High Throughput Mesure de l&#39;ADN extracellulaire de sortie et quantitative Formation NET dans les neutrophiles humains<em&gt; In vitro</em

Résumé

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Résumé

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation.

Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

Introduction

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.¹ The core of NETs is nuclear DNA.¹ This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.¹ The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.² NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.^3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release.

Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.^3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.¹ Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.¹ MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.^1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.² NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).⁶ Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.⁶

Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

Protocole

Le Conseil de l'Université de Géorgie Institutional Review a approuvé l'étude sur des sujets humains pour recueillir le sang périphérique de volontaires sains (UGA N ° 2012-10769-06). ^5,7,8 bénévoles ont signé le formulaire de consentement éclairé nécessaire avant le prélèvement de sang. La recherche effectuée dans cet article est en conformité avec les directives éthiques pour la recherche médicale impliquant des sujets humains de la Déclaration d'Helsinki.

1. Isolement des cellules neutrophiles du sang périphérique humain (Figure 1)

Remarque: Il existe plusieurs façons d'isoler les neutrophiles du sang périphérique. Le protocole suivant fournit une possibilité. Ce protocole donne un grand nombre de neutrophiles non activés humains capables de libérer les TNE lors d'une stimulation externe. Utilisez 40 ml de sang total obtenu à partir de volontaires sains par ponction veineuse. ^7,9

1. Aliquoter 20 ml de sang en deux 50 ml tubes coniques. Ajouter 10 ml de 6% de dextran. Mélanger délicatement.
2. Après 20 min de transfert leucocyte-rich phase supérieure sans prendre de globules rouges sédimentées dans 50 ml propres tubes coniques, et le remplir avec du PBS stérile.
3. Centrifugeuse à 400 g 10 min. Resuspendre le culot dans 4 ml de PBS stérile.
4. Préparer une 5 étape de gradient de Percoll 85% -80% -75% -70% -65% dans deux tubes de 15 ml coniques et la couche leucocytaire 2 ml de suspension au-dessus de chaque gradient.
5. Centrifugeuse 800 xg pendant 30 min avec freins hors.
6. Recueillir toutes les cellules (neutrophiles) dans les couches à 75% / 80% et 70% d'interface / 75%.
7. Laver les cellules deux fois dans du PBS (350 x g, 10 min, RT) et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.

2. Mesure de la cinétique de l'ADN extracellulaire édition à l'aide d'une microplaque fluorimètre

Remarque: Cette méthode permet de mesurer des changements dans la fluorescence d'une membrane imperméable à l' ADN se liant à un colorant indiquant la libération d' ADN dans un format de microplaque à 96 puits (figure 2).

1. Préparer une suspension de neutrophiles dans le milieu de dosage (HBSS +1% (v / v) de sérum autologue + 5 mM de glucose) à une concentration de 2 x 10 ⁶ cellules / ml.
2. Ajouter 5 umol / L de l'imperméable colorant liant l'ADN membranaire. Mélanger délicatement.
3. neutrophiles humains aliquotes (50 pl / puits) sur 96 puits noir, fond transparent microplaques. Assurez-vous que le milieu d'essai couvre la totalité du fond du puits. Sinon, appuyez doucement la plaque sur le côté.
4. Réchauffez la plaque contenant des neutrophiles pendant 10 min à 37 ° C.
5. En attendant de préparer des solutions de stimuli à deux de leurs concentrations finales à utiliser (en 37 ° C milieu d'essai chaud). En tant que contrôle positif NET utiliser neutrophiles humains avec 100 nM phorbol-myristate-acétate (PMA) pendant 4 heures pour déclencher NET libération maximale. ^5,8 PMA stimulation pendant 4 heures assure NET libération maximale tandis que la formation NET spontanée reste faible ^5,8.
6. Préparer fluorimètre à microplaques pour la mesure (4 h, 37 ° C, 530 nm pour l'excitation et 590 nm pour l'émission).
7. Stimulez neutrophiles en ajoutant une solution de relance de 50 pi à 50 pi suspensions de neutrophiles. Utiliser 0,5 pg / ml de saponine dans un puits pour mesurer le signal maximal ADN de libération.
8. Placer la plaque dans le lecteur et mesurer les changements dans la fluorescence pendant 4 heures à toutes les 2 min sans agitation.
9. Pour l'analyse des données, calculer les augmentations normalisées de fluorescence au fil du temps.
   1. Soustraire base de fluorescence à partir des valeurs d'extrémité pour tous les puits , y compris la saponine (figure 2A, B). Hausse de la fluorescence de la saponine devrait être le signal le plus élevé. Il est appelé « la libération d'ADN maximale" (Figure 2A).
   2. Calculer les pourcentages de libération d'ADN dans des échantillons inconnus en divisant l'augmentation de la fluorescence d'échantillons inconnus par la libération d'ADN maximale.
   3. Les résultats moyens de répétitions et les présentent comme "% de la libération d'ADN maximal" (figure 2C).

3. Quantification du formulaire NETtion par FTU-ADN et ADN-HNE analyses ELISA

Remarque: Ces tests (MPO-ADN) modifiés ou (HNE-ADN) établie dans notre laboratoire de quantifier la formation NET en mesurant les niveaux de MPO-ADN et complexes ^ADN-5 HNE.

1. Manteau de 96 puits à haute capacité de liaison des plaques ELISA pendant une nuit avec des anticorps de capture (50 pl / puits): anti-MPO (1: 2000 dilution) ou anti-HNE (1: 2000).
2. Laver les plaques ELISA à trois reprises avec du PBS (200 ul / puits) et les bloquer avec 5% de BSA et 0,1% d'albumine de sérum humain pendant 2 heures à la température ambiante (200 ul / puits). Laver trois fois avec du PBS.
3. neutrophiles de semences sur microplaques de 96 puits à une densité de 100.000 cellules / puits dans 100 milieu d'essai de pi, et stimuler la formation NET. Incuber les cellules: 4 h pour 37 ° C.
4. Effectuer une digestion DNase limitée par addition de 2 U / ml de DNase à surnageants de neutrophiles, mélangez-les bien. Gardez-les à température ambiante.
5. Arrêter la DNase après 15 min par addition de 11 ul de 25 mM d'EGTA (concentration finale 2,5 mM). Bien mélanger. Collecter susurnageants dans des tubes de microcentrifugation propres. échantillons de spin pour se débarrasser des débris de cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante. Transférer leurs surnageants dans des tubes de microcentrifugation propres. Gardez-les sur de la glace jusqu'au moment.
6. Utilisez une aliquote d'un "standard NET" préparé précédemment.
   Remarque: Le NET-standard est un mélange de surnageants de DNase digéré de neutrophiles stimulées par PMA obtenues à partir d'au moins 5 différents, donneurs humains indépendants.
   1. Pour utiliser la même norme pour une longue période, recueillir et aliquoter un volume important de surnageants de neutrophiles de chaque donateur individuel. Collecte par exemple 2 ml de surnageants de DNase digéré de neutrophiles stimulées par PMA se traduira par 200 aliquotes (10 pi chacun) suffisamment pour 200 plaques ELISA. Les données caractérisant la norme NET se trouvent dans la figure 5.
   2. Stimulez neutrophiles humains avec 100 nM PMA pendant 4 heures et appliquer DNase digérer à leurs surnageants selon les étapes 3,4-3,5.
   3. Collecter, piscine, aliquote (10 pi) et libreLes surnageants ze (-20 ° C) de neutrophile.
   4. Pour préparer le "NET-standard", décongeler un aliquote / donneur obtenu à partir d'au moins cinq bailleurs de fonds distincts, les mélanger et de les garder sur la glace.
   5. Jeter les échantillons décongelés et d'utiliser les frais pour l'expérience suivante.
   6. Préparer une dilution 1: série 2 du NET-standard dans PBS + EGTA.
7. Diluer les échantillons DNase1 digérées (standard et inconnus) surnageants 20 fois dans du PBS + EGTA et les aliquoter sur des plaques ELISA revêtues d'anticorps de capture.
8. Incuber plaques ELISA pendant la nuit à 4 ° C et les laver trois fois avec du PBS.
9. Appliquer une solution d'anticorps de détection (100 pl / puits): peroxydase de raifort conjuguée à un anticorps de cheval anti-ADN (1: 500, souris). Incuber pendant 1 heure dans l'obscurité.
10. Après quatre lavages avec du PBS ajouter substrat de peroxydase TMB: 100 ul / puits, 30 mn. La coloration bleue est une indication de l'activité de la peroxydase (filets présents).
11. Arrêter la réaction en ajoutant 100 pl / puits de 1 M HCl. lesolutions bleues deviennent jaunes (figure 5A).
12. Mesurer l'absorbance à 450 nm en utilisant un photomètre de microplaques.
13. Pour l'analyse des données, calculer la quantité de MPO-ADN ou des complexes ADN-HNE par rapport à la norme NET.
    1. Soustraire la valeur de densité optique de base du milieu d'essai de tous les échantillons.
    2. Tracer les valeurs d'absorbance (axe X) des échantillons standards dilués contre leur contenu NET relative (axe Y) (figure 5A).
    3. Utilisation de la gamme de cette courbe non saturé norme établit une ligne de tendance (utiliser le meilleur ajustement exponentielle à partir du logiciel utilisé) (figure 5A). L'équation de cette ligne de tendance détermine la conversion des valeurs de DO quantitatifs quantités de TNE.
    4. Insérez les valeurs de DO mesurées des inconnues dans l'équation ligne de tendance à partir de 3.13.3 qui donnera la quantité de TNE dans l'échantillon inconnu en pourcentage du NET-standard (figure 5A).
    5. Calculermoyennes des répétitions (triplicats) et présenter les données finales comme «quantité de MPO-ADN ou des complexes ADN-(HNE% de la norme)" (Figure 5C).

Résultats

Les chiffres de ce manuscrit décrivent le procédé d'isolement des cellules neutrophiles, les procédures expérimentales et présentent des résultats représentatifs avec l' explication de l' analyse des données. La figure 1 montre les étapes successives de préparation neutrophile humaine. Ce protocole représente qu'une seule façon possible de l'isolement des neutrophiles. Il donne de grandes quantités de repos neutrophiles capables de libé...

Discussion

EVF représentent un nouveau mécanisme fascinant par lequel les neutrophiles tuer les agents pathogènes. ¹ Bien que la littérature de TNE a connu une expansion continue au cours des dix dernières années , depuis leur découverte, plusieurs questions importantes liées à leur rôle dans la biologie, le mécanisme et la réglementation demeurent obscures. Une méthodologie appropriée doit être développée pour mesurer les TNE, ce mécanisme antimicrobien unique. Cet article décrit des procédés qui p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)	Millipore	07-496	1:2,000x coated
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon Microplate Spectrophotometer	Biotek
Gen5 All-in-One microplate software	Biotek		analytical tool (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0.2% final concentration/volume
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Use 10 mM final concentration.
1 M glucose	Sigma		Use 5 mM final concentration.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
ELISA Plate	Greiner bio-one	655061
Conical tubes 15 ml	Thermoscientific	339650
Conical tubes 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8.5-9.5)	Sigma	P 1644	Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 media	Corning Cellgro	17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom	Costar	3603