使用非整合附加型质粒从冷冻血沉棕黄层诱导多能干细胞的产生

摘要

诱导多能干细胞（iPS细胞）代表的患者特异性组织为临床应用和基础研究的来源。在这里，我们提出了一个详细的协议来重新编程从冷冻棕黄色大衣将获得使用非整合游离病毒质粒无iPSCs的人外周血单个核细胞（外周血单个核细胞）。

摘要

体细胞可以通过迫使四个转录因子（Oct-4的，SOX-2，KLF-4，和c-Myc）的表达重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞），通常由人类胚胎干细胞中表达（胚胎干细胞） 。由于它们的相似性与人类胚胎干细胞，iPS细胞已成为潜在的患者特异性再生医学的重要工具，避免了与人类胚胎干细胞相关的伦理问题。为了获得适合于临床应用的细胞，转基因的无iPSCs的需要产生，以避免转基因激活，改变的基因表达和误导分化。此外，高效率的和廉价的重编程方法是必要的，以获得足够的iPSC用于治疗目的。鉴于这种需求，一个高效的非整合附加型质粒的方法是对的iPSC衍生的优选的选择。隔离，其中当前用于重编程的目的是最常见的细胞类型是成纤维细胞，需要组织活检，一个我nvasive外科手术的病人。因此，人外周血代表的iPSC一代最容易和最不侵入性组织。

在这项研究中，使用非整合附加型质粒具有成本效益和病毒 - 自由协议报从后全血离心分离，没有密度梯度分离从冷冻血沉棕黄层获得的人外周血单核细胞（外周血单个核细胞）的iPSCs的产生。

引言

在2006年，该基山中伸弥¹展示首次从成年小鼠和人类体细胞可以通过四种重编程因子（Oct-4的，SOX-2，KLF-4，和异位表达被转换成多能状态c-Myc的），产生了所谓的诱导多能干细胞（iPS细胞^）2。患者特异性的iPSC中的形态，增殖和分化成三胚细胞类型（中胚层，内胚层和外胚层）的能力方面非常类似于人类胚胎干细胞（胚胎干细胞），而缺乏相关的使用人类胚胎干细胞和旁路的伦理问题可能的免疫排斥反应^3。因此，iPS细胞表现为患者特异性的细胞为基础研究，药物筛选，疾病建模，毒性的评价，和再生医学的目的⁴的最重要来源之一。

几种方法已用于iPSC的生成:病毒整合载体（逆转录病毒^5，慢病毒^6），病毒非整合载体（腺病毒^7），仙台病毒^8，BAC座子^9，附加型载体^10，蛋白质¹¹或RNA递送^12。虽然使用病毒介导的方法可导致高效率的重编程，病毒载体整合到宿主细胞，因此潜在随机插入 ​​突变的基因组中，基因表达，和沉默的转基因的再活化的分化过程中的永久改变，不能排除^13。

使iPSCs的安全再生医学，已经作出努力来推导的iPSC未经外源DNA整合到细胞基因组中。虽然应纳税病毒载体和转座子被开发出来，它仍然是不清楚短载体序列，这不可避免地留在切除后的转导的细胞，和转座表达，是否可以诱导改变在细胞ular功能^13。尽管其高重编程效率，仙台病毒代表一种昂贵的方法，并达到通授权的关注与开发的这个系统必须限制其应用在翻译研究的潜力公司。此外，需要对直接引入蛋白质和RNA的需要多个递送重新编程分子的固有技术局限性此介绍的，和总重编程效率是非常低的^14。值得注意的是，具有成本效益的基础上，利用附加型质粒的病毒-自由和非整合的方法已被成功地报道了皮肤成纤维细胞¹⁵的再编程。具体而言，在本工作中，我们决定使用市售集成无附加型质粒，如先前报道^10,15。

迄今为止，皮肤成纤维细胞代表了最流行 ​​施主小区类型^5。然而，其他细胞来源已经更迭sfully重编程为iPS细胞包括角质形成细胞^16，骨髓间充质干细胞^17，脂肪基质细胞^18，毛囊¹⁹与牙髓细胞^20。这些细胞的分离，需要外科手术，并以建立原代细胞培养，需要在体外细胞扩增几个星期。

有鉴于此，起始细胞类型的选择是至关重要的，但同样重要的是能够从方便和较少侵入性的组织，例如血液产生的iPSC。两个脐带血单核细胞^{（CBMNCs）21,22}和外周血单核细胞（外周血单个核细胞^）14,22-24表示细胞为iPS细胞的推导合适来源。

虽然成人PBMNC重编程的效率比CBMNCs ²²的低20-50倍，它们仍然是最方便的细胞类型为取样目的。在事实上，PBMNC取样有被微创的优点，此外，这些细胞不需要重新编程实验之前在体外广泛扩展。迄今为止，不同的协议已经报道，密度梯度分离后外周血单个核细胞可冷冻后冷冻和解冻天至数月并重新编程成iPS细胞^22,23之前膨胀为几天。然而，就我们所知没有报道描述从冷冻的血沉棕黄层外周血单个核细胞的重编程。重要的是，没有密度梯度分离收集冷冻棕黄色大衣代表存储在从人口研究大型生物库，从而代表材料的生产的iPSC以避免进一步的样品采集的方便池中最常见的血液样本。

此处我们报告首次病毒无iPSCs的产生来自人类冷冻血沉棕黄层，根据先前描述的方案^22。在此外，从密度梯度分离之后得到的冷冻外周血单个核细胞生成的iPSCs，对于非密度梯度纯化PBMNC结果的控制协议。

研究方案

外周血单个核细胞（外周血单个核细胞）后，从签署知情同意书和南蒂罗尔省的伦理委员会批准献血者健康人外周血标本中分离。实验是按照在表达赫尔辛基宣言的原则进行。所有的数据收集和分析了匿名。

1.分离外周血单个核细胞（外周血单个核细胞）

1. 从全血中离心后的血沉棕黄层获得外周血单个核细胞，没有密度梯度分离。
   1. 收集8毫升静脉外周血成柠檬酸钠缓冲的塑料管，并储存在室温（25℃）。在采集后12小时过程血。
   2. 离心管中，在2000×g离心15分钟，在4℃下，在吊桶式转子，开关关闭离心机刹车。
   3. 收集阴天棕黄层（上层血浆相和下之间的层相含有大部分的红细胞），将含有富集的PBMNC级分（500微升）到离心管筒。
   4. 悬浮500μl的棕黄层用500μl含有90％FBS和20％DMSO的2×冷冻介质中，在为了得到1毫升，用10％的DMSO浓度的总体积。
   5. 冻结在受控速率冷冻容器小瓶在-80℃下。商店细胞在液氮中更长时间。
2. 密度梯度分离后获得外周血单个核细胞
   1. 收集12ml含静脉外周血成柠檬酸钠缓冲的塑料管，并储存在室温。在采集后12小时过程血。
   2. 稀释血液用无菌PBS以35 ml的终体积。
   3. 小心缓慢，层35毫升稀释血液15毫升多聚蔗糖溶液（用于密度梯度分离）（p值= 1.077）在50ml锥形管（比率3:1）。
   4. 离心管中，在800×g离心在室温30分钟在吊桶式转子，开关关闭离心机刹车。
   5. 吸上，含血浆黄相并丢弃。仔细，含有外周血单个核细胞的不透明白色相间层转移到新的50ml锥形管中。
   6. 将总体积至30ml用无菌PBS和离心机在300×g离心在室温10分钟。
   7. 弃上清，重悬细胞用30ml PBS中。计数活细胞的数目，根据台盼蓝排除^25。
   8. 离心机外周血单个核细胞在300×g离心10分钟，在室温，吸出上清液，并丢弃它。
   9. 重悬细胞沉淀在含有90％FBS和10％DMSO的冷冻介质的一个合适的量，以获得5×10 ⁶个细胞/ ml的浓度。
   10. 等分试样1毫升每小瓶（约5×10 ⁶个细胞/ ml）并冷冻小瓶在受控速率冷冻集装箱- 80℃。商店细胞在液氮中更长时间。

   2.解冻和外周血单个核细胞的电镀（0天）

   1. 从全血中离心后的血沉棕黄层获得外周血单个核细胞，没有密度梯度分离。
      1. 开始使用从冷冻血沉棕黄层外周血单个核细胞的协议，解冻1小瓶细胞在水浴中在37℃和稀释的血沉棕黄层用无菌PBS至2ml的最终体积。
      2. 传送稀释的血沉棕黄层到50毫升锥形管，加入10毫升红细胞裂解缓冲液，孵育在室温10分钟。
      3. 而制成500毫升红细胞裂解缓冲液，加入0.5克碳酸氢钾，4.145克氯化铵，100微升的0.5M EDTA溶液至500ml的超纯水，pH值7.2-7.4。
      4. 将总体积至50ml用无菌PBS和离心机在300×g离心在室温10分钟。
      5. 弃去上清液，并用50ml无菌PBS洗涤沉淀，离心血沉棕黄层，在300×g离心在室温10分钟。
      6. 悬浮细胞中1毫升PBMNC介质，如前所述^22，组成:IMDM和火腿的F-12（比例为1:1），胰岛素-转铁-硒-乙醇胺（ITS-X），经化学为1％的1％定义脂质浓缩（CDL），1％青霉素/链霉素，L-抗坏血酸酸0.005％，牛血清白蛋白（BSA）的0.5％，1-硫代甘油（终浓度都是200μM），干细胞因子SCF（100毫微克/毫升），白细胞介素-3，IL-3（10毫微克/毫升），促红细胞生成素的EPO（2单位/毫升），胰岛素样生长因子IGF-1（40毫微克/毫升），地塞米松（1μM）和全息转铁蛋白（100μg/ ml的）。
      7. 他们转移到一个12孔板用标准组织培养处理过的表面的一个孔，无涂层，以2×10 ⁶个细胞/ ml的密度。孵育细胞在37℃，5％CO ₂的加湿培养箱中48小时，直到变换媒体的步骤（见第3节）。
   2. 密度梯度分离后获得外周血单个核细胞
      1. 要使用冷冻的外周血单个核细胞后启动协议密度梯度分离，解冻1小瓶细胞在水浴中在37℃下，转移细胞到5毫升PBMNC培养基。离心在300×g离心在室温10分钟。
      2. 重悬细胞于1ml PBMNC培养基中，并将它们转移到一个12孔板的一个孔，以2×10 ⁶个细胞/ ml的密度。孵育细胞在37℃，5％CO ₂的加湿培养箱中48小时，直到变换媒体的步骤（见第3节）。

   3.文化与扩张外周血单个核细胞的（2-13天）

   1. 收集外周血单个核细胞在悬浮培养中，用移液管以1毫升尖，在15ml锥形管中并离心，在300×g离心在室温10分钟。
   2. 弃去上清液并将细胞重新悬浮在1ml新鲜的外周血单个核细胞培养基。
   3. 转移细胞进入1井的12孔板用标准组织培养处理过的表面，没有涂布，并孵育它们在37℃，5％CO ₂的加湿培养箱。
   4. 重复这些步骤，每两天，和分裂细胞的比例1:当他们到达汇合适当（80％左右）2。

   4.转染外周血单个核细胞与附加型质粒（第14天）

   注意:执行四个商业intergation无游离型质粒的分离，使用商业试剂盒进行质粒纯化携带的多能性基因和评估使用琼脂糖凝胶电泳分析纯化的质粒的质量，根据制造商的说明。

   1. 收集在15ml锥形管中外周血单个核细胞并计数活细胞的数量^25（台盼蓝排斥的基础上）。
   2. 离心机2×10 ⁶个细胞，在300×g离心在室温10分钟。
   3. 重悬2×10 ⁶个细胞在含有100微升的再悬浮缓冲液T和各1μg质粒DNA转染混合物（一个质粒携带OCT3 / 4和shRNA抗p53，一个质粒携带SOX2和KLF4，人们质粒携带的L- MYC和LIN28和一种质粒携带绿色荧光蛋白，以检查转染效率）。
   4. 吸含有细胞的转染混合物加入100微升尖端和插入与样品垂直插入管中，填充用3ml电解缓冲液的E2，置于电穿孔机的吸移管站的移液管，按制造商的说明。
   5. 使用以下程序有效电穿孔细胞:1650伏，10毫秒，3个脉冲。
   6. 重悬电穿孔的细胞（2×10 ⁶个细胞）于2ml预热PBMNC培养基中，加入0.25毫丁酸钠（NAB）和计数存活细胞的电穿孔规程后的数字^25（台盼蓝排斥的基础上）。
   7. 转移细胞到6孔板的一个孔中无涂层，轻轻摇动平板孵育所述细胞在37℃，5％CO ₂的加湿培养箱。
   8. 电穿孔，COUN后的第二天吨GFP阳性细胞的荧光显微镜下从8-10随机字段的数量，以评估转染效率。
   9. 维持转染的细胞不分裂为3天，直到镀它们的MEF（参见第6节）。
   10. 代替加入2ml新鲜外周血单个核细胞培养基，再加0.25毫酸钠每两天。

   5.准备菜肴馈线细胞共培养（16天）

   1. 外套一个6孔板用1ml基底膜基质的15分钟的，在37℃和板小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）以2×10 ⁵个细胞的密度/孔用2毫升10％FBS的含有孔DMEM（MEF中）1天传代电外周血单个核细胞到MEF饲养细胞之前。

   6.镀染外周血单个核细胞上的MEF（17-19天）

   1. 收集悬浮培养外周血单个核细胞，用移液管与1ml尖，在15ml锥形管中，并离心转染外周血单个核细胞在300×g离心10分钟在RT。
   2. 弃上清，重悬沉淀在2ml新鲜PBMNC介质，加上0.25mM的丁酸钠。
   3. 板上的细胞上的MEF涂覆的6孔板孵育所述细胞在37℃，5％CO ₂的加湿培养箱。
   4. 两天后，吸出培养基并用2ml的iPSC介质的敲除DMEM（KO-DMEM），20％KO-血清替代（KOSR），1mM的NEAAs，1％青霉素/链霉素，20mM的组成取代的L-谷氨酰胺，0.1mM的β巯基乙醇，10纳克/毫升的FGF（基本的bFGF）和0.25毫酸钠。
   5. 更换每天上午2毫升新鲜的iPSC中，每天检查的细胞。
      注:在大约22-25天，iPS细胞的第一殖民地应该是可见的。

   7.采摘和扩张诱导多能干细胞的（iPS细胞）克隆（30-35天）

   注:在转染后约30-35天，菌落的iPSC应准备好采摘和replating。重编程效率应ESTI配合作为的iPSC集落/电穿孔的细胞的总数量的数量的百分比，如先前报道^26。

   1. 传代的iPSC集落的前一天，制备MEF饲养在12孔板（1.25×10 ⁵个细胞/孔）。
   2. 吸的MEF培养基，改变用1mL的iPSC培养基用10ng / ml的bFGF和10μM的Y-27632。手动用针一个菌落，以获得栅格解剖在采摘机罩的解剖显微镜下，每次，通过移液收集较小的块和每个单独的转移成的12孔板涂覆的MEF一个阱。
   3. 通道和扩展每个12孔板到6孔板中的比率为1:2，然后每6孔板中的比率1:进一步传播4。解剖和手动展开的iPSC用于第一2-3代（如在步骤7.2中全面描述），然后用一种酶分解过程（从步骤7.4启动）。
   4. 对于酶分解协议，干净的iPSC科洛尼ES通过吸差异部分，在采摘机罩的解剖显微镜下。
   5. 孵育的iPSC用1mlⅣ型胶原酶（1毫克/毫升）10分钟，在37℃。
   6. 吸酶溶液冲洗细胞用1ml KO-DMEM中并收集菌落在15ml锥形管中。离心，在100×g离心在室温2分钟。
   7. 吸出上清，重悬在2ml的iPSC介质的菌落用10ng / ml的bFGF和10μM的Y-27632和板他们在MEF涂覆的6孔板（比率1:4）。

   iPS细胞的表征8.（5-15之间代）

   1. 碱性磷酸酶染色
      1. 培养中的iPSC介质3-5天的的iPSC集落用10ng / ml的bFGF。
      2. 用于开始碱性磷酸酶染色方案，冲洗的iPSC一次用PBS，然后修复它们用1ml 4％PFA的20分钟，室温。
      3. 用PBS洗细胞三次，以去除残留的PFA。
      4. 使用染色固定的细胞根据制造商的说明商用碱性磷酸酶染色试剂盒。
   2. 免疫荧光
      1. 培养中的iPSC介质3-5天的的iPSC集落用10ng / ml的bFGF。
      2. 启动免疫荧光测定法中，用PBS洗涤一次的iPSC，然后修复它们用1ml 4％PFA的20分钟，在室温。
      3. 用PBS洗细胞三次，以去除残留的PFA。
      4. 对待固定的iPSC用1ml透化/阻挡含有4％山羊血清，0.1％BSA，0.1％的Triton X-100和0.05％叠氮化钠溶液（NaN ₃的）处理1小时，在室温。
      5. 吸出封闭溶液并孵育固定的细胞用3％BSA的第一抗体和0.05％NaN ₃的溶液O / N在4℃（检查一次抗体列表的材料表和建议的抗体稀释因子）。
      6. 第二天，洗涤的iPSC三次，用PBS，然后孵育细胞的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠和Alexa FLUOR 555山羊抗兔抗体，稀释1:1000中的3％BSA和0.05％NaN ₃的溶液，1小时，在37℃。
      7. 染色用DAPI（1微克/毫升）的原子核在室温10分钟在黑暗中，接着是三个时间用PBS清洗。
   3. 在胚体iPS细胞分化（EBS）
      1. 培养中的iPSC介质5-6天的iPSC集落用10ng / ml的bFGF。
      2. 通过抽吸去除的iPSC菌落差异的部分，在采摘机罩的解剖显微镜下。
      3. 孵育的iPSC用1mlⅣ型胶原酶（1毫克/毫升）10分钟，在37℃。
      4. 吸酶溶液冲洗细胞用1ml KO-DMEM中并收集菌落在15ml锥形管中。离心，在100×g离心在室温2分钟。
      5. 吸出上清，重悬菌落在2ml KO-DMEM中组成的EB培养基中，20％的定义胎牛血清（FBS），1毫NEAAs，1％青霉素/链霉素，20mM的L-谷氨酰胺，0.1毫46;巯基乙醇。
      6. 板中的悬浮液中6天的iPSC集落到超低附件6孔板中，为了使球状三维胚体（EB）的形成。变化2毫升新鲜EB培养基每两天。
      7. 在第7天，收集EB中和板他们到0.1％明胶包被的6孔板的2ml的EB培养基中，并在分化维持胚20天。
      8. 变化2毫升新鲜EB培养基每两天。
   4. 定量RT-PCR基因表达分析
      1. 培养中的iPSC介质5-6天的iPSC集落用10ng / ml的bFGF。
      2. 提取外周血单个核细胞，iPS细胞或胚使用按照制造商的说明1毫升商业试剂总RNA。
      3. 评估RNA的浓度和纯度通过合适的方法，如使用分光光度计（高品质的RNA用A ₂₆₀ / A ₂₈₀和A ₂₆₀ / A比值_230> ^1.8）27。
      4. 检查使用根据制造商的协议（高品质的RNA RQI> ^9.5）28商业试剂盒的RNA完整性。
      5. 执行使用根据制造商的说明商用逆转录试剂盒1微克总RNA进行逆转录反应。
      6. 制备含5毫微克cDNA模板，7.5微升SYBR Green超，2微升5μM引物的qPCR的混合物（前锋:1微升和反向:1微升）和6微升RNA酶/ DNA酶的水每个反应^29。
      7. 使用以下程序进行的qRT-PCR:起始变性步骤，在95℃进行10分钟，然后是40个循环分成一个变性步骤在95℃下15秒，引物退火和延伸步骤在60℃进行45秒^29。
      8. 正常化使用GAPDH作为管家基因²⁸的其它基因的表达（ 见表1中所列的引物）。
   5. 定量PCR对于转基因排除
      1. 使用将1ml含有50mM Tris，100毫摩尔EDTA，100毫摩尔NaCl，裂解缓冲液外周血单个核细胞或iPS细胞提取的DNA的1％十二烷基硫酸钠（SDS）和20微克/ ml的蛋白酶K.
      2. 加100％的异丙醇等量的（1毫升）中，以允许沉淀DNA，离心在10,000rpm×g离心5分钟，在室温颠倒混合三次。
      3. 弃去上清液，用1毫升70％乙醇和离心机以10,000×g离心洗DNA沉淀进行5分钟，在室温。吸弃上清，重悬它核糖核酸酶/ DNA酶的水。
      4. 评估DNA浓度和纯度通过合适的方法，如使用分光光度计（高品质的RNA用A ₂₆₀ / A ₂₈₀和A ₂₆₀ / A比值_230> ^1.8）27。
      5. 制备含5毫微克的DNA模板，7.5微升SYBR Green超，2微升5μM引物的qPCR的混合物（前锋:1微升和反向:1微升）和6＃181;微升RNA酶/ DNA酶的水用于每个反应^29。
      6. 正常化具体游离质粒EBNA-1基因的使用FBX-15作为持家基因^29（参照表1中所列的引物）的表达。
   6. 核型分析
      1. 文化的iPSC菌落5-6天到无饲养基底膜基质涂板定义的商业，无饲养维修中的iPS细胞，按照生产商的说明。
      2. 要启动的核型分析协议，分离的iPSC集落用1ml细胞脱附溶液中5分钟，在37℃，直到获得单细胞解离。
      3. 收集细胞，离心，在400×g离心5分钟，在RT。
      4. 重悬的iPSC在2ml培养基中专门为进行产前诊断技术培养细胞的发展。板单细胞到iPSCs的基底膜基质镀 ​​膜玻璃的菜肴，并培育他们在37℃，5％CO _{2 <}/ SUB>孵化器。
      5. 后2-4天，直接添加10微升/毫升秋水仙碱到培养并在培养箱孵育3小时，在37℃，5％的CO _2。
      6. 吸出培养基并孵育的iPSC在1ml的低渗溶液（0.6％的柠檬酸钠和0.13％氯化钾），用于在室温下10分钟。
      7. 冲洗细胞用1ml 5％乙酸溶液和修复的iPSC用甲醇/乙酸溶液（比率3:1）中的机器具有受控温度和湿度（28℃，42％RH）。
      8. 浸泡和染色固定的细胞15-20分钟在黑暗阿的溶液在室温（获得Q-带^）30。
      9. 在获得放大100倍²⁹在荧光显微镜下的细胞分裂中期。

结果

在这项研究中的简单而有效的协议，用于病毒无iPSCs的由外周血单个核细胞从全血中离心分离和密度梯度分离报道后获得外周血单个核细胞的重新编程，比较后冷冻的血沉棕黄层中分离的重编程的产生。 图1A示出的示意图详细的协议。解冻后，分离的外周血单个核细胞，显示出典型的圆形形状，在特定的血液培养基中14天（ 图1B）展开，然后转染了附加型质粒。经过10-15天...

讨论

在过去，只有这样才能获得携带特定遗传变异的人类多能干细胞是招募家长进行胚胎植入前遗传学诊断，并产生从他们丢弃的囊胚^31,32胚胎干细胞。使用方法重新编程，研究人员现在可以生成携带几乎所有的基因型患者iPS细胞。的可能性，以从患者的特定细胞系就易于访问的源是非常重要的，因为它允许病症的病理生理学和随后鉴定的新的治疗方法的研究。

在本研究?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube	Terumo	VF-054SBCS07
Ammodium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Potassium bicarbonate	Sigma-Aldrich	60339
EDTA disodium powder	Sigma-Aldrich	E5134	0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)	Gibco	21056-023	No phenol red
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)	Gibco	51500-056	1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031	1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)	PeproTech	300-07	100 ng/ml (Stock:100 µg/ml)
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)	PeproTech	200-03	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)	PeproTech	100-11	40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin	R&D Systems	2914-HT	100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II	Gibco	11269016	Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1	StemCell Technologies	5850	Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010	0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa	R&D Systems	4114-TC	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503	10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum	Hyclone	SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Merck-Millipore	ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230
Collagenase, Type IV	Gibco	17104-019	1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007	Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)	Global Stem	GSC-6201G	1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK	Addgene	27078	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL	Addgene	27080	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP	Addgene	27082	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit	Stemgent	00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody	Merck-Millipore	MAB4304	1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody	Merck-Millipore	MAB4360	1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody	Merck-Millipore	MAB4381	1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-9081	1/500
Anti-Nanog Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-33759	1/500
Anti-Troponin I Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-15368	1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody	Sigma-Aldrich	A7732	1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody	Covance Research Products Inc	MMS-435P-100	1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Calbiochem	657012	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse	Molecular Probes	A-11029	1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit	Molecular Probes	A-21429	1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate	Corning	3471
Trizol Reagent	Ambion	15596-018	reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Invitrogen	11754050	Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	185-5195
Experion Automated Electrophoresis System	Bio-Rad	700-7000	Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit	Bio-Rad	7007105	Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )	Zeiss	495007
NeonTransfection System 100 µl Kit	Invitrogen	MPK10025	Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit