Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Özet

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Özet

Somatik hücreler, dört transkripsiyon faktörlerinin (Ekim-4, Sox-2, Klf-4 ve c-myc) ekspresyonunu zorlayarak uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) içine yeniden olabilir, tipik olarak insan embriyonik kök hücreleri tarafından (hESC) olarak ifade . Nedeniyle hESC ile benzerliği, iPSCs hESC ile ilgili etik sorunlar kaçınarak, olası hastaya özgü rejeneratif tıp için önemli bir araç haline gelmiştir. Klinik uygulamalar için, uygun hücreler elde etmek için, transgen içermeyen iPSCs transgen reaktivasyonu, değiştirilmiş gen ekspresyonunu ve yanlış farklılaşmasını önlemek için söz konusu olacaktır. Ayrıca, yüksek ölçüde verimli ve pahalı olmayan bir yeniden programlama yöntemi, terapötik amaçlar için yeterli iPSCs elde etmek gereklidir. Bu ihtiyacı göz önüne alındığında, etkin bir sivil entegre episomal plazmid yaklaşımı iPSC türetme tercih seçimdir. Şu anda yeniden programlama amaçlı kullanılan en yaygın hücre tipi fibroblastlar vardır, izolasyon hangi bir i doku biyopsisi gerektirirhasta için nvasive cerrahi prosedür. Bu nedenle, insan periferik kan iPSC nesil için en erişilebilir ve en az invaziv doku temsil eder.

Bu çalışmada, bütünleşmeyen epizomal plasmidleri kullanılarak uygun maliyetli ve viral içermeyen protokolü tam kan, santrifüj işleminden sonra ve yoğunluk dereceli ayırma olmadan dondurulmuştur buffy kat elde edilen insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMNCs) için iPSCs üretilmesi için rapor edilir.

Giriş

2006 yılında, Shinya Yamanaka ¹ grubu, yetişkin farelerde ve insanlarda somatik hücreler, dört yeniden programlama faktörleri (Ekim-4, Sox-2, Klf-4 ve ektopik ekspresyonu ile pluripotent haline dönüştürülebilir ilk defa burada gösterilmektedir c-myc), sözde uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) ² üretilmesi. Hastaya özgü iPSCs yakından morfoloji, çoğalması ve üç germ hücre tipleri (mezoderm, endoderm ve ektoderm) içine ayırt etmek için yeteneği bakımından insan embriyonik kök hücreleri (hESC) benzer hESC ve baypas kullanımına bağlı etik kaygıları eksik ise olası bağışıklık reddi ^3. Böylece, iPSCs temel araştırma, ilaç tarama, hastalık modelleme, toksisite değerlendirilmesi ve rejeneratif tıp amaçlı ⁴ hasta-spesifik hücrelerin en önemli kaynaklarından biri olarak görünür.

Çeşitli yaklaşımlar iPSC üretimi için kullanılmıştır: Viral entegre vektörler(Retrovirüs ^5, lentivirüs ^6), viral olmayan entegre vektörleri (adenovirüs ^7), Sendai-virüs ^8, BAC transposonlar ^9, epizomal vektörleri ^10, proteinler ¹¹ veya RNA teslim ^12. Virüs aracılı yöntemleri kullanımı yüksek verimlilik yeniden programlama neden olabilir, ancak, viral vektörler, konak hücreler ve bu nedenle, potansiyel rastgele girmeyle mutagenez genomu içine entegre, farklılaşması sırasında gen ekspresyonu ve susturulması transgenlerin yeniden aktive kalıcı değişiklik ¹³ göz ardı edilemez.

Rejeneratif tıp iPSCs daha güvenli hale getirmek için, çaba hücre genomlarına ekzojen DNA'nın entegrasyonu olmadan iPSCs elde etmek için yapılmıştır. Vergiye tabi viral vektörler ve transposonlar geliştirilmiş olmasına rağmen, bu kaçınılmaz olarak kesilip çıkarılmasından sonra dönüştürülmüş hücreler kalır ve ifade transposaz kısa vektör sekansları, hücre içinde değişikliğe sebep olup olmadığı hala belirsizular ¹³ işlev. Yüksek yeniden programlama verimliliği rağmen, Sendai virüsü translasyonel çalışmalarda uygulanmasını sınırlamak potansiyeline sahip bu sistem geliştirdi şirket ile pahalı bir yaklaşım ve ulaşmak geçiş lisans kaygıları temsil etmektedir. Ayrıca, protein ve RNA doğrudan sokulması için bir ihtiyaç bu getirmektedir içsel teknik sınırlamalar molekülleri yeniden programlanması birden fazla teslimat gerektirir ve genel olarak yeniden programlama verimi ¹⁴ çok düşüktür. Dikkat çekici bir şekilde, epizomal plasmidlerin kullanımı göre düşük maliyetli bir viral ve serbest olmayan entegre yöntem başarılı bir şekilde deri fibroblastları ¹⁵ yeniden programlama için rapor edilmiştir. Daha önce ^10,15 bildirdiği gibi Özellikle, mevcut çalışmada biz, ticari mevcut entegrasyon serbest episomal plasmidlerini kullanmaya karar verdi.

Bugüne kadar, cilt fibroblastlar en popüler donör hücre tipi ⁵ temsil etmektedir. Bununla birlikte, diğer hücre kaynakları başarı olmuştursfully keratinositler ^16, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerin ^17, adipoz stromal hücreler ¹⁸ olmak üzere iPSCs içine yeniden programlanması, saç folikülleri ¹⁹ ve dental pulpa hücreleri ^20. Bu hücrelerin izolasyonu cerrahi prosedürler gerektiren ve birkaç hafta birincil hücre kültürünün oluşturulması için in vitro hücre genişlemesi için ihtiyaç vardır.

Bu ışığında, hücre tipi başlangıç ​​seçimi kritiktir ve kan gibi kolay erişilebilir ve daha az invazif dokulardan iPSCs üretebilmek için aynı derecede önemlidir. Her iki kordon kan tek-çekirdekli hücreleri (CBMNCs) ^21,22 ve periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMNCs) ^14,22-24 iPSCs türetilmesi için hücrelerin uygun bir kaynağıdır.

Yetişkin PBMNC yeniden programlama verimliliği CBMNCs ²² daha 20-50 kat daha düşüktür rağmen, örnekleme amacıyla en uygun hücre tipi kalır. IçindeAslında, PBMNC numune minimal invaziv olma avantajına sahiptir, ve buna ek olarak, bu hücrelerin yeniden programlama deneyleri daha önce in vitro olarak geniş bir genişleme gerekli değildir. Bugüne kadar, farklı protokoller yoğunluk gradyan ayrıldıktan sonra PBMNCs dondurulup çözülmüş gün birkaç aya kadar dondurma sonra iPSCs ^22,23 içine yeniden programlama birkaç gün önce genişletilebilir bildirmiştir. Bununla birlikte, kadarıyla biz hiçbir rapor dondurulmuş buffy kat gelen PBMNCs yeniden programlamayı tarif var farkında olarak. Önemlisi, yoğunluk gradyan ayırımı olmaksızın toplanan dondurulmuş buffy mantolar böylece daha örnek toplama önler iPSC üretimi için malzeme kolay ulaşılabilir bir havuz temsil nüfus çalışmalardan elde büyük ölçekli biyobankalar saklanan en sık kan örnekleri temsil etmektedir.

Burada biz, daha önce tanımlanmış olan protokole göre ²² insan dondurulmuş buffy kat ilk defa virüs içermeyen iPSCs üretilmesini rapor etmektedir. IçindeAyrıca, iPSCs olmayan yoğunluk gradyanı saflaştınldı PBMNC sonuçlar için bir kontrol protokolü olarak, yoğunluk gradyanı ayrıldıktan sonra elde edilen dondurulmuş PBMNCs elde edildi.

Protokol

Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) sonra bilgilendirilmiş onam ve Güney Tirol Eyaleti Etik Kurul onayı imzalı sağlıklı donörlerin insan periferik kan örneklerinden izole edilmiştir. Deneyler Helsinki Bildirgesi ifade esaslar doğrultusunda yapılmıştır. Tüm veriler toplanmış ve anonim analiz edildi.

Çevresel Kan Tek Çekirdekli Hücrelerin İzolasyonu 1. (PBMNCs)

1. PBMNCs yoğunluk gradyan separasyonu olmaksızın, tam kan, santrifüj işleminden sonra ince beyaz kat elde edilen.
   1. Sodyum sitrat içine venöz periferal kan 8 mL kan, oda sıcaklığında (25 ° C) 'de plastik boru ve mağaza tamponlu. Toplandıktan sonra 12 saat içinde Süreç kan.
   2. Kapatıldıktan santrifüj fren, bir sallanan kepçeli rotor içinde 4 ° C'de 15 dakika boyunca 2000 x g'de tüp santrifüjleyin.
   3. Bulutlu buffy coat (üst plazma fazı ve alt arasındaki katmanı toplayınFaz kriyotüpe tüp içine zenginleştirilmiş PBMNC kısmını (500 ul) ihtiva eden), eritrositlerin en ihtiva etmektedir.
   4. % 10 DMSO konsantrasyonu ile 1 ml 'lik bir toplam hacim elde etmek üzere% 90 FBS ve% 20 DMSO içeren 2x dondurma ortamı içinde 500 ul buffy coat 500 ul yeniden süspanse edin.
   5. -80 ° C'de, bir hız denetimli dondurma kapta şişeyi dondurun. Daha uzun süreler boyunca sıvı azot içinde mağazası hücreleri.
2. PBMNCs yoğunluk gradyan ayırma sonrası elde edilen
   1. Sodyum sitrat içine venöz periferal kan 12 ml toplamak oda sıcaklığında plastik tüp, ve mağaza tamponlu. Toplandıktan sonra 12 saat içinde Süreç kan.
   2. 35 ml'lik bir son hacme kadar steril PBS ile kan seyreltin.
   3. Dikkatli ve yavaş yavaş, katman 50 ml konik bir tüp içinde (yoğunluk gradyan ayırma için kullanılır) polisükroz çözeltisi (p = 1,077), 15 ml seyreltilmiş kan 35 mi (oran 3: 1).
   4. Oda sıcaklığında, 30 dakika içinde 800 xg'de santrifüj tüpüsallanan bir kova rotor, anahtarlama-off santrifüj frenler.
   5. Üst, sarı faz içeren plazma aspire ve atın. Dikkatle, yeni 50 ml konik tüp PBMNCs içeren opak beyaz interfaz katmanı aktarın.
   6. Steril PBS ile 30 ml toplam hacmi getirmek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
   7. Süpernatantı atın ve PBS 30 ml hücreleri tekrar süspansiyon. Tripan mavi eksklüzyonu ile ²⁵ göre canlı hücre sayısı, saymak.
   8. Santrifüj PBMNCs oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de, süpernatan aspire ve atın.
   9. 5 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir konsantrasyon elde etmek üzere,% 90 FBS ve% 10 DMSO ihtiva eden dondurma ortamına uygun bir miktarda hücre pelletini.
   10. Kısım başına 1 ml'lik şişe (5 x 10 ⁶ hücre / ml) ve en kabı dondurma hız denetimli bir flakon dondurma - 80 ° C. Daha uzun süreler boyunca sıvı azot içinde mağazası hücreleri.

2. Çözülme ve PBMNCs ve Kaplama (GÜN 0)

1. PBMNCs yoğunluk gradyan separasyonu olmaksızın, tam kan, santrifüj işleminden sonra ince beyaz kat elde edilen.
   1. Dondurulmuş buffy kat arasında PBMNCs kullanarak protokolü başlatmak için 37 ° C'de bir su banyosu içinde hücreleri 1 şişe çözülme ve 2 ml nihai hacme kadar steril PBS ile buffy coat seyreltin.
   2. 50 ml konik bir tüp içinde seyreltildi buffy coat transfer kırmızı hücre lisis tampon maddesi, 10 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
   3. Kırmızı hücre lisis tampon 500 ml hazırlanması potasyum bikarbonat, 0.5 g amonyum klorür 4,145 g, ultra saf su, 500 ml, pH 7.2-7.4, 0.5 M EDTA çözeltisi 100 ul ekleyin.
   4. Steril PBS ile 50 ml toplam hacmi getirmek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
   5. Süpernatant atılır ve steril 50 ml PBS ile pelet yıkama, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de buffy coat santrifüj.
   6. Hücrelerin yeniden süspanseIMDM ve Ham F-12 (oran 1: 1), İnsülin-Transferrin-Selenyum-etanolamin (ITS-X), kimyasal olarak% 1,% 1 Tanımlı lipid Konsantre PBMNC ortamın 1 mi, daha önce oluşan, ²² tarif edilen (KTL),% 1 Penisilin / Streptomisin, L-askorbik asit,% 0.005, Sığır Serum Albümini (BSA)% 0.5, 1-Tiogliserol (nihai konsantrasyon 200 uM), Hücre Faktörü SCF (100 ng / ml) ile kök, İnterlökin -3, IL-3 (10 ng / ml), Eritropoietin (EPO 2 U / ml), insülin-benzeri büyüme faktörü, IGF-1 (40 ng / ml), deksametazon (1 uM) ve holo-transferrin (100 ug / ml ).
   7. 2 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir yoğunlukta, kaplama olmayan, standart doku kültürü tedavi yüzeyi olan bir 12-yuvalı plakanın bir kuyunun içine aktarın. Orta değiştirme aşamasına kadar (bakınız Bölüm 3), 37 ° C'de, 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde% 5 _CO2 ile inkübe hücreleri.
2. PBMNCs yoğunluk gradyan ayırma sonrası elde edilen
   1. Sonra donmuş PBMNCs kullanarak protokolü başlatmak içinyoğunluk gradyanlı ayrıştırma, çözülme 37 ° C'de bir su banyosu içinde hücreleri 1 şişe, PBMNC ortamın 5 ml hücre transfer edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
   2. PBMNC ortam 1 ​​ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve 2 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir yoğunlukta bir 12-yuvalı plakanın bir kuyunun içine aktarın. Orta değiştirme aşamasına kadar (bakınız Bölüm 3), 37 ° C'de, 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde% 5 _CO2 ile inkübe hücreleri.

3. Kültür ve PBMNCs genişletilmesi (GÜN 2-13)

1. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj, 1 ml ucu olan bir pipet kullanılarak, süspansiyon kültüründe PBMNCs toplayın.
2. Süpernatantı atın ve taze PBMNC orta 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon.
3. Kaplama olmadan, standart doku kültürü muamele edilmiş yüzey ile 12 oyuklu plaka 1 kuyuya hücreleri aktarın ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 _CO2 inkübe.
iki günde bu adımları yineleyin ve oranı 1 hücreleri bölmek.

Episomal plasmidler ile PBMNCs 4. transfeksiyonu (14. GÜN)

Not: Dört ticari intergation içermeyen epizomal plasmidlerin izole gerçekleştirme plazmid arıtma için bir ticari kit kullanılarak pluripotense genleri taşıyan bir agaroz jel analizi kullanılarak saflaştırılmış plasmidler kalitesini değerlendirmek, üreticinin talimatlarına göre yöntem.

1. 15 ml konik bir tüp içinde PBMNCs toplamak ve ²⁵ (tripan mavi dışlama bazında) canlı hücre sayısı.
2. Santrifüj oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de 2 x 10 ⁶ hücre.
3. 100 Tekrar süspansiyona, Tampon T ul ve her bir plazmid DNA 1 ug ihtiva eden transfeksiyon karışımı içinde süspanse 2 x 10 ⁶ hücre (p53 karşı Zeiss OCT3 / 4 ve shRNA taşıyan bir plazmid, bir plazmid taşıyan ve Sox2 Klf4, tek birplazmid L-MYC ve LIN28 taşıyan ve bir plazmid) transfeksiyon verimini kontrol etmek, EGFP taşıyan.
4. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir 100 ul ucu içine hücreleri ihtiva eden transfeksiyon karışımı aspire ve elektroporasyon makinesi pipet istasyonuna yerleştirilen Elektrolitik Tampon E2 3 ml ile doldurulmuş tüp içine dikey olarak örnek, pipet yerleştirin.
5. Aşağıdaki programı kullanarak Verimli electroporate hücreler: 1.650 V, 10 msn, 3 bakliyat.
6. 0.25 mM sodyum bütirat (NaB) ekleyerek önceden ısıtılmış PBMNC ortamının 2 ml Elektroporasyona tabi tutulan hücreler (2 x 10 ⁶ hücre) yeniden süspanse edin ve ²⁵ (tripan mavi dışlama bazında) elektroporasyon protokolü sonra yaşayan hücrelerin sayısını.
7. Kaplama olmadan 6 oyuklu plakanın bir oyuğuna transfer hücreleri hafifçe plaka kaya ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 _CO2 inkübe hücreleri.
8. elektroporasyon, ülkeleri gün sonratransfeksiyon etkinliğini değerlendirmek için, 8-10 rastgele alanlardan floresan mikroskobu altında GFP-pozitif hücrelerin sayısını t.
9. MEF'ler (Bölüm 6) bunları kaplama kadar 3 gün boyunca bölme olmadan transfekte hücreleri korumak.
10. Taze PBMNCs ortam 2 ml artı 0.25 mM NaB her iki günde bir değiştirin.

5. Ortak kültür için Besleyici-hücreleri ile Yemekleri hazırlayın (GÜN 16)

1. Ceket 15 dakika boyunca bazal membran matrisi, 1 ml olan bir 6-yuvalı plakanın yuvalarına 37 ° C'de ve FBS ihtiva 2 ml% 10 ile / oyuk 2 x 10 ⁵ hücre yoğunluğunda fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) plaka DMEM (MEF ortamı) MEF besleyici hücreleri üzerine elektropore PBMNCs Pasajlanması bir gün önce.

MEF'ler üzerine 6. Kaplama transfekte PBMNCs (GÜN 17-19)

1. 10 dakika boyunca 300 x g'de 15 ml konik bir tüp santrifüj transfekte PBMNCs olarak 1 mi ucu olan bir pipet kullanılarak, süspansiyon kültüründe PBMNCs toplamakoda sıcaklığında karıştırıldı.
2. MM NAB Süpernatantı atın ve taze PBMNC orta 2 ml pelletini artı 0,25.
3. MEF kaplı 6 iyi levha üzerine, hücreler plaka ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 _CO2 inkübe hücreleri.
4. İki gün sonra, ortam aspire ve DMEM (KO-DMEM),% 20 KO-serum Değiştirilmesi (KOSR), 1 mM NEAAs,% 1 Penisilin / Streptomisin, 20 mM nakavt oluşan iPSC ortam, 2 ml ile değiştirin L- Glutamin, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 10 ng / ml FGF (temel bFGF) ve 0.25 mM NaB.
5. Taze iPSC orta 2 ml her gün değiştirin ve günlük hücreleri kontrol ediniz.
   Not: yaklaşık günde 22-25 anda, iPSCs ilk kolonileri görünür olmalıdır.

7. Toplama ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Genişleme (iPSCs) klonlar (GÜN 30-35)

Not: transfeksiyondan sonra yaklaşık 30-35 gün sonra, iPSC kolonileri toplama ve şarjı için hazır olmalıdır. yeniden programlama verimliliği esti olmalıdırDaha önce rapor edildiği gibi ^26, iPSC koloni / elektroporate edilmiş hücrelerde toplam sayısı sayısının yüzdesi olarak şeklindeki.

1. iPSC koloniler pasaj bir gün önce, 12 oyuklu plaka (1.25 x 10 ⁵ hücre / oyuk) MEF besleyici hazırlar.
2. Aspire MEF orta ve 10 ng / ml bFGF ve 10 uM Y-27632 ile birlikte iPSC ortamı 1 mL değiştirin. El, bir ızgara elde etmek için çekme başlığı içinde mikroskop altında her seferinde bir iğne, bir koloni ile incelemek pipetleme küçük kümeleri toplamak ve MEF'ler ile kaplanmış 12-yuvalı plakanın bir kuyuya her biri tek tek aktarın.
3. Daha fazla yayılması için 4: 1 oranında daha sonra, 2 adet 6-çukurlu plaka: Geçiş oranı 1, 6 gözlü bir plakanın her bir 12-çukurlu plaka genişletmek. Incelemek ve daha sonra bir enzim ayrışma yordamı kullanın (as iyice aşama 7.2 tarif edilmiştir) ilk 2-3 geçişleri için elle iPSCs genişletin (adım 7.4 başlayarak).
4. Bir enzim ayrışma protokolü için, temiz iPSC kolonitoplama-kaput diseksiyon mikroskop altında, farklılaştırılmış bölümlerini aspire es.
5. 37 ° C'de 10 dakika boyunca kolajenaz IV, 1 ml (1 mg / ml) ile iPSCs inkübe edin.
6. Enzim çözeltisi aspire KO-DMEM, 1 ml hücre yıkayın ve 15 ml konik bir tüp içinde koloniler toplanır. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin.
7. Süpernatanı havalandırın, MEF-kaplı 6 çukurlu bir levha üzerinde 10 ng / ml bFGF ve 10 uM Y-27632 ve bunların plaka iPSC ortamının 2 ml koloniler tekrar süspansiyon (oran 1: 4).

IPSCs 8. Karakterizasyonu (5-15 geçiş arasında)

1. Alkali Fosfataz Boyama
   1. Kültür 10 ng / ml bFGF ile iPSC ortam içinde 3-5 gün süreyle iPSC kolonileri.
   2. Bir alkalin fosfataz boyama protokolü çalıştırmak için, bir kez PBS ile yıkayın iPSCs ve daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 PFA 1 ml sabitleyin.
   3. Artık PFA kaldırmak için, PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
   4. Kullanarak Leke sabit hücrelerüreticinin talimatlarına göre bir ticari bir alkalin fosfataz boyama kiti.
2. İmmünofloresan
   1. Kültür 10 ng / ml bFGF ile iPSC ortam içinde 3-5 gün süreyle iPSC kolonileri.
   2. Bir imüno-deneyi başlatmak için, bir kez PBS ile yıkayın iPSCs ve daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 PFA 1 ml sabitleyin.
   3. Artık PFA kaldırmak için, PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
   4. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4 keçi serumu,% 0.1 BSA,% 0.1 Triton X-100 ve% 0.05 sodyum azit ihtiva eden bloke etme çözeltisi Permeabilization 1 ml / _(NaN3) ile sabitlenmiş iPSCs tedavi edin.
   5. Bloke solüsyonu aspire edildi ve 4 ° C 'de primer% 3 BSA içinde antikorlar ve% 0.05 _NaN3 çözeltisi O / N ile sabitlenmiş hücreler inkübe (birincil antikor listesi için malzeme tabloyu kontrol ve antikor seyreltme faktörü tavsiye edilir).
   6. Ertesi gün, Alexa Fluor 488 keçi anti-fare ve Alexa Fl hücreleri inkübe PBS ile iPSCs üç defa yıkamak37 ° C'de 1 saat boyunca,% 3 BSA ve% 0.05 _NaN3 çözeltisi içinde 1000: u veya 555 keçi anti-tavşan antikorları, 1 seyreltilmiştir.
   7. PBS ile üç kez yıkanır, karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika için DAPI (1 ug / ml) ile çekirdekleri Leke.
3. Embriyoid Vücudumuzdaki iPSCs Farklılaşma (EBS)
   1. Kültür 10 ng / ml bFGF ile iPSC ortam içinde 5-6 gün süreyle iPSC kolonileri.
   2. Toplama-kaput diseksiyon mikroskobu altında, aspire iPSC kolonilerden farklı bölümlerini çıkarın.
   3. 37 ° C'de 10 dakika boyunca kolajenaz IV, 1 ml (1 mg / ml) ile iPSCs inkübe edin.
   4. Enzim çözeltisi aspire KO-DMEM, 1 ml hücre yıkayın ve 15 ml konik bir tüp içinde koloniler toplanır. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin.
   5. Süpernatant aspire 2 KO-DMEM oluşan EB ortamı mi,% 20 tanımlı sığır fetus serumu (FBS), 1 mM NEAAs,% 1 Penisilin / Streptomisin, 20 mM L-Glutamin, 0.1 mM koloniler tekrar süspansiyon46; p-merkaptoetanol.
   6. Sferoidal üç boyutlu embriyoid organları (EBS) oluşumuna izin vermek için, ultra-düşük bağlanma 6 oyuklu plakalar üzerine 6 gün süspansiyon içinde iPSC kolonileri. Taze EB orta 2 ml her iki günde değiştirin.
   7. 7. günde, EBS toplamak ve EB ortam 2 ml% 0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu plakalar üzerine bunları plaka ve 20 gün boyunca farklılaşmasında EBS korumak.
   8. Taze EB orta 2 ml her iki günde değiştirin.
4. Gen İfadesi Analizi Mah-PCR
   1. Kültür 10 ng / ml bFGF ile iPSC ortam içinde 5-6 gün süreyle iPSC kolonileri.
   2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, ticari reaktif madde 1 ml kullanılarak PBMNCs, iPSCs veya EBS toplam RNA ekstrakte edin.
   3. Örneğin ²⁷ ₍₂₆₀ / A ₂₈₀ ve A _260/230 oranları> 1.8 olan, yüksek kalitede RNA), bir spektrofotometre kullanımı gibi uygun yöntemlerle RNA yoğunluğu ve saflığı, değerlendirir.
   4. KontrolÜreticinin protokolü (yüksek kalitede RNA RQI> 9.5) ²⁸ uygun bir ticari kit kullanılarak RNA bütünlüğü.
   5. Üreticinin talimatlarına göre bir ticari bir ters transkriptaz kiti kullanılarak total RNA'nın 1 | ig bir ters transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştirmek.
   6. CDNA, şablon 5 ng, 7.5 ul SYBR Green Supermix, 5 uM primer 2 ul ihtiva eden qPCR karışımları hazırlanması (ileri doğru: 1 ul ve ters: 1 ul) ve her bir tepkime ²⁹ RNaz / DNase içermeyen su 6 ul.
   7. 45, 60 ° C 'de 10 dakika süre ile 95 ° C'de bir ilk denatürasyon adımı, 15 saniye ve primer tavlama ve uzatma aşaması için 95 ° C' de denatürasyon adımı ayrılmıştır 40 döngü ve ardından aşağıdaki programı kullanılarak QRT-PCR gerçekleştirme sn ^29.
   8. Ev bakıcısı geni ²⁸ olarak GAPDH kullanan diğer genlerin ekspresyonunu normalize (Tablo 1 'de listelenen primerler bakınız).
5. QPCRTransgen Dışlama için
   1. 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 100 mM NaCI ihtiva eden liziz tamponu için 1 ml kullanılarak PBMNCs ya iPSCs DNA ekstrakte% 1 sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 20 ug / ml proteinaz K
   2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10,000 x g'de DNA çökeltme ve santrifüj olanak sağlamak amacıyla, üç kez,% 100 izopropanol, eşit bir hacmi (1 mi) ilave çevirerek karıştırın.
   3. Süpernatantı atın oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10,000 x g'de 70% etanol ve santrifüj 1 ml DNA pelet yıkayın. Aspire ve supernatant atın ve RNaz / DNaz içermeyen su içinde tekrar süspansiyon.
   4. Örneğin ²⁷ ₍₂₆₀ / A ₂₈₀ ve A _260/230 oranları> 1.8 olan, yüksek kalitede RNA), bir spektrofotometre kullanımı gibi uygun yöntemlerle DNA konsantrasyonu ve saflığı değerlendirmek.
   5. (1 ul ve ters: 1 ul ileri) ve 6-DNA örneğinin 5 ng, 7.5 ul SYBR YEŞİL Supermix, 5 mcM primerlerin 2 ul içeren qPCR karışımları hazırlayın# 181; Her reaksiyon ²⁹ RNaz / DNase içermeyen su l.
   6. (Tablo 1 'de listelenen primerler bakınız) ev idaresi genine ²⁹ olarak FBX-15 kullanarak belirli bir epizomal plazmid EBNA-1 geni ifadesini normalize.
6. Karyotip Analizi
   1. Kültür, imalatçının talimatları izlenerek iPSCs için ticari tanımlandığı gibidir, besleyici içermeyen bakım ortamı ile besleyici içermeyen bazal membran matrisi kaplı plaka üzerine 5-6 gün iPSC kolonileri.
   2. Kromozom analizi protokolü başlatmak için, tek hücreli bir ayrışma elde edilene kadar, 37 ° C'de 5 dakika boyunca, hücre ayırma çözeltisi, 1 ml iPSC kolonileri ayırmak.
   3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri ve toplayın.
   4. Bir ortam 2 ml yeniden süspanse iPSCs özellikle prenatal tanı için hücrelerin kültürlenmesi için geliştirilmiştir. Bazal membran matrisi kaplı cam tabaklar üzerine levhalar tek hücreli iPSCs ve 37 ° C de inkübe% 5 _{CO2 <}/ Sub> inkübatör.
   5. 2-4 gün sonra, kültürlere doğrudan 10 ul / ml kolşisin ekleyebilir ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 _CO2 de 3 saat inkübe edilir.
   6. Orta aspire ve oda sıcaklığında 10 dakika hipotonik çözelti (% 0.6 sodyum sitrat ve% 0.13 potasyum klorür) 1 ml iPSCs inkübe edin.
   7. % 5 asetik asit çözeltisi, 1 ml hücre durulayın ve metanol / asetik asit solüsyonu ile iPSCs tamir (oran 3: 1) ile kontrol edilen sıcaklık ve nem içeren bir makine (28 ° C,% 42 bağıl nem).
   8. Daldırın ve karanlıkta, oda sıcaklığında 15-20 dakika boyunca Kinakrin çözeltisi ile leke sabit hücreler ³⁰ (Q-bandı) elde edilmiştir.
   9. 100X büyütme ^29, flöresanlı bir mikroskop altında hücre metafaz elde edin.

Sonuçlar

Bu çalışmada, tam kan merkezkaç ve yoğunluk dereceli ayırma bildirilir sonra elde edilen PBMNCs resetleme ile karşılaştırıldığında sonra dondurulmuş buffy kat izole PBMNCs resetleme viral içermeyen iPSCs üretilmesi için basit ve etkin bir protokol. Şekil 1A şematik bir temsilini göstermektedir ayrıntılı bir protokol. Çözündükten sonra, tipik bir yuvarlak şeklini gösteren izole PBMNCs, 14 gün süre ile belirli bir kan kültür ortamı (Şekil 1B) yayılır ...

Tartışmalar

Geçmişte, tek yolu, belirli bir genetik mutasyon taşıyan insan pluripotent kök hücreleri elde etmek için pre-implantasyon genetik tanı geçiren anne işe ve onların atılır blastosist ^31,32 embriyonik kök hücreleri oluşturmak oldu. Bir yeniden programlama yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar şimdi hemen hemen her genotipi taşıyan hastaların iPSCs üretebilirsiniz. olasılık hastaya özgü hücre hattından başlamak ve hastalıkların patofizyolojisi ve yeni terapötik yaklaşımların...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube	Terumo	VF-054SBCS07
Ammodium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Potassium bicarbonate	Sigma-Aldrich	60339
EDTA disodium powder	Sigma-Aldrich	E5134	0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)	Gibco	21056-023	No phenol red
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)	Gibco	51500-056	1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031	1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)	PeproTech	300-07	100 ng/ml (Stock:100 µg/ml)
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)	PeproTech	200-03	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)	PeproTech	100-11	40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin	R&D Systems	2914-HT	100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II	Gibco	11269016	Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1	StemCell Technologies	5850	Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010	0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa	R&D Systems	4114-TC	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503	10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum	Hyclone	SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Merck-Millipore	ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230
Collagenase, Type IV	Gibco	17104-019	1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007	Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)	Global Stem	GSC-6201G	1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK	Addgene	27078	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL	Addgene	27080	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP	Addgene	27082	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit	Stemgent	00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody	Merck-Millipore	MAB4304	1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody	Merck-Millipore	MAB4360	1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody	Merck-Millipore	MAB4381	1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-9081	1/500
Anti-Nanog Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-33759	1/500
Anti-Troponin I Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-15368	1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody	Sigma-Aldrich	A7732	1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody	Covance Research Products Inc	MMS-435P-100	1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Calbiochem	657012	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse	Molecular Probes	A-11029	1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit	Molecular Probes	A-21429	1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate	Corning	3471
Trizol Reagent	Ambion	15596-018	reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Invitrogen	11754050	Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	185-5195
Experion Automated Electrophoresis System	Bio-Rad	700-7000	Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit	Bio-Rad	7007105	Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )	Zeiss	495007
NeonTransfection System 100 µl Kit	Invitrogen	MPK10025	Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit