Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

Resumo

Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais.

Resumo

Células somáticas pode ser reprogramada em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), forçando a expressão de quatro fatores de transcrição (Oct-4, Sox-2, Klf-4 e c-Myc), normalmente expressa por células-tronco embrionárias humanas (hESCs) . Devido à sua semelhança com hESCs, iPSCs tornaram-se uma ferramenta importante para o potencial de medicina regenerativa específica para cada paciente, evitando questões éticas associadas com hESCs. De modo a obter células adequadas para a aplicação clínica, iPSCs livre de transgenes precisam de ser gerado para evitar a reactivação do transgene, a expressão do gene alterada e diferenciação errada. Além disso, um método de reprogramação altamente eficiente e de baixo custo é necessário derivar iPSCs suficientes para fins terapêuticos. Tendo em conta esta necessidade, uma abordagem eficiente não-integração episomal plasmídeo é a melhor escolha para iPSC derivação. Actualmente, o tipo celular mais comum utilizado para fins de reprogramação são fibroblastos, o que requer o isolamento de biopsia de tecido, um invasive procedimento cirúrgico para o paciente. Portanto, sangue periférico humano representa o tecido mais acessível e menos invasivo para a geração da IPSC.

Neste estudo, um protocolo eficaz e viral livre usando não integrando plasmídeos epissomais é relatado para a geração de iPSCs a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados após a centrifugação de sangue total e sem separação de gradiente de densidade.

Introdução

Em 2006, o grupo de Shinya Yamanaka ¹ demonstraram pela primeira vez que as células somáticas de ratos e seres humanos adultos pode ser convertido para um estado pluripotente pela expressão ectópica de quatro factores de reprogramação (Oct-4, Sox-2, 4-Klf, e c-Myc), gerando as chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ^2. IPSCs específica para cada paciente se assemelham células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em termos de morfologia, proliferação e capacidade de se diferenciarem em tipos de células germinativas (três mesoderme, endoderme e da ectoderme), enquanto falta as preocupações de ordem ética associados à utilização de hESCs e ignorando possível rejeição imunológica ^3. Assim, iPSCs aparecer como uma das mais importantes fontes de células específicas do paciente para a pesquisa básica, a seleção da droga, modelagem de doença, avaliação de toxicidade e efeitos de medicina regenerativa ^4.

Várias abordagens têm sido utilizadas para a geração de iPSC: vectores de integração virais(Retrovírus ^5, lentivírus ^6), viral não-integração de vetores (adenovírus ^7), Sendai-vírus ^{8, 9} BAC transposons, vetores epissomais ^10, proteínas ¹¹ ou ¹² RNA entrega. Embora o uso de métodos mediada por vírus pode levar a uma alta eficiência de reprogramação, os vectores virais integrar-se no genoma das células hospedeiras e, por conseguinte, mutagénese de inserção aleatória potencial, alteração permanente da expressão do gene, e reactivação de transgenes silenciados durante a diferenciação não pode ser excluído ^13.

Para fazer iPSCs mais seguro para a medicina regenerativa, foram feitos esforços para derivar iPSCs sem a integração de DNA exógeno em genomas celulares. Embora os vectores virais ele sujeitos e transposões foram desenvolvidos, ainda não é claro se as sequências de vector, o que inevitavelmente curtas permanecem nas células transduzidas após excisão, e expressão de transposase, poderia induzir alteração na célulaular funcionar ^13. Apesar da sua alta eficiência de reprogramação, vírus Sendai representa uma abordagem caro e preocupações atingem-through de licenciamento com a empresa que desenvolveu este sistema tem o potencial de limitar a sua aplicação em estudos translacionais. Além disso, a necessidade de introdução directa de proteínas e RNA requer entrega múltiplo de reprogramação moléculas com as limitações técnicas inerentes Isso introduz e eficiência global de reprogramação é muito baixa ^14. De nota, métodos virais livres e não-integração eficaz em termos de custos com base no uso de plasmídeos epissómicos têm sido relatadas com sucesso para a reprogramação de fibroblastos da pele ^15. Especificamente, no presente trabalho, decidimos usar plasmídeos epissomais livre de integração disponíveis comerciais, conforme relatado anteriormente ^10,15.

Até à data, os fibroblastos da pele representam o mais popular tipo de célula doadora ^5. No entanto, outras fontes de células foram successfully reprogramado em iPSCs incluindo queratinócitos ^16, medula óssea células-tronco mesenquimais, células do estroma ¹⁷ adiposo ^{18, 19} folículos pilosos e as células da Polpa Dentária ^20. O isolamento destas células requer procedimentos cirúrgicos, e várias semanas são necessários para a expansão in vitro de células, a fim de estabelecer uma cultura de células primárias.

Neste contexto, a selecção do tipo de células de partida é crítica e é igualmente importante ser capaz de produzir a partir de tecidos iPSCs facilmente acessíveis e menos invasivas, tais como sangue. Ambas as células mononucleares do sangue do cordão umbilical (CBMNCs ^21,22) e células mononucleares de sangue periférico ^(14,22-24) PBMNCs representam fontes adequadas de células para a derivação de iPSCs.

Embora a eficiência do adulto PBMNC reprogramação é 20-50 vezes mais baixa do que a de CBMNCs ^22, eles continuam a ser o tipo de célula mais conveniente para efeitos de amostragem. Emfato, a amostragem PBMNC tem a vantagem de ser minimamente invasivo, e, além disso, estas células não necessitam de grande expansão in vitro antes de experiências de reprogramação. Até à data, os protocolos diferentes têm relatado que PBMNCs após separação por gradiente de densidade pode ser congelado e descongelado dias a vários meses após a congelação e expandido por poucos dias antes de reprogramação em iPSCs ^22,23. No entanto, tanto quanto nós estamos cientes há relatos têm descrito a reprogramação da PBMNCs de crostas inflamatórias congelados. Importante, cremes leucocitários congelados recolhidos sem separação por gradiente de densidade representam as amostras de sangue mais comuns armazenadas em bancos de recursos biológicos de grande escala a partir de estudos populacionais, representando, assim, uma piscina facilmente acessível de material para a produção iPSC que evita ainda a coleta de amostras.

Aqui nós relatamos pela primeira vez a geração de iPSCs virais-livre de cremes leucocitários humanos congelados, com base em um protocolo previamente descrito ^22. EmAdicionalmente, foram gerados a partir iPSCs PBMNCs congelados obtidos após separação por gradiente de densidade, tal como um protocolo de controlo para os resultados PBMNC gradiente de densidade não-purificadas.

Protocolo

Células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) foram isolados a partir de amostras de sangue periférico humano de dadores saudáveis ​​após assinados consentimento informado e aprovação do Comitê de Ética da província do sul do Tirol. Os experimentos foram conduzidos de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. Todos os dados foram coletados e analisados ​​de forma anônima.

1. Isolamento de Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMNCs)

1. PBMNCs obtido a partir de crostas inflamatórias após centrifugação de sangue total, sem separação por gradiente de densidade.
   1. Recolhe 8 mL de sangue venoso periférico em um citrato de sódio tamponado tubo de plástico, e armazenar a temperatura ambiente (25 ° C). Processo de sangue dentro de 12 horas após a coleta.
   2. Centrifuga-se o tubo a 2.000 xg durante 15 min a 4 ° C num rotor basculante, de comutação de desligar os freios de centrífuga.
   3. Recolhe-se o creme leucocitário nublado (a camada entre a fase de plasma superior e a inferiorfase que contém a maior parte dos eritrócitos), contendo a fracção enriquecida PBMNC (500 ul) para um tubo de criotubo.
   4. Ressuspender 500 ul de buffy coat com 500 ul de meio de congelação 2x contendo 90% de FBS e 20% de DMSO, de modo a obter um volume total de 1 ml com 10% de concentração de DMSO.
   5. Congelar o frasco dentro de um recipiente de congelamento de taxa controlada a -80 ° C. Células da loja em nitrogênio líquido por períodos mais longos.
2. PBMNCs obtida após separação por gradiente de densidade
   1. Coletar 12 ml de sangue venoso periférico em um citrato de sódio tamponado tubo de plástico, e armazenar a RT. Processo de sangue dentro de 12 horas após a coleta.
   2. Dilui-se o sangue com PBS estéril para um volume final de 35 ml.
   3. Cuidadosa e lentamente, camada de 35 ml de sangue diluído em 15 ml de solução de polissacarose (utilizado para separação por gradiente de densidade) (p = 1,077) em um tubo de 50 ml (razão 3: 1).
   4. Centrifuga-se o tubo a 800 xg durante 30 min à temperatura ambiente emum rotor basculante, comutação-off os freios de centrífuga.
   5. Aspirar o superior, fase amarela contendo plasma e descartá-lo. Cuidadosamente, transferir a fase interfase branco opaco contendo PBMNCs para um novo tubo de 50 ml.
   6. Levar o volume total a 30 ml com PBS estéril e centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
   7. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células com 30 ml de PBS. Contar o número de células viáveis, com base na exclusão de azul de tripano ^25.
   8. PBMNCs centrifugue-as a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante e descartá-lo.
   9. Ressuspender o sedimento de células em uma quantidade apropriada de meio de congelamento contendo 90% de FBS e 10% de DMSO, de modo a obter uma concentração de 5 x 10 ⁶ células / ml.
   10. Aliquota de 1 ml por frasco (cerca de 5 X 10 ⁶ células / ml) e congelar o frasco em um recipiente de congelamento taxa controlada a - 80 ° C. Células da loja em nitrogênio líquido por períodos mais longos.

2. O descongelamento e chapeamento de PBMNCs (dia 0)

1. PBMNCs obtido a partir de crostas inflamatórias após centrifugação de sangue total, sem separação por gradiente de densidade.
   1. Para iniciar o protocolo utilizando PBMNCs de cremes leucocitários congelados, descongelar uma ampola de células em banho-maria a 37 ° C e dilui-se o creme leucocitário com PBS estéril para um volume final de 2 ml.
   2. Transferir a buffy coat diluída em um tubo de 50 ml, adicionar 10 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
   3. Para preparar 500 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos, adicionar 0,5 g de bicarbonato de potássio, 4,145 g de cloreto de amónio, 100 mL de uma solução 0,5 M de EDTA a 500 ml de água ultrapura, pH 7,2-7,4.
   4. Levar o volume total a 50 ml com PBS estéril e centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
   5. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com 50 ml de PBS estéril, centrifugar a buffy coat a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
   6. Ressuspender as células em1 ml de meio de PBMNC, como anteriormente descrito ^22, composto por: IMDM e de Ham F-12 (proporção de 1: 1), concentrado de Lípido 1% de insulina-transferrina-selênio-etanolamina (ITS-X), 1% de Quimicamente Definido (CDL), 1% Penicilina / Estreptomicina, 0,005% de ácido L-ascórbico, 0,5% de Albumina de Soro Bovino (BSA), 1-tioglicerol (concentração final de 200 uM), Stem Cell Factor de SCF (100 ng / ml), interleucina -3 IL-3 (10 ng / mL), eritropoietina EPO (2 U / ml), Insulin-like Growth Factor de IGF-1 (40 ng / ml), dexametasona (1 uM) e de holo-transferrina (100 jig / ml ).
   7. Transferi-los para um poço de uma placa de 12 poços com a superfície tratada de cultura de tecidos padrão, sem revestimento, a uma densidade de 2 x 10 ⁶ células / ml. Incubar as células a 37 ° C, 5% de _CO2 num incubador humidificado durante 48 horas, até que a mudança de passo médio (ver secção 3).
2. PBMNCs obtida após separação por gradiente de densidade
   1. Para iniciar o protocolo utilizando PBMNCs congelados depoisseparação por gradiente de densidade, descongelar uma ampola de células em banho-maria a 37 ° C, transferir as células em 5 ml de meio de PBMNC. Centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
   2. Ressuspender as células em 1 ml de meio de PBMNC e transferi-los para um poço de uma placa de 12 poços, a uma densidade de 2 x 10 ⁶ células / ml. Incubar as células a 37 ° C, 5% de _CO2 num incubador humidificado durante 48 horas, até que a mudança de passo médio (ver secção 3).

3. Cultura e Expansão da PBMNCs (DIA 13/02)

1. Recolhe PBMNCs em cultura em suspensão, utilizando uma pipeta com uma ponta de 1 ml, em um tubo de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
2. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio fresco PBMNC.
3. Transferir as células em um poço de placa de 12 poços com a superfície tratada de cultura de tecidos padrão, sem revestimento, e incubar a 37 ° C, 5% de _CO2 numa incubadora humidif içada.
4. Repita estes passos a cada dois dias, e dividir as células a uma razão de 1: 2 quando atingem a confluência apropriado (cerca de 80%).

4. A transfecção de PBMNCs com epissomais plasmídeos (DIA 14)

Nota: Realizar o isolamento dos quatro plasmídeos epissómicos comercial livre de intergation, transportando os genes de pluripotência usando um kit comercial para a purificação de plasmídeo e avaliar a qualidade dos plasmídeos purificados utilizando uma análise em gel de agarose, de acordo com as instruções do fabricante.

1. Recolhe PBMNCs em tubo de 15 ml e contar o número de células viáveis ​​(com base na exclusão de azul de tripano) ^25.
2. Centrifugar 2 x 10 ⁶ células a 300 xg durante 10 min à TA.
3. Ressuspender 2 x 10 ⁶ células na mistura de transfecção contendo 100 ul de tampão T Resuspension e 1 ug de cada plasmídeo de DNA (um plasmídeo portador OCT3 / 4 e shRNA contra p53, SOX2 transportando um plasmídeo e KLF4, umplasmídeo portador L-MYC e LIN28, e um plasmídeo portador EGFP, para verificar a eficiência de transfecção).
4. Aspirar a mistura de transfecção contendo as células em 100 ul de uma ponta e inserir a pipeta com a amostra verticalmente para dentro do tubo, cheio com 3 ml de Tampão electrolítico E2, colocado na estação de pipeta de máquina de electroporação, de acordo com as instruções do fabricante.
5. Células de forma eficiente electroporate usando o seguinte programa: 1.650 V, 10 ms, 3 pulsos.
6. Ressuspender as células electroporadas (2 x 10 ⁶ células) em 2 ml de meio de PBMNC pré-aquecido, adicionando 0,25 mM de butirato de sódio (NaB) e contar o número de células viáveis ​​após o protocolo de electroporação (com base na exclusão de azul de tripano) ^25.
7. Transferir as células em um poço de uma placa de 6 poços sem revestimento, balançar suavemente a placa e incubar as células a 37 ° C, 5% de _CO2 numa incubadora humidif içada.
8. O dia após eletroporação, count o número de células positivas para GFP sob microscopia de fluorescência 8-10 campos aleatórios, a fim de avaliar a eficácia de transfecção.
9. Manter as células transfectadas sem divisão por 3 dias, até plaqueamento em MEFs (ver secção 6).
10. Substitua 2 ml de meio PBMNCs fresco, além de 0,25 mM NAB a cada dois dias.

5. Prepare-Pratos com células alimentadoras para o Co-cultura (DIA 16)

1. Revestir os poços de uma placa de 6 poços com 1 ml de matriz de membrana basal durante 15 min a 37 ° C e a placa de rato embrionários fibroblastos (MEFs) a uma densidade de 2 x 10 ⁵ células / poço com 2 ml de 10% de FBS contido DMEM (meio de MEF), um dia antes passagem das PBMNCs electroporadas em células alimentadoras MEF-.

6. Galvanização transfectadas PBMNCs Onto MEFs (DIA 17-19)

1. Recolhe PBMNCs em cultura em suspensão, utilizando uma pipeta de 1 ml com ponta, em 15 ml de tubos de centrífuga cónico e transfectadas PBMNCs a 300 xg durante 10 minà TA.
2. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 2 ml de meio fresco PBMNC, mais 0,25 NaB mM.
3. Placa as células nas MEF-revestido 6 bem-placa e incubar as células a 37 ° C, 5% de _CO2 numa incubadora humidif içada.
4. Após dois dias, aspirar o meio e substitui-la com 2 ml de meio iPSC composto por DMEM nocaute (KO-DMEM), 20% KO-substituição Serum (KOSR), NEAAs 1 mM, 1% de Penicilina / Estreptomicina, 20 mM de L- A glutamina, 0,1 mM de β-mercaptoetanol, 10 FGF ng / ml (bFGF básico) e NaB 0,25 mM.
5. Substitua 2 ml de meio iPSC fresco todos os dias e verificar as células diariamente.
   Nota: A cerca de 22-25 dias, as primeiras colônias de iPSCs deve ser visível.

7. colheita e de expansão de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) Clones (DIA 30-35)

Nota: A cerca de 30-35 dias após a transfecção, as colónias IPSC deve estar pronto para a colheita e repique. A eficiência de reprogramação deve ser estiacoplado como a percentagem do número de colónias de IPSC / número total de células electroporadas, tal como relatado anteriormente ^26.

1. O dia antes passaging colónias IPSC, preparar o alimentador MEF numa placa de 12 poços (1,25 x 10 ⁵ células / poço).
2. Aspirar o meio e MEF mudar com 1 mL de meio de iPSC com 10 ng / mL de bFGF e 10 pM Y-27632. Dissecar manualmente com uma agulha de uma colónia de cada vez sob o microscópio de dissecação na apanha-capa, a fim de obter uma rede, recolher aglomerados mais pequenos por pipetagem e transferi-las uma a uma para um poço de placa de 12 poços revestida com MEFs.
3. Passagem e expandir-se cada placa de 12 poços para uma placa de 6 cavidades em uma proporção de 1: 2, em seguida, cada placa de 6 cavidades em uma proporção de 1: 4 para posterior multiplicação. Dissecar e expandir iPSCs manualmente para os primeiros 2-3 passagens (como completamente descrito no passo 7.2), em seguida, usar um procedimento de dissociação enzima (iniciar a partir do passo 7.4).
4. Para um protocolo de dissociação enzimática, Coloni iPSC limpoes por aspiração porções diferenciadas, sob o microscópio de dissecação na apanha-hood.
5. Incubar iPSCs com 1 ml de colagenase IV (1 mg / ml) durante 10 min a 37 ° C.
6. Aspirar a solução de enzima, lavar as células com 1 ml de KO-DMEM e recolher as colônias em um tubo de 15 ml. Centrifugar a 100 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
7. Aspirar o sobrenadante, ressuspender as colónias em 2 ml de meio iPSC com 10 ng / mL de bFGF e 10 pM Y-27632 e placa-los no MEF-revestido placa de 6 poços (razão 1: 4).

8. Caracterização de iPSCs (entre 5-15 passagens)

1. Fosfatase Alcalina Coloração
   1. Cultura das colónias IPSC para 3-5 dias em meio iPSC com 10 ng / ml bFGF.
   2. Para iniciar um protocolo de coloração da fosfatase alcalina, lavar iPSCs uma vez com PBS e depois fixá-los com 1 ml de PFA a 4% durante 20 min à TA.
   3. Lavam-se as células três vezes com PBS, para remover PFA residual.
   4. Mancha fixo células usandoum kit de fosfatase alcalina comercial de coloração de acordo com as instruções do fabricante.
2. Imunofluorescência
   1. Cultura das colónias IPSC para 3-5 dias em meio iPSC com 10 ng / ml bFGF.
   2. Para iniciar um ensaio de imunofluorescência, lavar iPSCs uma vez com PBS e depois fixá-los com 1 ml de PFA a 4% durante 20 min à TA.
   3. Lavam-se as células três vezes com PBS, para remover PFA residual.
   4. Tratar iPSCs fixas com 1 ml de permeabilização / solução contendo 4% de soro de cabra, 0,1% de BSA, 0,1% de Triton X-100 e 0,05% de azida de sódio (NaN ₃ de bloqueio) durante 1 hora à TA.
   5. Aspirar a solução de bloqueio e incubar as células fixadas com anticorpos primários em 3% de BSA e 0,05% _{de NaN3} solução o / n a 4 ° C (veja a tabela de materiais para a lista de anticorpo primário e anticorpo sugerido factor de diluição).
   6. No dia seguinte, lavam iPSCs três vezes com PBS, depois incubar as células com Alexa Fluor 488 anticorpo de cabra anti-ratinho e Alexa FlOs anticorpos anti-coelho de cabra 555 uor, diluído 1: 1000 em 3% de BSA e 0,05% _{de NaN3} solução, durante 1 hora a 37 ° C.
   7. Manchar os núcleos com DAPI (1 ug / ml) durante 10 min à temperatura ambiente no escuro, seguido por lavagem três vez com PBS.
3. Diferenciação das iPSCs em corpos embrióides (EB)
   1. Cultura das colónias IPSC para 5-6 dias em meio iPSC com 10 ng / ml bFGF.
   2. Remover partes diferenciadas de colónias IPSC por aspiração, sob o microscópio de dissecação na apanha-hood.
   3. Incubar iPSCs com 1 ml de colagenase IV (1 mg / ml) durante 10 min a 37 ° C.
   4. Aspirar a solução de enzima, lavar as células com 1 ml de KO-DMEM e recolher as colônias em um tubo de 15 ml. Centrifugar a 100 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
   5. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as colónias em 2 ml de soro de meio EB composto de KO-DMEM, 20% definido fetal de bovino (FBS), NEAAs 1 mM, 1% de Penicilina / Estreptomicina, 20 mM de L-glutamina, 0,1 mM46; -mercaptoetanol.
   6. Placa IPSC colónias em suspensão, durante 6 dias de fixação para placas de 6 poços ultra-baixos, a fim de permitir a formação de corpos embrióides esferoidais tridimensionais (EBS). Mudar 2 ml de meio EB fresco a cada dois dias.
   7. No dia 7, recolher EB e placa-los em 0,1% de gelatina revestidas placas de 6 poços em 2 ml de meio EB EB e manter na diferenciação durante 20 dias.
   8. Mudar 2 ml de meio EB fresco a cada dois dias.
4. qRT-PCR para Análise de Expressão Gênica
   1. Cultura das colónias IPSC para 5-6 dias em meio iPSC com 10 ng / ml bFGF.
   2. Extrair o ARN total a partir de PBMNCs, iPSCs ou EB utilizando 1 mL de reagente comercial de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Avaliar a concentração de RNA e pureza através de métodos adequados, tais como o uso de um espectrofotômetro (RNA de alta qualidade com A ₂₆₀ / A ₂₈₀ e A ₂₆₀ / A ₂₃₀ rácios> 1,8) ^27.
   4. VerificaIntegridade do RNA usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante (RNA de alta qualidade RQI> 9,5) ^28.
   5. Executar uma reacção de transcrição reversa, 1 ug de ARN total utilizando um kit comercial da transcriptase inversa de acordo com as instruções do fabricante.
   6. Preparar as misturas qPCR contendo 5 ng de molde de ADNc, 7,5 ul de SYBR Green Supermix, 2 ul de 5 uM (iniciadores forward: 1 ul e reverso: 1 ul) e 6 uL de RNase / água isenta de ADNase para cada reacção ^29.
   7. Realizar a qRT-PCR utilizando o seguinte programa: um passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos divididos em um passo de desnaturação a 95 ° C durante 15 seg e emparelhamento do iniciador e extensão do passo de 60 ° C durante 45 sec ^29.
   8. Normalizar a expressão de outros genes utilizando GAPDH como gene de arrumação ²⁸ (ver os iniciadores listados na Tabela 1).
5. qPCRpara Transgene Exclusão
   1. Extrair DNA de PBMNCs ou iPSCs utilizando 1 mL de tampão de lise contendo Tris 50 mM, EDTA 100 mM, NaCl 100 mM, 1% de sulfato dodecil de sódio (SDS) e 20 ug / ml de Proteinase K.
   2. Adicionar um volume igual (1 ml) de isopropanol a 100%, misturar por inversão três vezes, a fim de permitir a precipitação de ADN e de centrifugação a 10000 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   3. Descartar o sobrenadante, lava-se a pelete de ADN com 1 ml de etanol a 70% e centrifuga-se a 10.000 xg durante 5 min à TA. Aspirar e desprezar o sobrenadante e ressuspender em que RNase / água isenta de ADNase.
   4. Avaliar a concentração de DNA e pureza através de métodos adequados, tais como o uso de um espectrofotômetro (RNA de alta qualidade com A ₂₆₀ / A ₂₈₀ e A ₂₆₀ / A ₂₃₀ rácios> 1,8) ^27.
   5. Preparar as misturas qPCR contendo 5 ng de ADN molde, 7,5 ul de SYBR Green Supermix, 2 ul de 5 uM (iniciadores forward: 1 ul e reverso: 1 ul) e 6 &# 181; l de RNase / água sem ADNase para cada reação ^29.
   6. Normalizar o plasmídeo epissomal de expressão específico do gene EBNA-1 usando FBX-15 como gene de arrumação ²⁹ (ver os iniciadores listados na Tabela 1).
6. A análise do cariótipo
   1. Cultura das colónias IPSC para 5-6 dias Onto matriz da membrana basal livre de alimentador de placa revestida com, um meio de manutenção comercial definido livre de alimentador para iPSCs, seguindo as instruções do fabricante.
   2. Para iniciar o protocolo de análise de cariótipo, separar colónias IPSC com 1 ml de solução de desprendimento de células durante 5 min a 37 ° C, até se obter a dissociação de uma única célula.
   3. Recolher as células e centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   4. Ressuspender iPSCs em 2 ml de um meio especificamente desenvolvido para a cultura de células para técnicas de diagnóstico pré-natal. IPSCs de célula única placa para uma membrana basal da matriz revestido pratos de vidro e incube-as em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO _{2 <}/ Sub> incubadora.
   5. Após 2-4 dias, adicionam-se 10 uL / mL de colchicina directamente para as culturas e incubar durante 3 horas a 37 ° C, 5% de _CO2 numa incubadora humidif içada.
   6. Aspirar o meio e incubar iPSCs em 1 ml de uma solução hipotónica (citrato de sódio 0,6% e cloreto de potássio a 0,13%) durante 10 min à TA.
   7. Lavar as células com 1 ml de solução de ácido acético a 5% e fixar iPSCs com solução metanol / ácido acético (razão de 3: 1) num aparelho com controlo de temperatura e humidade (28 ° C, 42% HR).
   8. Mergulhe e células mancha fixa com solução Quinacrine para 15-20 min a RT no escuro (para obter Q-borda) ^30.
   9. Adquirir metáfases de células sob um microscópio de fluorescência a ampliação 100X ^29.

Resultados

Neste estudo, um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs-virais livre por reprogramação da PBMNCs isoladas a partir de crostas inflamatórias congelados após a centrifugação de sangue total e comparação com a reprogramação da PBMNCs obtidos após separação por gradiente de densidade é relatado. A Figura 1A mostra uma representação esquemática de o protocolo detalhado. Após a descongelação, os PBMNCs isolado, que mostram uma forma típica arredondada, são expandidas em mei...

Discussão

No passado, a única forma de obter células-tronco pluripotentes humanas portadores de uma mutação genética particular foi recrutar pais submetidos a um diagnóstico genético pré-implantação e gerar células-tronco embrionárias a partir de suas blastocistos descartados ^31,32. Usando uma abordagem de reprogramação, os pesquisadores podem agora gerar iPSCs de pacientes portadores de virtualmente qualquer genótipo. A possibilidade de iniciar a partir de uma linha de células específica para cada pac...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube	Terumo	VF-054SBCS07
Ammodium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Potassium bicarbonate	Sigma-Aldrich	60339
EDTA disodium powder	Sigma-Aldrich	E5134	0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)	Gibco	21056-023	No phenol red
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)	Gibco	51500-056	1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031	1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)	PeproTech	300-07	100 ng/ml (Stock:100 µg/ml)
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)	PeproTech	200-03	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)	PeproTech	100-11	40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin	R&D Systems	2914-HT	100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II	Gibco	11269016	Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1	StemCell Technologies	5850	Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010	0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa	R&D Systems	4114-TC	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503	10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum	Hyclone	SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Merck-Millipore	ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230
Collagenase, Type IV	Gibco	17104-019	1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007	Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)	Global Stem	GSC-6201G	1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK	Addgene	27078	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL	Addgene	27080	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP	Addgene	27082	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit	Stemgent	00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody	Merck-Millipore	MAB4304	1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody	Merck-Millipore	MAB4360	1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody	Merck-Millipore	MAB4381	1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-9081	1/500
Anti-Nanog Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-33759	1/500
Anti-Troponin I Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-15368	1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody	Sigma-Aldrich	A7732	1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody	Covance Research Products Inc	MMS-435P-100	1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Calbiochem	657012	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse	Molecular Probes	A-11029	1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit	Molecular Probes	A-21429	1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate	Corning	3471
Trizol Reagent	Ambion	15596-018	reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Invitrogen	11754050	Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	185-5195
Experion Automated Electrophoresis System	Bio-Rad	700-7000	Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit	Bio-Rad	7007105	Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )	Zeiss	495007
NeonTransfection System 100 µl Kit	Invitrogen	MPK10025	Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit