Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Zusammenfassung

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Zusammenfassung

Somatischen Zellen kann durch die Expression von vier Transkriptionsfaktoren (Oct-4, Sox-2, Klf-4, und c-Myc) zwingt in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) umprogrammiert werden, typischerweise durch menschliche embryonale Stammzellen exprimiert (hES) . Aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit HES-Zellen, haben iPSCs ein wichtiges Instrument für potenzielle Patienten-spezifischen regenerativen Medizin zu werden, die Vermeidung ethischer Fragen mit HES-Zellen verbunden. Um geeignete Zellen für die klinische Anwendung zu erhalten, müssen Transgen freien iPSCs erzeugt werden, um transgene Reaktivierung veränderte Genexpression und fehlgeleiteten Differenzierung zu vermeiden. Außerdem ist eine hocheffiziente und kostengünstige Anpassung Verfahren notwendig, eine ausreichende iPSCs für therapeutische Zwecke abzuleiten. Angesichts dieser Notwendigkeit, ist eine effiziente Integration von nicht-episomale Plasmid-Ansatz die bevorzugte Wahl für iPSC Ableitung. Derzeit die häufigste Zelltyp für eine Neuprogrammierung Zwecke sind Fibroblasten, die Isolierung von denen erfordert Gewebebiopsie, eine invasive chirurgischen Prozedur für den Patienten. Daher menschlichem peripheren Blut stellt den am besten zugänglichen und am wenigsten invasive Gewebe für iPSC Generation.

In dieser Studie wird ein kostengünstiges und virale freies Protokoll unter Verwendung nicht-integrierenden episomalen Plasmiden zur Erzeugung iPSCs aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNC), nachdem Gesamtblut zentrifugiert und ohne Dichtegradiententrennung aus gefrorenen Leukozytenfilmen berichtet wird.

Einleitung

In 2006 hat die Gruppe von Shinya Yamanaka ¹ gezeigt, zum ersten Mal, dass Körperzellen aus adulten Mäusen und Menschen können durch ektopische Expression von vier Reprogrammierungsfaktoren (Oct-4, Sox-2, Klf-4, und in einem pluripotenten Zustand umgewandelt werden c-Myc), die Erzeugung der sogenannten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) ^2. Patientenspezifische iPSCs ähneln menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) in Bezug auf die Morphologie, Proliferation und die Fähigkeit, in die drei Keimzelltypen (Mesoderm, Endoderm und Ektoderm) differenzieren, während ohne die ethische Bedenken auf die Verwendung von HES-Zellen und Bypass zugeordnet mögliche Immunabstoßung ^3. Somit iPSCs erscheinen als eine der wichtigsten Quellen von patientenspezifischen Zellen für die Grundlagenforschung, Drug Screening, Krankheitsmodelle, Bewertung der Toxizität und der regenerativen Medizin Qualität ^4.

Es wurden mehrere Ansätze für iPSC Generation verwendet: viralen Integrationsvektoren(Retrovirus ^5, Lentivirus ^6), virale nicht-Integrationsvektoren (Adenovirus ^{7), Sendai-Virus-8,} BAC Transposons ^9, episomale Vektoren ^{10, 11} Proteine ​​oder RNA-Lieferung ^12. Obwohl die Verwendung von Virus-vermittelte Methoden können eine hohe Effizienz Neuprogrammierung führen, in das Genom der Wirtszellen und daher potentielle Zufalls Insertionsmutagenese integrieren virale Vektoren können permanente Veränderung der Genexpression und Reaktivierung von Schweigen Transgenen während der Differenzierung nicht ausgeschlossen werden ^13.

Um iPSCs sicherer für die regenerative Medizin zu machen, wurden Anstrengungen unternommen, um iPSCs ohne die Integration von exogener DNA in zelluläre Genome abzuleiten. Obwohl verbrauch viralen Vektoren und Transposons entwickelt wurden, ist es noch unklar, ob die kurze Vektorsequenzen, die zwangsläufig verbleiben in den transduzierten Zellen nach der Exzision und Transposaseexpression könnte Veränderung Zelle induzierendere funktionieren ^13. Trotz seiner hohen Effizienz Neuprogrammierung, Sendai-Virus stellt eine teure Vorgehensweise und zu erreichen, durch Lizenz Anliegen mit dem Unternehmen, die dieses System entwickelt, haben das Potenzial, ihre Anwendung in der translationalen Studien zu begrenzen. Darüber hinaus die Notwendigkeit für eine direkte Einführung von Proteinen und RNA erfordert mehrere Lieferung der Neuprogrammierung Moleküle mit den innewohnenden technischen Beschränkungen dieser führt, und die allgemeine Anpassung Effizienz ist sehr gering ^14. Zu beachten ist, kosteneffektiv virale frei und nicht-integrierenden Methoden basierend auf der Verwendung von episomalen Plasmiden wurden erfolgreich für die Umprogrammierung der Hautfibroblasten ¹⁵ gemeldet. Insbesondere wird in der vorliegenden Arbeit haben wir beschlossen, im Handel erhältlichen Integration freien episomalen Plasmiden verwenden, wie bereits berichtet ^10,15.

Bisher Haut-Fibroblasten stellen die beliebtesten Spenderzelle Typ ^5. Aber auch andere Zellquellen wurden successfully in iPSCs einschließlich Keratinozyten ^16, Knochenmark mesenchymale Stammzellen ^17. Fettgewebe Stromazellen ¹⁸ umprogrammiert, Haarfollikel ¹⁹ und Zahnmark-Zellen ^20. Die Isolierung dieser Zellen erfordert chirurgischen Verfahren und mehreren Wochen werden für in vitro-Zellexpansion, um eine primäre Zellkultur zu etablieren benötigt.

In diesem Licht ist die Auswahl der Ausgangszelltyp kritisch und es ist ebenso wichtig, iPSCs von leicht zugänglichen und weniger invasiv Geweben wie Blut erzeugen. Beide Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CBMNCs) ^21,22 und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) ^14,22-24 repräsentieren geeignete Quellen von Zellen für die Ableitung iPSCs.

Obwohl die Effizienz der erwachsenen PBMNC Umprogrammieren 20-50 mal niedriger als die von CBMNCs ^22, bleiben sie die bequemste Zelltyp für die Beprobung. InTatsächlich hat PBMNC Probenahme den Vorteil, dass minimal-invasive, und außerdem sind diese Zellen nicht umfangreiche Expansion in vitro vor der Reprogrammierung Experimente erfordern. Bislang wurden unterschiedliche Protokolle berichtet, dass PBMNCs nach Dichtegradienten-Trennung nach dem Gefrieren eingefroren und aufgetaut Tage bis mehrere Monate und für einige Tage expandiert, bevor für die Umprogrammierung in iPSCs ^22,23. Dennoch, soweit wir wissen, keine Berichte Umprogrammierung PBMNCs aus gefrorenen Buffy Coats beschrieben. Wichtig ist, dass gefrorene Buffy Coats ohne Dichtegradiententrennung gesammelt stellen die in großem Umfang von Biobanken Bevölkerungsstudien gespeichert und stellt somit eine leicht zugängliche Pool von Material für iPSC Produktion, die weitere Probennahme vermeidet häufigsten Blutproben.

Berichten wir hier zum ersten Mal die Erzeugung von Virusfrei iPSCs aus menschlichen gefrorenen buffy coats, basierend auf einem zuvor beschriebenen Protokoll ^22. InAußerdem wurden aus gefrorenen iPSCs PBMNCs nach Dichtegradiententrennung erhalten erzeugt als Steuerprotokoll für die nicht-Dichtegradienten gereinigt PBMNC Ergebnisse.

Protokoll

Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) wurden aus menschlichen peripheren Blut-Proben nach der unterzeichneten Einverständniserklärung und Zustimmung der Ethikkommission der Provinz Bozen gesunden Spendern isoliert. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den in der Deklaration von Helsinki verankerten Grundsätze durchgeführt. Alle Daten wurden gesammelt und anonym ausgewertet.

1. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNC)

1. PBMNCs aus Buffy Coats nach Vollblut Zentrifugation erhalten, ohne Dichtegradiententrennung.
   1. Sammeln Sie 8 ml venösen peripheren Blut in eine Natriumcitrat gepuffert Kunststoffrohr, und lagern bei RT (25 ° C). Verfahren Blut innerhalb von 12 Stunden nach der Sammlung.
   2. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2.000 xg für 15 min bei 4 ° C in einem Schwingbehälter-Rotor, Ausschalten der Zentrifuge Bremsen.
   3. Sammeln Sie die bewölkten Buffy-Coat (die Schicht zwischen der oberen Plasmaphase und der unterenPhase, die die meisten Erythrozyten), die das angereicherte PBMNC Fraktion (500 & mgr; l) in ein Kryoröhrchen Röhre.
   4. Resuspendieren 500 ul Leukozytenmanschette mit 500 ul 2x Gefriermedium, enthaltend 90% FBS und 20% DMSO, um ein Gesamtvolumen von 1 ml mit 10% DMSO-Konzentration zu erhalten.
   5. Frieren Sie das Fläschchen in einer kontrollierten Rate Gefrierbehälters bei -80 ° C. Speicher-Zellen in flüssigem Stickstoff für längere Zeiträume.
2. PBMNCs nach Dichtegradiententrennung erhalten
   1. Sammeln Sie 12 ml venöses peripheren Blut in eine Natriumcitrat gepuffert Kunststoffrohr, und lagern bei RT. Verfahren Blut innerhalb von 12 Stunden nach der Sammlung.
   2. Verdünne das Blut mit steriler PBS auf ein Endvolumen von 35 ml.
   3. Vorsichtig und langsam, Schicht 35 ml verdünntes Blut auf 15 ml Polysaccharose Lösung (für Dichtegradiententrennung verwendet) (p = 1,077) in einem 50 ml konischen Röhrchen (Verhältnis 3: 1).
   4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 800 g für 30 min bei RT ineinem Schwingbecher-Rotor, Ausschalten der Zentrifuge Bremsen.
   5. Saugen Sie das obere, gelbe Phase, die Plasma- und entsorgen Sie sie. Vorsichtig, übertragen Sie die Deckweiß Zwischenphasenschicht enthält PBMNCs auf ein neues 50 ml konischen Röhrchen.
   6. Bringen Gesamtvolumen auf 30 ml mit steriler PBS verdünnt und bei 300 g zentrifugiert für 10 min bei RT.
   7. Überstand verwerfen und die Zellen resuspendieren mit 30 ml PBS. Zählen die Anzahl von lebensfähigen Zellen, basierend auf Trypanblau-Ausschluß ^25.
   8. Centrifuge PBMNCs bei 300 × g für 10 min bei RT, den Überstand aspirieren und entsorgen.
   9. Zellpellet in einer geeigneten Menge an Gefriermedium, enthaltend 90% FBS und 10% DMSO, um eine Konzentration von 5 x 10 ⁶ Zellen / ml zu erhalten.
   10. Aliquot 1 ml pro Fläschchen (ca. 5 x 10 ⁶ Zellen / ml) und frieren das Fläschchen in einer kontrollierten Rate Gefrierbehälter bei - 80 ° C. Speicher-Zellen in flüssigem Stickstoff für längere Zeiträume.

2. Auftauen und Oberflächen von PBMNC (Tag 0)

1. PBMNCs aus Buffy Coats nach Vollblut Zentrifugation erhalten, ohne Dichtegradiententrennung.
   1. Das Protokoll mit PBMNC aus gefrorenen Leukozytenfilmen starten, auftauen 1 Ampulle von Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° C und verdünnt das buffy coat mit steriler PBS auf ein Endvolumen von 2 ml.
   2. Übertragen Sie die verdünnte Buffy-Coat in eine 50 ml konischen Röhrchen, 10 ml rot Zelllysepuffer und Inkubation für 10 min bei RT.
   3. Die Bereitstellung 500 ml Erythrozyten Lysepuffer, mit 0,5 g Kaliumbicarbonat, 4,145 g Ammoniumchlorid, 100 & mgr; l von 0,5 M EDTA-Lösung zu 500 ml ultrareinem Wasser, pH 7,2-7,4.
   4. Bringen Gesamtvolumen auf 50 ml mit sterilem PBS und zentrifugieren bei 300 × g für 10 min bei RT.
   5. Überstand verwerfen und waschen das Pellet mit 50 ml sterilem PBS Zentrifugation der Buffy-Coat bei 300 × g für 10 min bei RT.
   6. Resuspendieren der Zellen in1 ml PBMNC Medium, wie zuvor beschrieben, ^22, aus: IMDM und Hams F-12 (Verhältnis 1: 1), 1% der Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin (ITS-X), 1% der chemisch definierten Lipid-Konzentrat (CDL), 1% Penicillin / Streptomycin, 0,005% L-Ascorbinsäure, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA), 1-Thioglycerin (Endkonzentration 200 uM), Stammzellfaktor SCF (100 ng / ml), Interleukin -3 IL-3 (10 ng / ml), Erythropoietin EPO (2 E / ml), Insulin-like Growth Factor-IGF-1 (40 ng / ml), Dexamethason (1 uM) und Holo-Transferrin (100 ug / ml ).
   7. Überführen diese in eine Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen mit Standardgewebekultur-behandelten Oberfläche ohne Beschichtung, in einer Dichte von 2 x 10 ⁶ Zellen / ml. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator für 48 Stunden, bis die Änderungsmedium Schritt (siehe Abschnitt 3).
2. PBMNCs nach Dichtegradiententrennung erhalten
   1. Um das Protokoll zu starten mit gefrorenen PBMNCs nachDichtegradiententrennung, Tau-1 Fläschchen von Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° C, übertragen Sie die Zellen in 5 ml Medium PBMNC. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei RT.
   2. Resuspendieren der Zellen in 1 ml Medium PBMNC und sie in eine Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen bei einer Dichte von 2 x 10 ⁶ Zellen / ml. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator für 48 Stunden, bis die Änderungsmedium Schritt (siehe Abschnitt 3).

3. Kultur und Ausbau der PBMNCs (DAY 2-13)

1. Sammeln PBMNC in Suspensionskultur mit einer Pipette mit einer 1 ml-Spitze in einem 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 10 min bei RT.
2. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml frischem Medium PBMNC.
3. Übertragen Sie die Zellen in 1 auch von 12-Well-Platte mit Standardgewebekultur behandelte Oberfläche, ohne Beschichtung, und inkubieren sie bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator.
4. Wiederholen Sie diese Schritte alle zwei Tage, und teilen Sie die Zellen in einem Verhältnis 1: 2, wenn sie die entsprechende Zusammenfluss erreichen (rund 80%).

4. Transfektion von PBMNC mit episomalen Plasmiden (Tag 14)

Hinweis: Führen Sie die Isolierung von den vier Handels intergation freien episomalen Plasmiden, die Durchführung der Pluripotenz Gene unter Verwendung eines kommerziellen Kits für Plasmidreinigung und Bewertung der Qualität der gereinigten Plasmide unter Verwendung einer Agarose-Gel-Analyse, nach den Anweisungen des Herstellers.

1. Sammeln PBMNC in 15 ml konischen Röhrchen und die Anzahl der lebensfähigen Zellen (auf der Basis von Trypanblau-Ausschluss) ^25.
2. Zentrifuge 2 x 10 ⁶ Zellen bei 300 g für 10 min bei RT.
3. Resuspendieren 2 x 10 ⁶ Zellen in Transfektionsgemisch, das 100 ul Resuspensionspuffer T und 1 ug jedes Plasmid DNA (ein Plasmid, OCT3 / 4 und shRNA gegen p53, einem Plasmid, SOX2 und KLF4 manPlasmid, das L-MYC und Lin28 und ein Plasmid, EGFP, um die Transfektionseffizienz zu überprüfen).
4. Saugen Sie das Transfektionsgemisch mit den Zellen in eine 100 ul Spitze und legen Sie die Pipette mit der Probe senkrecht in das Rohr, mit 3 ml Elektrolyt-Puffer E2, in der Pipettenstation der Elektroporation Maschine platziert gefüllt ist, nach den Anweisungen des Herstellers.
5. Effizient elektroporieren Zellen mit dem folgenden Programm: 1650 V, 10 ms, 3 Impulse.
6. Resuspendieren der elektroporierten Zellen (2 × 10 ⁶ Zellen) in 2 ml des vorgewärmten PBMNC Medium unter Zugabe von 0,25 mM Natriumbutyrat (NaB) und die Anzahl der lebensfähigen Zellen nach der Elektroporation Protokoll (auf der Basis von Trypanblau-Ausschluss) ^25.
7. Übertragen Sie die Zellen in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte ohne Beschichtung, schaukeln die Platte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator.
8. Am Tag nach der Elektroporation count die Zahl der GFP-positiven Zellen unter Fluoreszenzmikroskopie 8-10 Zufallsfeldern, um die Transfektionseffizienz zu beurteilen.
9. Pflegen Sie die transfizierten Zellen ohne Splitting für 3 Tage, bis sie auf Plattierung MEFs (siehe Abschnitt 6).
10. Ersetzen Sie 2 ml frisches Medium PBMNCs, plus 0,25 mM NaB alle zwei Tage.

5. Bereiten Sie Gerichte mit Feeder-Zellen für die Co-Kultur (TAG 16)

1. Beschichten der Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen mit 1 ml Basalmembranmatrix für 15 min bei 37 ° C und die Platte embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) in einer Dichte von 2 x 10 ⁵ Zellen / Well mit 2 ml 10% FBS enthielt DMEM (MEF Medium) einen Tag vor der Passage der Elektroporation PBMNCs auf MEF Feeder-Zellen.

6. Plating Transfizierte PBMNCs auf MEFs (DAY 17-19)

1. Sammeln PBMNCs in Suspensionskultur, mit einer Pipette mit 1 ml Spitze, in 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren transfiziert PBMNCs bei 300 × g für 10 minbei RT.
2. Überstand verwerfen und das Pellet in 2 ml frisches Medium PBMNC, plus 0,25 mM NaB.
3. Platte der Zellen auf MEF beschichtet 6 Well-Platte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator.
4. Nach zwei Tagen, saugen Sie den mittleren und ersetzen Sie es mit 2 ml iPSC Medium aus DMEM knockout (KO-DMEM), 20% KO-Serum Replacement (KOSR), 1 mM NEAAs, 1% Penicillin / Streptomycin, 20 mM L- Glutamin, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 10 ng / ml FGF (Basic bFGF) und 0,25 mM NaB.
5. Ersetzen Sie 2 ml frisches Medium iPSC jeden Tag und überprüfen Sie die Zellen täglich.
   Hinweis: Bei etwa 22-25 Tage, sollten die ersten Kolonien iPSCs sichtbar sein.

7. Picking und Ausbau der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) Clones (DAY 30-35)

Hinweis: Bei etwa 30-35 Tage nach der Transfektion sollten iPSC Kolonien bereit für die Kommissionierung und replating sein. Die Umprogrammierung Effizienz sollte esti seingepaart als der Prozentsatz der Anzahl von iPSC Kolonien / Gesamtzahl der elektroporierten Zellen, wie zuvor berichtet ^26.

1. Am Tag vor der Passage iPSC Kolonien, bereiten Sie die MEF Feeder in einer 12-Well-Platte (1,25 x 10 ⁵ Zellen / Vertiefung).
2. Saugen Sie die MEF Medium und ändern mit 1 ml iPSC Medium mit 10 ng / ml bFGF und 10 & mgr; M Y-27632. Manuell sezieren mit einer Nadel eine Kolonie zu jeder Zeit unter dem Binokular im Kommissionierbereich-Haube, um ein Raster zu erhalten, sammeln kleineren Klumpen durch Pipettieren und übernehmen diese einzeln jeweils in eine Vertiefung 12-Well-Platte mit MEFs beschichtet.
3. Passage und erweitern Sie jede 12-Well-Platte zu einer 6-Well-Platte in einem Verhältnis 1: 2, dann jede 6-Well-Platte in einem Verhältnis 1: 4 für die weitere Vermehrung. Sezieren und zu erweitern iPSCs manuell für die ersten 2-3 Durchgängen (wie in Schritt 7.2 gründlich beschrieben), dann verwenden Sie ein Enzym Dissoziation Verfahren (ab Schritt 7.4).
4. Für ein Enzym Dissoziation Protokoll, sauber iPSC colonies durch Absaugen differenzierte Teile unter dem Binokular im Kommissionierbereich-Haube.
5. IPSCs mit 1 ml Collagenase IV (1 mg / ml) für 10 min bei 37 ° C.
6. Saugen Sie das Enzymlösung, spülen Sie die Zellen mit 1 ml DMEM-KO und sammeln die Kolonien in einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 100 × g für 2 min bei RT.
7. Den Überstand aspirieren, zu suspendieren, die Kolonien in 2 ml iPSC Medium mit 10 ng / ml bFGF und 10 & mgr; M Y-27632 und die Platte sie auf MEF beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen (Verhältnis 1: 4).

8. Charakterisierung iPSCs (zwischen 5-15 Passages)

1. Alkalische Phosphatase-Färbung
   1. Kultur IPSC Kolonien für 3-5 Tage in iPS-Medium mit 10 ng / ml bFGF.
   2. Zum Starten eines alkalischen Phosphatase-Färbung Protokoll gründlich iPSCs einmal mit PBS und dann befestigen Sie sie mit 1 ml 4% PFA für 20 min bei RT.
   3. Mit PBS waschen die Zellen dreimal, um restliche PFA entfernen.
   4. Stain fixierten Zellen miteinen handelsüblichen alkalischen Phosphatase-Färbung Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Immunfluoreszenz
   1. Kultur IPSC Kolonien für 3-5 Tage in iPS-Medium mit 10 ng / ml bFGF.
   2. Um eine Immunfluoreszenztest beginnen, waschen iPSCs einmal mit PBS und dann befestigen Sie sie mit 1 ml 4% PFA für 20 min bei RT.
   3. Mit PBS waschen die Zellen dreimal, um restliche PFA entfernen.
   4. Behandlung von festen iPSCs mit 1 ml Permeabilisierung / Blockierlösung, die 4% Ziegenserum, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 und 0,05% Natriumazid (NaN ₃₎ für 1 h bei RT.
   5. Saugen Sie das Blockierungslösung und Inkubation der fixierten Zellen mit primären Antikörpern in 3% BSA und 0,05% NaN ₃ -Lösung O / N bei 4 ° C (überprüfen Sie die Materialtabelle für primäre Antikörper Liste und schlug vor, Antikörperverdünnungsfaktor).
   6. Am nächsten Tag, waschen iPSCs dreimal mit PBS, dann inkubieren Sie die Zellen mit Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus und Alexa Fluor 555 Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, verdünnt 1: 1000 in 3% BSA und 0,05% NaN _{3 -Lösung} für 1 Stunde bei 37 ° C.
   7. Färben die Kerne mit DAPI (1 ug / ml) für 10 min bei RT im Dunkeln, gefolgt von drei Mal mit PBS gewaschen.
3. Differenzierung von iPS-Zellen in Embryoid Bodies (EBS)
   1. Kultur IPSC Kolonien für 5-6 Tage in iPS-Medium mit 10 ng / ml bFGF.
   2. Entfernen differenzierte Teile von iPSC Kolonien durch Absaugen unter dem Binokular im Kommissionierbereich-Haube.
   3. IPSCs mit 1 ml Collagenase IV (1 mg / ml) für 10 min bei 37 ° C.
   4. Saugen Sie das Enzymlösung, spülen Sie die Zellen mit 1 ml DMEM-KO und sammeln die Kolonien in einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 100 × g für 2 min bei RT.
   5. Absaugen des Überstandes und Resuspendieren der Kolonien in 2 ml EB Medium KO-DMEM, 20 definiert% fötalem Rinderserum (FBS), 1 mM NEAAs, 1% Penicillin / Streptomycin, 20 mM L-Glutamin, 0,1 mM46; -Mercaptoethanol.
   6. Teller iPSC Kolonien in Suspension für 6 Tage auf ultra-niedrige Befestigung 6-Well-Platten, um die Bildung von Kugel dreidimensionale Embryoidkörpern (EBS) zu ermöglichen. Ändern Sie 2 ml frischem EB Medium alle zwei Tage.
   7. Am Tag 7, sammeln EBs und platten sie auf 0,1% Gelatine beschichtete 6-Well-Platten in 2 ml Medium, EB und beizubehalten EBs Differenzierung für 20 Tage.
   8. Ändern Sie 2 ml frischem EB Medium alle zwei Tage.
4. qRT-PCR für die Genexpressionsanalyse
   1. Kultur IPSC Kolonien für 5-6 Tage in iPS-Medium mit 10 ng / ml bFGF.
   2. Auszug Gesamt-RNA aus PBMNC, iPSCs oder EVG mit 1 ml der kommerziellen Reagenz gemäß Herstellerangaben.
   3. Werten Sie RNA-Konzentration und Reinheit durch geeignete Verfahren, wie beispielsweise die Verwendung eines Spektrophotometers (hochwertige RNA A ₂₆₀ / A ₂₈₀ und A ₂₆₀ / A _{230-Verhältnisse>} 1,8) ^27.
   4. ScheckRNA-Integrität mit einem kommerziellen Kit nach Herstellerprotokoll (hochwertige RNA RQI> 9.5) ^28.
   5. Durchführen einer reversen Transkriptionsreaktion von 1 ug Gesamt-RNA unter Verwendung eines kommerziellen reverse Transkriptase-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
   6. Bereiten Sie die qPCR Mischungen, die 5 ng des cDNA-Matrize, 7,5 ul SYBR Green Supermix, 2 & mgr; l von 5 & mgr; M Primer (vorwärts: 1 & mgr; l und rückwärts: 1 & mgr; l) und 6 & mgr; l RNase / DNase-freies Wasser für jede Reaktion ^29.
   7. Führen der qRT-PCR unter Verwendung des folgenden Programms: eine anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 Sekunden und Annealing und Verlängerungsschritt in einen Denaturierungsschritt unterteilt bei 60ºC für 45 sec ^29.
   8. Normalisieren die Expression anderer Gene mit GAPDH als Housekeeping-Gen ²⁸ (siehe die in Tabelle 1 aufgeführten Primer).
5. qPCRfür Transgene Ausschluss
   1. Extrahieren von DNA aus PBMNC oder iPSCs mit 1 ml Lysepuffer, der 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 20 ug / ml Proteinase K.
   2. In das gleiche Volumen (1 ml) von 100% Isopropanol, mischen durch Umdrehen dreimal, um DNA-Niederschlag und Zentrifuge bei 10.000 × g für 5 min bei RT ermöglichen.
   3. Überstand verwerfen, waschen Sie die DNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und Zentrifuge bei 10.000 × g für 5 min bei RT. Absaugen und den Überstand verwerfen und resuspendieren sie in RNase / DNase-freiem Wasser.
   4. Werten Sie die DNA-Konzentration und Reinheit durch geeignete Verfahren, wie beispielsweise die Verwendung eines Spektrophotometers (hochwertige RNA A ₂₆₀ / A ₂₈₀ und A ₂₆₀ / A _{230-Verhältnisse>} 1,8) ^27.
   5. Bereiten Sie die qPCR Mischungen, die 5 ng der DNA-Matrize, 7,5 ul SYBR Green Supermix, 2 & mgr; l von 5 & mgr; M Primer (vorwärts: 1 & mgr; l und rückwärts: 1 & mgr; l) und 6 &# 181; l RNase / DNase-freies Wasser für jede Reaktion ^29.
   6. Normalisieren die Expression spezifischer episomale Plasmid-EBNA-1-Gens mit FBX-15 als Housekeeping-Gen ²⁹ (siehe die in Tabelle 1 aufgeführten Primer).
6. Karyotypanalyse
   1. Kultur IPSC Kolonien für 5-6 Tage auf Feeder-freien Basalmembranmatrix beschichtete Platte mit einer kommerziellen definiert, Feeder freien Erhaltungsmedium für iPSCs nach Herstellerangaben.
   2. Um die Karyotyp-Analyse-Protokoll zu starten, trennen iPSC Kolonien mit 1 ml Zellablösung Lösung für 5 min bei 37 ° C, bis zum Erhalt Single-Cell-Dissoziation.
   3. Sammeln Zellen und Zentrifugieren bei 400 xg für 5 Minuten bei RT.
   4. Resuspendieren iPSCs in 2 ml eines Mediums, insbesondere zur Kultivierung von Zellen zur pränatalen Diagnosetechniken entwickelt. Platte Einzelzell iPSCs auf Basalmembranmatrix beschichtete Glasschalen und inkubieren sie in einem 37 ° C, 5% CO _{2 <}/ Sub> Inkubator.
   5. Nach 2-4 Tagen, mit 10 ul / ml Colchicin direkt zu den Kulturen und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator.
   6. Absaugen Medium und Inkubation iPSCs in 1 ml eines hypotonischen Lösung (0,6% Natriumcitrat und 0,13% Kaliumchlorid) für 10 min bei RT.
   7. Spülen Zellen mit 1 ml 5% iger Essigsäurelösung und fixieren iPSCs mit Methanol / Essigsäure-Lösung (Verhältnis 3: 1) in einer Maschine mit kontrollierter Temperatur und Feuchtigkeit (28 ° C, 42% relative Luftfeuchtigkeit).
   8. Tauchen und schmutz fixierten Zellen mit Quinacrine Lösung für 15-20 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit ³⁰ (Q-Banding zu erhalten).
   9. Erwerben Zelle Metaphasen unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 100-facher Vergrßerung ^29.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde ein einfaches und wirksames Protokoll für die Erzeugung von Virusfrei iPSCs durch Umprogrammierung PBMNC aus gefrorenen buffy coats, nachdem Gesamtblut zentrifugiert und Vergleich mit Umprogrammierung PBMNCs nach Dichtegradiententrennung wird berichtet, erhalten wurde, isoliert. 1A zeigt eine schematische Darstellung das detaillierte Protokoll. Nach dem Auftauen werden die isolierten PBMNC, welches einen typischen abgerundete Form werden in spezifischen Blutkulturmedium für 14 T...

Diskussion

In der Vergangenheit war die einzige Möglichkeit, menschlichen pluripotenten Stammzellen, die einen bestimmten genetischen Mutation zu erhalten war, die Eltern unterziehen vor der Implantation genetische Diagnose zu rekrutieren und zu erzeugen embryonale Stammzellen aus ihrem verworfen Blastozysten ^31,32. Unter Verwendung einer Neuprogrammierung Ansatz können die Forscher nun iPS von Patienten trägt nahezu jeder Genotyp zu erzeugen. Die Möglichkeit, von einem patientenspezifischen Zelllinie beginnen und e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube	Terumo	VF-054SBCS07
Ammodium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Potassium bicarbonate	Sigma-Aldrich	60339
EDTA disodium powder	Sigma-Aldrich	E5134	0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)	Gibco	21056-023	No phenol red
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)	Gibco	51500-056	1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031	1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)	PeproTech	300-07	100 ng/ml (Stock:100 µg/ml)
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)	PeproTech	200-03	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)	PeproTech	100-11	40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin	R&D Systems	2914-HT	100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II	Gibco	11269016	Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1	StemCell Technologies	5850	Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010	0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa	R&D Systems	4114-TC	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503	10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum	Hyclone	SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Merck-Millipore	ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230
Collagenase, Type IV	Gibco	17104-019	1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007	Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)	Global Stem	GSC-6201G	1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK	Addgene	27078	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL	Addgene	27080	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP	Addgene	27082	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit	Stemgent	00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody	Merck-Millipore	MAB4304	1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody	Merck-Millipore	MAB4360	1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody	Merck-Millipore	MAB4381	1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-9081	1/500
Anti-Nanog Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-33759	1/500
Anti-Troponin I Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-15368	1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody	Sigma-Aldrich	A7732	1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody	Covance Research Products Inc	MMS-435P-100	1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Calbiochem	657012	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse	Molecular Probes	A-11029	1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit	Molecular Probes	A-21429	1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate	Corning	3471
Trizol Reagent	Ambion	15596-018	reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Invitrogen	11754050	Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	185-5195
Experion Automated Electrophoresis System	Bio-Rad	700-7000	Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit	Bio-Rad	7007105	Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )	Zeiss	495007
NeonTransfection System 100 µl Kit	Invitrogen	MPK10025	Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit