JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) представляют собой источник конкретного пациента тканей для клинического применения и фундаментальных исследований. Здесь мы представляем подробный протокол для перепрограммирования человека мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs), полученные из замороженных лейкоцитарных пленок в вирусные свободной ИПСК с использованием не-интегрирующие Эписомные плазмиды.

Аннотация

Соматические клетки могут быть перепрограммированы в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), заставляя экспрессией четырех транскрипционных факторов (OCT-4, Sox-2, КФК-4 и C-Myc), как правило, выражается человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) , Из-за их сходства с ЭСК, иПСК стали важным инструментом для потенциальных пациентов конкретных регенеративной медицины, избегая этические вопросы, связанные с ЭСК. Для того чтобы получить клетки, пригодные для клинического применения, трансгенные свободной иПСК должны быть сгенерированы, чтобы избежать трансгена реактивации экспрессии измененного гена и неправильно дифференциацию. Кроме того, очень эффективный и недорогой способ перепрограммирования необходимо получить достаточные ИПСК для терапевтических целей. Учитывая эту потребность, эффективность неинтегрирующих подход эписомными плазмида предпочтительно выбором для IPSC выводе. В настоящее время наиболее распространенный тип батарей, используемых для целей перепрограммирования фибробласты, изоляция которых требуется биопсия тканей, яnvasive хирургическая процедура для пациента. Таким образом, в периферической крови человеческой представляет собой наиболее доступный и наименее инвазивный ткани для производства IPSC.

В этом исследовании, протокол экономически эффективным и вирусно-бесплатно с помощью неинтегрирующих Эписомные плазмиды сообщается для генерации ИПСК из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs), полученных из замороженных лейкоцитарных пленок после центрифугирования крови всего и без градиента плотности разделения.

Введение

В 2006 году группа Шинья Яманака 1 продемонстрирована впервые, что соматические клетки взрослых мышей и человека может быть преобразован в плюрипотентных государства эктопической экспрессии четырех перепрограммирования факторов (октябрь-4, Sox-2, КФК-4, и C-Мус), генерации так называемых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) 2. Конкретного пациента иПСК напоминают человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) в терминах морфологии, распространения и способности различать в трех типов зародышевых клеток-(мезодерма, энтодермы и эктодермы), а не хватает этические проблемы, связанные с использованием ЭСК и обход возможно иммунное отторжение 3. Таким образом, иПСК в качестве одного из самых важных источников конкретного пациента клетки для фундаментальных исследований, скрининга наркотиков, моделирования заболевания, оценки токсичности и регенеративной медицины целей 4.

Несколько подходы были использованы для генерации IPSC: вирусные векторы, интегрирующие(Ретровирус 5, лентивирус 6), вирусный без учета векторов (аденовирус 7), Сендай-вирус 8, 9 ВАС транспозонов, эписомные векторы 10, белки 11 или доставка РНК 12. Хотя использование вирусных опосредованной методов может привести к высокой эффективности перепрограммирования, вирусные векторы интеграции в геном клеток-хозяев и, следовательно, потенциальным случайным инсерционного мутагенеза, постоянное изменение экспрессии генов, и реактивации молчащих трансгенов во время дифференцировки не может быть исключена 13.

Чтобы сделать более безопасным иПСК для регенеративной медицины, были предприняты усилия для получения ИПСК без интеграции экзогенной ДНК в клеточных геномов. Хотя подакцизных вирусные векторы и транспозоны были разработаны, до сих пор неясно ли короткие последовательности вектора, которые неизбежно остаются в трансдуцированных клеток после удаления, и транспозазы выражение, может вызвать изменение в клеткеулар функционировать 13. Несмотря на высокую эффективность перепрограммирования, вирус Сендай представляет собой дорогостоящий подход и сквозные проблемы лицензирования с компанией, которая разработала эту систему есть потенциал, чтобы ограничить его применение в трансляционных исследований. Кроме того, необходимость прямого введения белков и РНК требует многократного перепрограммирования доставку молекул с присущими технических ограничений Это вносит, и общая эффективность перепрограммирование очень низкая 14. Следует отметить, что рентабельные вирусные свободные и неинтегрирующих методы, основанные на использовании Эписомные плазмид успешно отчиталась за перепрограммирования фибробластов кожи 15. В частности, в настоящей работе мы решили использовать коммерческие доступные интеграции, свободной Эписомные плазмиды, как сообщалось ранее 10,15.

На сегодняшний день, фибробласты кожи представляют собой наиболее популярный тип донорских клеток 5. Тем не менее, другие источники клеток были Successfully перепрограммировать в ИПСК, включая кератиноциты 16, костного мозга мезенхимальных стволовых клеток жировой, 17 стромальных клеток 18, волосяных фолликулов 19, и пульпа клетки 20. Выделение таких клеток требуется хирургических процедур, и через несколько недель, необходимых для расширения в пробирке клеток для того, чтобы установить первичной культуры клеток.

В этом свете, выбор, начиная тип клеток имеет решающее значение, и это в равной степени важно, чтобы иметь возможность производить ИПСК из легко доступных и менее инвазивных тканей, таких как кровь. Оба одноядерные клетки пуповинной крови (CBMNCs) 21,22 и мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs) 14,22-24 представляют подходящие источники клеток для вывода ИПСК.

Хотя эффективность взрослого PBMNC перепрограммирования 20-50 раз ниже, чем у CBMNCs 22, они остаются наиболее удобным типом клеток для целей отбора проб. ВДело в том, выборки PBMNC имеет то преимущество, что минимально инвазивных, и, кроме того, эти клетки не требуют экстенсивного расширения в пробирке Перед перепрограммированием экспериментов. На сегодняшний день, различные протоколы сообщили, что после разделения PBMNCs градиента плотности могут быть заморожены и разморожены дней до нескольких месяцев после замораживания и расширена в течение нескольких дней, прежде чем перепрограммирования в ИПСК 22,23. Тем не менее, насколько нам известно, никаких сообщений не описано перепрограммирование PBMNCs из замороженных лейкоцитарных пленок. Важно отметить, что замороженные охристые пальто, собранные без разделения в градиенте плотности представляют собой наиболее общие образцы крови, хранящиеся в крупных биобанках из популяционных исследований, тем самым обеспечивая легкодоступный бассейн материала для производства IPSC, чтобы избежать дальнейшего сбора образца.

В этом мы сообщаем впервые поколение вирусных свободной ИПСК из замороженных лейкоцитарных пленок человека, на основе ранее описанной протокола 22. ВКроме того, иПСК были получены из замороженных PBMNCs, полученных после разделения в градиенте плотности, как протокол управления для градиента плотности не очищенных результатов PBMNC.

протокол

Мононуклеарных клеток крови (PBMNCs) были выделены из периферической крови человека здоровых доноров после подписанных информированное согласие и одобрение этического комитета провинции Южный Тироль. Эксперименты были проведены в соответствии с принципами, выраженными в Хельсинкской декларации. Все данные были собраны и проанализированы анонимно.

1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs)

  1. PBMNCs получены из лейкоцитарных пленок после центрифугирования всей крови, без разделения в градиенте плотности.
    1. Собирают 8 мл венозной периферической крови в буферный цитрат натрия пластиковую трубку, и хранить при комнатной температуре (25 ° C). Процесс в крови в пределах 12 ч после сбора.
    2. Центрифуга трубки на 2000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С в роторе ковша поворотной, отключение центрифуги тормоза.
    3. Соберите облачно Баффи пальто (слой между верхней фазе плазмы и нижефазу, содержащую большую часть эритроцитов), содержащий обогащенный PBMNC фракцию (500 мкл) в криопробирку трубки.
    4. Ресуспендируют в 500 мкл светлого сгустка крови с 500 мкл 2x морозильной среде, содержащей 90% FBS и 20% ДМСО, чтобы получить общий объем 1 мл 10% -ной концентрации ДМСО.
    5. Замораживание в пузырек с контролируемой скоростью замораживания контейнера при -80 ° С. Храните ячейки в жидком азоте в течение более длительных периодов.
  2. PBMNCs, полученный после отделения градиента плотности
    1. Соберите 12 мл венозной периферической крови в цитрат натрия буфером пластиковую трубку, и магазин при комнатной температуре. Процесс в крови в пределах 12 ч после сбора.
    2. Развести крови с стерильной PBS до конечного объема 35 мл.
    3. Осторожно и медленно, слой 35 мл разбавленной крови на 15 мл раствора (polysucrose, используемой для разделения в градиенте плотности) (р = 1,077) в 50 мл коническую пробирку (соотношение 3: 1).
    4. Центрифуга трубки при 800 х г в течение 30 мин при комнатной температуре вротора ведро размахивая, отключение центрифуги тормоза.
    5. Аспирируйте верхний, желтый фазы, содержащей плазму и отбросить его. Осторожно, передать непрозрачный белый слой, содержащий межфазный PBMNCs к новому 50 мл коническую трубку.
    6. Доведите общий объем до 30 мл с стерильной PBS и центрифугировать при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    7. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 30 мл PBS. Подсчитайте число жизнеспособных клеток, основанный на трипанового синего 25.
    8. Центрифуга PBMNCs в 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре, аспирата супернатант и отбросить его.
    9. Ресуспендируют осадок клеток в соответствующем количестве морозильной среде, содержащей 90% FBS и 10% ДМСО, чтобы получить концентрацию 5 × 10 6 клеток / мл.
    10. Аликвоты по 1 мл на флакон (около 5 × 10 6 клеток / мл) и заморозить в пузырек с контролируемой скоростью замораживания контейнер в - 80 ° С. Храните ячейки в жидком азоте в течение более длительных периодов.

    2. Размораживание и покрытие из PBMNCs (день 0)

    1. PBMNCs получены из лейкоцитарных пленок после центрифугирования всей крови, без разделения в градиенте плотности.
      1. Чтобы начать, используя протокол PBMNCs из замороженных лейкоцитарных пленок, оттаивать 1 флакона клеток в водяной бане при 37 ° С и разбавляют слой светлого сгустка крови стерильной PBS до конечного объема 2 мл.
      2. Передача поглощающее покрытие разбавленного в 50 мл коническую пробирку, добавляют 10 мл буфером для лизиса эритроцитов и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.
      3. Для приготовления 500 мл буфером для лизиса эритроцитов, добавляют 0,5 г бикарбоната калия, 4,145 г хлорида аммония добавляют 100 мкл 0,5 М ЭДТА в 500 мл сверхчистой воды, рН 7.2-7.4.
      4. Доведите общий объем до 50 мл с стерильной PBS и центрифугировать при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
      5. Жидкость над осадком сливают и промывают осадок с 50 мл стерильной PBS, центрифугируют поглощающее покрытие при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
      6. Ресуспендируют клеток в1 мл PBMNC среды, как описано ранее 22, состоящий из: IMDM и Хэма F-12 (отношение 1: 1), 1% инсулина трансферрина-Селен-этаноламина (ITS-X), 1% химического состава липидов концентрат (КДЛ), 1% пенициллина / стрептомицина, 0,005% от L-аскорбиновой кислоты, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1-Тиоглицерин (конечная концентрация 200 мкМ), фактор стволовых клеток SCF (100 нг / мл), интерлейкин -3 IL-3 (10 нг / мл), эритропоэтин (EPO 2 ед / мл), инсулиноподобный фактор роста IGF-1 (40 нг / мл), дексаметазон (1 мкМ) и голограмма-трансферрина (100 мкг / мл ).
      7. Передача их в одну лунку 12-луночного планшета со стандартной тканевой культуры обрабатываемой поверхности, без покрытия, при плотности 2 × 10 6 клеток / мл. Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе в течение 48 ч, до тех пор, изменяющейся средней ступени (см раздел 3).
    2. PBMNCs, полученный после отделения градиента плотности
      1. Чтобы начать протокол, используя замороженные PBMNCs послеГрадиент плотности разделения, оттепели 1 флакон клеток в водяной бане при 37 ° С, передачи клеток в 5 мл среды PBMNC. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
      2. Ресуспендируют клеток в 1 мл среды PBMNC и передавать их в одну лунку 12-луночного планшета при плотности 2 × 10 6 клеток / мл. Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе в течение 48 ч, до тех пор, изменяющейся средней ступени (см раздел 3).

    3. Культура и расширение PBMNCs (ДЕНЬ 2-13)

    1. Сбор PBMNCs в суспензионной культуре, с помощью пипетки с наконечником в 1 мл, в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    2. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 1 мл свежей среды PBMNC.
    3. Передача клеток в 1 лунке 12-луночного планшета со стандартной тканевой культуры обрабатываемой поверхности, без покрытия, и инкубируют их при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
    4. Повторите эти действия каждые два дня, и разделить клетки в соотношении 1: 2, когда они достигают соответствующего слияния (около 80%).

    4. Трансфекция PBMNCs с Эписомные плазмид (день 14)

    Примечание: Выполнение изоляции из четырех коммерческих услуг интеграции, свободной Эписомные плазмид, несущих гены плюрипотентности с помощью коммерческого набора для очистки плазмиды и оценить качество очищенных плазмид с использованием анализа в агарозном геле, в соответствии с инструкциями изготовителя.

    1. Сбор PBMNCs в 15 мл коническую пробирку и подсчитывают количество жизнеспособных клеток (на основе трипанового синего) 25.
    2. Центрифуга 2 × 10 6 клеток на 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
    3. Ресуспендируют 2 х 10 6 клеток в трансфекции смеси, содержащей 100 мкл буфера ресуспендирования T и 1 мкг каждого плазмиды ДНК (плазмида, несущая один Oct3 / 4 и shRNA против р53, один плазмида, несущая SOX2 и KLF4, одинплазмида, несущая L-MYC и Lin28, и один плазмида, несущая EGFP, чтобы проверить эффективность трансфекции).
    4. Аспирируйте трансфекции смесь, содержащую клетки в мкл кончика 100 и вставьте пипетку с образцом вертикально в трубку, заполненную 3 мл электролитического буфера Е2, размещенных в пипетки станции электропорации машины, в соответствии с инструкциями изготовителя.
    5. Эффективно электропорации клетки, используя следующую программу: 1650 В, 10 мс, 3 импульса.
    6. Ресуспендируют электропорации клетки (2 х 10 6 клеток) в 2 мл подогретого PBMNC среды, добавляя 0,25 мМ натрий бутират (NAB) и подсчитывают количество жизнеспособных клеток после электропорации протокола (на основе трипанового синего) 25.
    7. Передача клеток в одну лунку 6-луночного планшета с без покрытия, осторожно встряхнуть пластину и инкубировать клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
    8. День после электропорации, страт количество GFP-положительных клеток при флуоресцентной микроскопии с 8-10 случайных полей, с тем чтобы оценить эффективность трансфекции.
    9. Поддерживать трансфицированных клеток без разделения на 3 дня, пока покрытие их на MEFs (см раздел 6).
    10. Замените 2 мл свежей среды PBMNCs, плюс 0,25 мм наб каждые два дня.

    5. готовить блюда с фидерной клеток для совместного культивирования (день 16)

    1. Шерсть лунки 6-луночного планшета с 1 мл базальной мембраны матрицы в течение 15 мин при 37 ° С и пластины эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) при плотности 2 х 10 5 клеток / лунку с 2 мл 10% FBS, содержащейся DMEM (МЭФ среда) за один день до пассажей электропорации PBMNCs на MEF фидерных клеток.

    6. Покрытие трансфицированных PBMNCs на MEFs (ДЕНЬ 17-19)

    1. Сбор PBMNCs в суспензионной культуре, с помощью пипетки 1 мл наконечником, в 15 мл коническую трубку центрифуги и трансфицировали PBMNCs при 300 х г в течение 10 минпри комнатной температуре.
    2. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 2 мл свежего PBMNC среды, плюс 0,25 мм наб.
    3. Пластина клеток на MEF покрытием 6 луночного планшета и инкубировать клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
    4. После двух дней, аспирация среды и заменить его с 2 мл IPSC среды, состоящей из нокаут DMEM (КО-DMEM), 20% КО-сыворотка Замена (KOSR), 1 мМ NEAAs, 1% пенициллина / стрептомицина, 20 мМ L- Глютамин, 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, 10 нг / мл FGF (основной оФРФ) и 0,25 мМ NAB.
    5. Замените 2 мл свежей среды IPSC каждый день, и проверить клетки ежедневно.
      Примечание: В 22-25 день, первые колонии ИПСК должны быть видны.

    7. сбора и расширения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) Клоны (ДЕНЬ 30-35)

    Примечание: В 30-35 дней после трансфекции, IPSC колонии должны быть готовы к комплектации и replating. Эффективность перепрограммирования должно быть Эстисоединяется как процент от количества колоний Ipsc / общее количество электропорации клеток, как сообщалось ранее 26.

    1. Накануне пассажей IPSC колонии, подготовить MEF подачи в 12-луночного планшета (1,25 х 10 5 клеток / лунку).
    2. Аспирируйте MEF средних и изменить с 1 мл IPSC среде с 10 нг / мл оФРФ и 10 мкМ Y-27632. Вручную рассекают с иглой одной колонии в каждый момент времени при вскрытии микроскопом в захватного капотом, чтобы получить сетку, собирать мелкие комки с помощью пипетки и передавать их по отдельности друг в одну лунку 12-луночного планшета, покрытого MEFs.
    3. Прохождение и расширение каждого 12-луночного планшета на 6-луночный планшет в соотношении 1: 2, а затем каждый 6-луночный планшет в соотношении 1: 4 для дальнейшего распространения. Проанализируйте и расширить ИПСК вручную в течение первых 2-3 проходов (как тщательно описано в шаге 7.2), а затем использовать процедуру фермент диссоциации (начните с шага 7.4).
    4. Для протокола фермент диссоциации, чистый IPSC колоныES аспирационных дифференцированные части, под микроскопом рассекает в подхвата капотом.
    5. Инкубируйте ИПСК 1 мл коллагеназы IV (1 мг / мл) в течение 10 мин при 37 ° С.
    6. Аспирируйте ферментного раствора, промыть клетки с 1 мл КО-DMEM и собирать колонии в 15 мл коническую трубку. Центрифуга при 100 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
    7. Аспирата супернатант, ресуспендируют колонии в 2 мл среды Ipsc с 10 нг / мл оФРФ и 10 мкМ Y-27632 и их на пластину MEF покрытием 6-луночный планшет (соотношение 1: 4).

    8. Характеристика ИПСК (5-15 Проходы)

    1. Щелочной фосфатазы Окрашивание
      1. Культура колонии IPSC в течение 3-5 дней в среде с IPSC 10 нг / мл оФРФ.
      2. Для запуска щелочной фосфатазы окрашивания протокол, промыть ИПСК один раз PBS, а затем исправить их 1 мл 4% PFA в течение 20 мин при комнатной температуре.
      3. Промыть клетки три раза с PBS, чтобы удалить остаточный PFA.
      4. Пятно фиксированные клетки, использующиекоммерческий щелочной фосфатазы окрашивания комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Иммунофлюоресценция
      1. Культура колонии IPSC в течение 3-5 дней в среде с IPSC 10 нг / мл оФРФ.
      2. Чтобы начать иммунофлуоресценции, мыть один раз с ИПСК PBS, а затем исправить их 1 мл 4% PFA в течение 20 мин при комнатной температуре.
      3. Промыть клетки три раза с PBS, чтобы удалить остаточный PFA.
      4. Treat фиксированные ИПСК 1 мл / проницаемости блокирующего раствора, содержащего 4% козьей сыворотки, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 и 0,05% азида натрия (NaN 3) в течение 1 ч при комнатной температуре.
      5. Аспирируйте блокирующий раствор и инкубировать фиксированные клетки с первичными антителами в 3% БСА и 0,05% NaN 3 Раствор O / N при 4 ° С (проверить материальное таблицу для списка первичных антител и антител предложено коэффициент разбавления).
      6. На следующий день, мыть ИПСК три раза PBS, а затем инкубируют клетки с Alexa Fluor 488 козьего анти-мышиного и Alexa FlУОР 555 козьих антител против кроличьего антитела, разведенного 1: 1000 в 3% БСА и 0,05% NaN 3 раствора, в течение 1 ч при 37 ° С.
      7. Пятно ядер с DAPI (1 мкг / мл) в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте и последующей промывки три раза с PBS.
    3. Дифференциация ИПСК в эмбриональных органов (ЭТ)
      1. Культура колонии IPSC в течение 5-6 дней в среде с IPSC 10 нг / мл оФРФ.
      2. Удалить дифференцированные части из IPSC колонии аспирационных под микроскопом рассекает в подхвата капотом.
      3. Инкубируйте ИПСК 1 мл коллагеназы IV (1 мг / мл) в течение 10 мин при 37 ° С.
      4. Аспирируйте ферментного раствора, промыть клетки с 1 мл КО-DMEM и собирать колонии в 15 мл коническую трубку. Центрифуга при 100 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
      5. Аспирата супернатант и ресуспендируют колонии в 2 мл EB среды, состоящей из KO-DMEM, 20%, определенной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1 мМ NEAAs, 1% пенициллина / стрептомицина, 20 мМ L-глутамина, 0,1 мМ46; -mercaptoethanol.
      6. Пластинчатый Ipsc колонии в суспензии в течение 6 дней на сверхнизких крепления 6-луночных планшетах, с тем чтобы обеспечить образование сфероидальных трехмерных эмбриональных телец (EBS). Изменить 2 мл свежей среды EB каждые два дня.
      7. На 7-й день, собирать ЭТ и пластины их на 0,1% желатином покрытием 6-луночных планшетах в 2 мл EB среды и поддерживать ЭТ в дифференцировке в течение 20 дней.
      8. Изменить 2 мл свежей среды EB каждые два дня.
    4. Qrt-ПЦР для анализа экспрессии генов
      1. Культура колонии IPSC в течение 5-6 дней в среде с IPSC 10 нг / мл оФРФ.
      2. Извлечение общую РНК из PBMNCs, ИПСК или ЭТ с использованием 1 мл коммерческой реагента в соответствии с инструкциями изготовителя.
      3. Оценка концентрации РНК и чистоту с помощью соответствующих методов, таких как использование спектрофотометра (высокое качество РНК с 260/280 и A 260 / A 230 коэффициентов> 1,8) 27.
      4. ПроверитьЦелостность РНК с использованием коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя (высокое качество РНК RQI> 9,5) 28.
      5. Выполнение реакции обратной транскрипции на 1 мкг общей РНК, используя коммерческий набор обратный транскриптазы в соответствии с инструкциями изготовителя.
      6. Подготовка смеси КПЦР содержали 5 нг матрицы кДНК, 7,5 мкл SYBR Green Supermix, 2 мкл 5 мкМ праймеров (вперед: 1 мкл и обратного: 1 мкл) и 6 мкл РНКазы / ДНКазы без воды для каждой реакции 29.
      7. Выполнение Qrt-ПЦР с использованием следующей программы: начальной стадии денатурации при 95 ° С в течение 10 мин с последующими 40 циклами, разделенных на стадии денатурации при 95 ° С в течение 15 сек и отжига праймеров и расширение шага при 60 ° С в течение 45 сек 29.
      8. Нормализация экспрессию других генов с использованием GAPDH в качестве гена 28 (см праймеров, перечисленных в таблице 1).
    5. КПЦРдля трансгенной отчуждения
      1. Экстракт ДНК из PBMNCs или токов с использованием 1 мл буфера для лизиса, содержащего 50 мМ Трис, 100 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 1% додецилсульфат натрия (SDS) и 20 мкг / мл протеиназы К.
      2. Добавить равный объем (1 мл) 100% изопропанола, перемешивают инверсией три раза, чтобы позволить осаждение ДНК и центрифуге при 10000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
      3. Жидкость над осадком сливают, мыть ДНК гранул с 1 мл 70% этанола и центрифугируют при 10000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте и отбросить супернатант и ресуспендируют его в РНКазы ДНКазы / без воды.
      4. Оценка концентрации ДНК и чистоту с помощью соответствующих методов, таких как использование спектрофотометра (высокое качество РНК с 260/280 и A 260 / A 230 коэффициентов> 1,8) 27.
      5. Подготовка смеси, содержащие КПЦР 5 нг ДНК-матрицы, 7,5 мкл SYBR Green Supermix, 2 мкл 5 мкМ праймеров (вперед: 1 мкл и наоборот: 1 мкл) и 6 &# 181; л РНКазы ДНКазы / без воды для каждой реакции 29.
      6. Нормализация экспрессии специфических эписомными плазмиды EBNA-1 гена с использованием FBX-15 в качестве гена 29 (см праймеров, перечисленных в таблице 1).
    6. Кариотип анализ
      1. Культура колонии IPSC в течение 5-6 дней на тарелку с покрытием фидерных бесплатно базальной мембраны матрицы с коммерческой определяется, подающего свободной поддерживающей среде для ИПСК, следуя инструкциям изготовителя.
      2. Чтобы начать протокол исследования кариотипа, не отделить Ipsc колонии с 1 мл раствора открепления клеток в течение 5 мин при 37 ° С, до получения одного диссоциации клеток.
      3. Собирают клетки и центрифуги при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
      4. Ресуспендируют иПСК в 2 мл среды, специально разработанный для культивирования клеток для пренатальной диагностики техники. Тарелка одноклеточные иПСК на базальной мембраны матричных покрытием стеклянной посуды и инкубировать их в 37 ° C, 5% СО 2 </ Суб> инкубатор.
      5. Через 2-4 дней, добавить 10 мкл / мл колхицина непосредственно к культурам и инкубируют в течение 3 ч при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
      6. Аспирируйте среду и инкубируют ИПСК в 1 мл гипотонического раствора (0,6% цитрата натрия и 0,13% хлорида калия) в течение 10 мин при комнатной температуре.
      7. Промыть клетки с 1 мл 5% раствора уксусной кислоты и исправить ИПСК смесью метанол / раствором уксусной кислоты (соотношение 3: 1) в машине с контролируемой температурой и влажностью (28 ° C, 42% RH).
      8. Погрузитесь и пятен фиксированной клетки с Акрихин решение для 15-20 мин при комнатной температуре в темноте (чтобы получить Q-полосы) 30.
      9. Приобретать клеток метафаз под флуоресцентным микроскопом при увеличении 100X 29.

Результаты

В этом исследовании простой и эффективный протокол для генерации свободных вирусных ИПСК по перепрограммированию PBMNCs выделенных из замороженных лейкоцитарных пленок после центрифугирования всей крови и по сравнению с перепрограммирования PBMNCs, полученных после разделения в градиен...

Обсуждение

В прошлом, единственным способом получения человеческих плюрипотентных стволовых клеток, несущих определенную генетическую мутацию, был завербовать родителей, перенесших доимплантационная генетическую диагностику и произвести эмбриональные стволовые клетки из бластоцисты их выб?...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic TubeTerumoVF-054SBCS07
Ammodium chlorideSigma-AldrichA9434
Potassium bicarbonateSigma-Aldrich60339
EDTA disodium powderSigma-AldrichE51340.5 M solution
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Life Sciences17-5442-02Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) Gibco21056-023No phenol red
Ham's F-12Mediatech10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)Gibco51500-056 1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid ConcentrateGibco119050311X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrateSigma-AldrichA8960
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)PeproTech300-07100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) 
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)PeproTech200-0310 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)PeproTech100-1140 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)R&D Systems 287-TC-5002 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone Sigma-AldrichD29151 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-TransferrinR&D Systems 2914-HT100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax IIGibco11269016Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1StemCell Technologies5850Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEMGibco10829-018
Knockout Serum ReplacementGibco10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122
L-Glutamine (200 mM)Gibco25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Gibco11140-050
2-Mercaptoethanol Gibco31350-0100.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium ButyrateSigma-AldrichB58870.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa R&D Systems 4114-TC10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochlorideSigma-AldrichY0503 10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine SerumHycloneSH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin SolutionMerck-MilliporeES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor ReducedBD Biosciences354230
Collagenase, Type IVGibco17104-0191 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
AccutasePAA Laboratories GmbHL11-007Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)Global StemGSC-6201G1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-FAddgene 270771 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSKAddgene 270781 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hULAddgene 270801 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFPAddgene 270821 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining KitStemgent00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) AntibodyMerck-MilliporeMAB43041/250
Anti-TRA-1-60 AntibodyMerck-MilliporeMAB43601/250
Anti-TRA-1-81 AntibodyMerck-MilliporeMAB43811/250
Anti-Oct-3/4 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-90811/500
Anti-Nanog AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-337591/500
Anti-Troponin I AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-153681/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) AntibodySigma-AldrichA77321/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) AntibodyCovance Research Products Inc MMS-435P-1001/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) AntibodyCalbiochem6570121/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Molecular ProbesA-110291/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-RabbitMolecular ProbesA-214291/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plateCorning3471
Trizol ReagentAmbion15596-018 reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitInvitrogen11754050Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad185-5195
Experion Automated Electrophoresis SystemBio-Rad700-7000Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kitBio-Rad7007105Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )Zeiss495007
NeonTransfection System 100 µl KitInvitrogenMPK10025Reagent kit for electroporation
Neon Transfection SystemInvitrogenMPK5000Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis SpectrophotometerThermo ScientificND-2000Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362Plasmid purification kit

Ссылки

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  3. Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
  4. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  9. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  12. Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
  13. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
  14. Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
  15. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  16. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  17. Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
  18. Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
  19. Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
  20. Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
  21. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  24. Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
  25. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
  26. Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
  27. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
  28. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
  29. Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
  30. Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
  31. Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
  32. Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
  33. Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
  34. Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
  35. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  36. Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

100

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены