNA Veröffentlichung Mit Hilfe eines Mikroplatten-Fluorimeter

Hinweis: Diese Methode ermöglicht die Messung von Veränderungen in der Fluoreszenz eines membran impermeable DNA-bindenden Farbstoff anzeigt DNA Freisetzung auf einer 96-Well - Mikrotiterplatten - Format (Abbildung 2).

1. Eine Suspension von Neutrophilen in Testmedium (HBSS +1% (v / v) autologem Serum + 5 mM Glucose) bei einer Konzentration von 2 x 10 ⁶ Zellen / ml.
2. Werden 5 & mgr; mol / L der Membran undurchlässig DNA-bindenden Farbstoff. Vorsichtig mischen.
3. Aliquotieren humanen Neutrophilen (50 & mgr; l / Vertiefung) auf 96-Well-schwarz, transparenten Boden Mikrotiterplatten. Stellen Sie sicher, dass das Testmedium den gesamten Boden des Bohrlochs erstreckt. Wenn nicht, tippen Sie auf die Platte vorsichtig auf die Seite.
4. Warm up die Platte, die Neutrophile für 10 min bei 37 ° C.
5. In der Zwischenzeit werden die Lösungen von Reizen auf das Doppelte ihrer endgültigen Konzentrationen eingesetzt werden (in 37 ° C warmen Testmedium). Als ein positives Nettosteuer menschliche Neutrophilen mit 100 nM Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) für 4 Stunden nutzen , um eine maximale NET Freisetzung auslösen. ^5,8 PMA - Stimulation für 4 Stunden sorgt für maximale NET Freisetzung während spontane NET Bildung niedrig ^5,8 bleibt.
6. Bereiten Sie die Mikrotiterplatte Fluorimeter für die Messung (4 Stunden, 37 ° C, 530 nm zur Anregung und 590 nm für Emission).
7. Neutrophile stimuliert durch Zugabe von 50 & mgr; l Reizlösung auf 50 ul Neutrophilen Suspensionen. Verwenden Sie 0,5 ug / ml Saponin in einem gut maximale DNA-Freigabesignal zu messen.
8. Legen Sie die Platte in Leser und messen Veränderungen in der Fluoreszenz für 4 Stunden bei jeder 2 min ohne Schütteln.
9. Für die Datenanalyse berechnen normalisierten Erhöhungen der Fluoreszenz über die Zeit.
   1. Subtract Fluoreszenzbasis von Endpunktwerte für alle Vertiefungen einschließlich Saponin (2A, B). Aufstieg in Saponin Fluoreszenz sollte das höchste Signal sein. Es wird als "maximale DNA - Freigabe" (2A) bezeichnet.
   2. Berechnen Prozentsatz der DNA-Freisetzung in unbekannten Proben durch einen Anstieg der Fluoreszenz von unbekannten Proben durch maximale DNA-Freisetzung zu teilen.
   3. Durchschnittliche Ergebnisse der Replikate und präsentieren sie als "% der maximalen DNA - Release" (Abbildung 2C).

3. Die Quantifizierung von NET-Formularation von MPO-DNA und HNE-DNA-ELISA-Assays

Hinweis: Diese Assays modifiziert (MPO-DNA) oder etablierte (HNE-DNA) in unserem Labor NET Bildung Quantifizieren von Niveaus von MPO-DNA und HNE-DNA - Komplexe Messung ^5.

1. Mantel 96-well hohe Bindungskapazität ELISA-Platten über Nacht mit Fänger-Antikörper (50 & mgr; l / Well): anti-MPO (1: 2000 Verdünnung) oder anti-HNE (1: 2000).
2. Wasch ELISA Platten dreimal mit PBS (200 ul / Vertiefung) und blockieren sie mit 5% BSA und 0,1% humanes Serumalbumin für 2 h bei RT (200 ul / Vertiefung). Wasche dreimal mit PBS.
3. Seed Neutrophilen auf 96-well Mikrotiterplatten in einer Dichte von 100.000 Zellen / Well in 100 & mgr; l Assay-Medium und NET Bildung stimulieren. Inkubiere Zellen: 4 h 37 ° C.
4. Führen Sie eine begrenzte DNase-Verdau durch Zugabe von 2 U / ml DNase Neutrophilen Stände, mischen sie gut. Halten Sie diese bei RT.
5. Stoppen Sie die DNase nach 15 Minuten durch Zugabe von 11 & mgr; l 25 mM EGTA (Endkonzentration 2,5 mM). Gut mischen. Sammeln Sie supernatants in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Spin-Proben bei 300 × g für 5 min bei RT loszuwerden Zelldebris zu werden. Bringen Sie ihre Stände in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie sie auf Eis, bis sie bereit.
6. Verwenden Sie einen aliquoten Teil einer zuvor hergestellten "NET-Standard".
   Hinweis: Die NET-Standard ist eine Mischung aus DNase-verdauten Überständen von PMA-stimulierten neutrophilen Granulozyten, die aus mindestens 5 verschiedenen, unabhängigen menschlichen Spendern.
   1. Um den gleichen Standard für eine lange Zeit, zu sammeln und ein großes Volumen an neutrophilen Stände von jedem einzelnen Spender aliquotieren. Sammeln zum Beispiel 2 ml DNase-verdauten Überständen von PMA-stimulierten Neutrophilen werden in 200 Aliquots (10 ul jeweils) genug für 200 ELISA-Platten führen. Die Daten der NET - Standard kennzeichnen , sind in Abbildung 5 gefunden.
   2. Stimulieren menschliche Neutrophilen mit 100 nM PMA für 4 Stunden und gelten DNase nach Schritten, um ihre Überstände verdauen 3,4-3,5.
   3. Sammeln, Pool, Aliquot (10 ul) und kostenlosze (-20 ° C) neutrophil Überständen.
   4. Zur Herstellung der "NET-Standard", Tauwetter ein Aliquot / Spender aus mindestens fünf verschiedenen Spendern erhalten, mischen sie und halten sie auf dem Eis.
   5. Entsorgen Sie aufgetauten Proben und frische für den nächsten Versuch verwenden.
   6. Bereiten Sie eine 1: 2 serielle Verdünnung des NET-Standard in PBS + EGTA.
7. Verdünnen Sie DNase1-verdauten Proben (Standard und unbekannte Stände) 20-fach in PBS + EGTA und aliquotieren sie auf ELISA-Platten mit Fänger-Antikörper beschichtet.
8. Inkubieren ELISA-Platten über Nacht bei 4 ° C und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
9. Bewerben Detektions-Antikörper-Lösung (100 & mgr; l / Well): Meerrettich-Peroxidase-konjugierter anti-DNA-Antikörper (1: 500, Maus). Inkubieren für 1 Stunde in Dunkelheit.
10. Nach vier Waschungen mit PBS TMB Peroxidasesubstrat hinzufügen: 100 & mgr; l / Vertiefung, 30 min. Blaue Färbung ist ein Indiz für die Peroxidase-Aktivität (NETs vorhanden).
11. Stop Reaktion durch Zugabe von 100 ul / Vertiefung 1 M HCl. Dasblau Lösungen gelb (5A) drehen.
12. Lesen Sie die Absorption bei 450 nm im Mikrotiterplatten-Photometer.
13. Für die Datenanalyse, die Berechnung der Menge an MPO-DNA oder HNE-DNA-Komplexe im Vergleich zu dem NET-Standard.
    1. Ziehen Sie den Hintergrund Wert der optischen Dichte des Testmediums aus allen Proben.
    2. Zeichnen Sie die Absorptionswerte (X-Achse) der verdünnten Standardproben gegen ihren Nettogehalt (Y-Achse) (5A).
    3. Mit dem nicht gesättigten Bereich dieser Standardkurve eine Trendlinie etablieren (beste exponentielle Anpassung der Software verwendet wird ) (5A). Die Gleichung dieser Trendlinie bestimmt die Umwandlung von OD-Werte Mengen von NETs quantitativ.
    4. Legen Sie die gemessenen OD - Werte der Unbekannten in den Trend-Linie Gleichung von 3.13.3, die die Menge von NETs in der unbekannten Probe als Prozentsatz des Netto-Standard (5A) geben wird.
    5. BerechnenMittelwerte von Replikaten (dreifacher Ausführung) und die endgültigen Daten als "Menge an MPO-DNA oder HNE-DNA - Komplexe ( in % der Norm)" (5C) präsentieren.

Ergebnisse

Die Zahlen in diesem Manuskript die Methode der Neutrophilen - Isolierung, experimentelle Verfahren beschreiben und präsentieren repräsentative Ergebnisse mit Erklärung der Datenanalyse. Abbildung 1 die aufeinanderfolgenden Schritte der humanen neutrophilen Vorbereitung zeigt. Dieses Protokoll stellt nur eine mögliche Art der Neutrophilen-Isolation. Es ergibt große Mengen an Neutrophilen freisetzen kann , NETs bei Stimulierung ruht. 2 zeigt , wie di...

Diskussion

NETs stellen eine faszinierende neuartige Mechanismus , durch den Erreger Neutrophilen töten. ¹ Obwohl die Literatur von NETs hat den letzten zehn Jahren den Ausbau über kontinuierlich seit ihrer Entdeckung, einige wichtige Fragen zu ihrer Rolle im Zusammenhang mit der Biologie, Mechanik und Regelung unklar bleiben. Entsprechende Methodik entwickelt werden NETs zu messen, diese einzigartigen antimikrobiellen Mechanismus. Dieser Artikel beschreibt Verfahren, die verwendet werden können NETs in einem Hochdur...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)	Millipore	07-496	1:2,000x coated
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon Microplate Spectrophotometer	Biotek
Gen5 All-in-One microplate software	Biotek		analytical tool (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0.2% final concentration/volume
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Use 10 mM final concentration.
1 M glucose	Sigma		Use 5 mM final concentration.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
ELISA Plate	Greiner bio-one	655061
Conical tubes 15 ml	Thermoscientific	339650
Conical tubes 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8.5-9.5)	Sigma	P 1644	Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 media	Corning Cellgro	17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom	Costar	3603