Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Frozen Buffy Manteaux en utilisant non-intégration épisomique plasmides

Résumé

Cellules souches pluripotentes induites (CISP) représentent une source de tissus spécifiques au patient pour des applications cliniques et la recherche fondamentale. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour reprogrammer les cellules humaines périphériques mononucléaires du sang (de PBMNCs) obtenus à partir de couches leucocytaires congelés en CSPi virales sans l'aide de non-intégration des plasmides épisomiques.

Résumé

Les cellules somatiques peuvent être reprogrammées en cellules souches pluripotentes induites (CISP) en forçant l'expression de quatre facteurs de transcription (Oct-4, Sox-2, KLF-4, et c-Myc), généralement exprimé par les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) . En raison de leur similitude avec les CSEh, CSPi sont devenus un outil important pour la médecine régénérative potentiel spécifique au patient, en évitant les questions éthiques liées aux CSEh. Afin d'obtenir des cellules appropriées pour une application clinique, CSPi gratuitement transgènes doivent être générés pour éviter transgène réactivation, l'expression du gène altéré et la différenciation erronée. En outre, un procédé de reprogrammation est performant et peu coûteux est nécessaire pour obtenir iPSCs suffisantes à des fins thérapeutiques. Compte tenu de cette nécessité, une approche efficace non-intégration plasmide épisomique est le choix préférable pour iPSC dérivation. Actuellement type cellulaire le plus couramment utilisé à des fins de reprogrammation sont les fibroblastes, dont l'isolement nécessite une biopsie tissulaire, un invasive intervention chirurgicale pour le patient. Par conséquent, le sang périphérique humain représente le tissu le plus accessible et moins invasif pour la génération iPSC.

Dans cette étude, un protocole de rapport coût-efficacité et virale sans l'aide de non-intégrant des plasmides épisomiques est signalé pour la génération de iPSCs à partir de cellules mononucléaires périphériques humaines dans le sang (de PBMNCs) obtenus à partir de couches leucocytaires congelés après centrifugation de sang entier et sans séparation en gradient de densité.

Introduction

En 2006, le groupe de Shinya Yamanaka ¹ a démontré pour la première fois que des cellules somatiques de souris et les humains adultes peuvent être convertis en un état ​​pluripotent par l'expression ectopique de quatre facteurs de reprogrammation (Oct-4, Sox-2, KLF-4, et c-Myc), générer les soi-disant cellules souches pluripotentes induites (CISP) ^2. CSPi spécifiques au patient ressemblent étroitement à des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en termes de morphologie, la prolifération et la capacité de se différencier en types de cellules de trois de germe (mésoderme, endoderme et ectoderme) tout en manquant les préoccupations éthiques liées à l'utilisation des CSEh et contournement possible rejet immunitaire ^3. Ainsi, CSPi apparaît comme l'une des sources les plus importantes de cellules spécifiques au patient pour la recherche fondamentale, le dépistage des drogues, la modélisation de la maladie, l'évaluation de la toxicité, et à des fins de médecine régénérative ^4.

Plusieurs approches ont été utilisées pour la génération iPSC: vecteurs d'intégration virale⁽⁵ rétrovirus, les lentivirus ^6), virale non des vecteurs d'intégration (adénovirus ^7), Sendai-virus ^8, transposons BAC ^9, vecteurs épisomiques ^{10, 11} protéines ou de la livraison de l'ARN ^12. Bien que l'utilisation de méthodes de médiation virale peut conduire à l'hypertension reprogrammation de l'efficacité, des vecteurs viraux intégrer dans le génome des cellules hôtes et donc un potentiel mutagenèse par insertion aléatoire, altération permanente de l'expression génique, et la réactivation de transgènes au silence lors de la différenciation ne peut être exclue ^13.

Pour faire CSPi plus sûr pour la médecine régénérative, des efforts ont été faits pour tirer CSPi sans l'intégration de l'ADN exogène dans les génomes cellulaires. Bien que des vecteurs viraux et transposons soumis à accises ont été développés, il est encore difficile de savoir si courtes séquences du vecteur, qui restent inévitablement dans les cellules transduites après excision, et transposase expression, pourraient induire une altération dans la celluleparti- fonctionnent ^13. Malgré sa grande efficacité de reprogrammation, le virus Sendai représente une approche coûteuse et atteindre par-licence préoccupations avec la société qui a développé ce système ont le potentiel pour limiter son application dans les études translationnelles. En outre, la nécessité pour l'introduction directe de protéines et d'ARN nécessite la livraison multiple de reprogrammer des molécules avec les limitations techniques inhérentes Cela introduit, et l'efficacité globale de reprogrammation est très faible ^14. Il faut noter que les méthodes virales libres et non rentables intégration basée sur l'utilisation de plasmides épisomiques ont été rapportés avec succès pour la reprogrammation des fibroblastes de peau ^15. Plus précisément, dans le présent travail, nous avons décidé d'utiliser disponibles plasmides épisomiques gratuitement intégration commerciales, comme indiqué précédemment ^10,15.

À ce jour, les fibroblastes de la peau représentent la plus populaire type de cellule donneuse ^5. Cependant, d'autres sources de cellules ont été successfully reprogrammé en iPSCs y compris ¹⁶ des kératinocytes, des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse, des cellules ¹⁷ stromales adipeuses ^{18, 19} follicules pileux et les cellules de pulpe dentaire ^20. L'isolement de ces cellules nécessite une intervention chirurgicale, et plusieurs semaines sont nécessaires pour l'expansion in vitro de cellules en vue d'établir une culture de cellules primaires.

Dans cette optique, la sélection de départ type de cellule est critique et il est tout aussi important d'être capable de produire des CSPi à partir de tissus facilement accessibles et moins invasifs tels que le sang. Les cellules mononucléaires de sang de cordon ^(21,22) de CBMNCs périphériques et les cellules mononucléées du sang ^(14,22-24) PBMNCs représentent des sources de cellules appropriés pour la dérivation de iPSCs.

Bien que l'efficacité de reprogrammation PBMNC adulte est de 20 à 50 fois inférieure à celle de CBMNCs ^22, ils restent le type cellulaire le plus commode à des fins d'échantillonnage. Dansfait, PBMNC échantillonnage présente l'avantage d'être très peu invasive, et en plus, ces cellules ne nécessitent pas une vaste extension des expériences in vitro avant de reprogrammation. À ce jour, différents protocoles ont rapporté que PBMNCs après la séparation de gradient de densité peuvent être congelés et décongelés jours à plusieurs mois après congélation et élargis pour quelques jours avant de reprogrammer en CSPi ^22,23. Néanmoins, dans la mesure où nous sommes conscients aucun rapports ont décrit une reprogrammation de PBMNCs de couches leucocytaires congelés. Surtout, buffy coats congelés prélevés sans séparation de gradient de densité représentent des échantillons de sang les plus courantes stockées dans les grandes biobanques à l'échelle des études de population, ce qui représente une piscine facilement accessible du matériel de production iPSC qui évite en outre la collecte d'échantillons.

Nous rapportons ici pour la première fois la génération de CSPi virales libres de couches leucocytaires humains congelés, basé sur un protocole décrit précédemment ^22. DansDe plus, ont été générées à partir de iPSCs PBMNCs congelés obtenus après séparation par gradient de densité, comme un protocole de commande pour les résultats de PBMNC gradient de densité non-purifiés.

Protocole

Des cellules mononucléaires du sang (de PBMNCs) ont été isolés à partir d'échantillons sanguins périphériques humains de donneurs sains après consentement éclairé signé et l'approbation du comité d'éthique de la province du Tyrol du Sud. Des expériences ont été menées en conformité avec les principes énoncés dans la Déclaration d'Helsinki. Toutes les données ont été recueillies et analysées de façon anonyme.

1. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMNCs)

1. PBMNCs obtenus à partir de couches leucocyto-plaquettaires après centrifugation de sang entier, sans séparation de gradient de densité.
   1. Recueillir 8 ml de sang périphérique veineux dans un citrate de sodium tamponnée tube en plastique, et conserver à température ambiante (25 ° C). le sang du processus dans les 12 heures après le prélèvement.
   2. Centrifuger le tube à 2000 g pendant 15 min à 4 ° C dans un seau rotor oscillant, la mise hors tension des freins de centrifugeuses.
   3. Recueillir le manteau nuageux buffy (la couche entre la phase de plasma supérieure et inférieurela phase contenant la majeure partie des erythrocytes), contenant la fraction enrichie PBMNC (500 ul) dans un tube cryotube.
   4. Remettre en suspension 500 pi de la couche leucocytaire avec 500 pi de 2 x milieu de congélation contenant 90% de FBS et 20% de DMSO, afin d'obtenir un volume total de 1 ml avec 10% de concentration en DMSO.
   5. Congeler le flacon dans un récipient de congélation à vitesse contrôlée à -80 ° C. Stocker les piles dans l'azote liquide pour des périodes plus longues.
2. PBMNCs obtenus après séparation par gradient de densité
   1. Prélever 12 ml de sang périphérique veineux dans un citrate de sodium tamponnée tube en plastique, et stocker à température ambiante. le sang du processus dans les 12 heures après le prélèvement.
   2. On dilue le sang avec du PBS stérile jusqu'à un volume final de 35 ml.
   3. Avec précaution et lentement, la couche 35 ml de sang dilué sur 15 ml de solution polysucrose (utilisé pour la séparation par gradient de densité) (p = 1,077) dans un tube conique de 50 ml (rapport 3: 1).
   4. Centrifuger le tube à 800 g pendant 30 min à température ambiante dansun seau rotor oscillant, la mise hors tension des freins de centrifugeuses.
   5. Aspirer le supérieur, la phase jaune contenant du plasma et le jeter. Soigneusement, transférer la couche d'interphase blanc opaque contenant PBMNCs à un nouveau 50 ml tube conique.
   6. Amener le volume total à 30 ml avec du PBS stérile et centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante.
   7. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 30 ml de PBS. Comptez le nombre de cellules viables, sur la base de l'exclusion du bleu trypan ^25.
   8. PBMNCs centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante, aspirer le surnageant et le jeter.
   9. Remettre en suspension le culot cellulaire dans une quantité appropriée de milieu de congélation contenant 90% de FBS et 10% de DMSO, afin d'obtenir une concentration de 5 x 10 ⁶ cellules / ml.
   10. Aliquote de 1 ml par flacon (environ 5 x 10 ⁶ cellules / ml) et de geler le flacon dans une vitesse contrôlée gel contenant à - 80 ° C. Stocker les piles dans l'azote liquide pour des périodes plus longues.

2. Le dégel et Placage des PBMNCs (jour 0)

1. PBMNCs obtenus à partir de couches leucocyto-plaquettaires après centrifugation de sang entier, sans séparation de gradient de densité.
   1. Pour démarrer le protocole utilisant PBMNCs de couches leucocytaires congelés, décongeler 1 flacon de cellules dans un bain d'eau à 37 ° C et diluer la couche leucocytaire avec PBS stérile à un volume final de 2 ml.
   2. Transférer la couche leucocyto-plaquettaire dilué dans un tube conique de 50 ml, ajouter 10 ml de tampon de lyse des globules rouges et incuber pendant 10 min à température ambiante.
   3. Pour préparer 500 ml de tampon de lyse des globules rouges, ajouter 0,5 g de bicarbonate de potassium, 4,145 g de chlorure d'ammonium, 100 ul de solution 0,5 M d'EDTA à 500 ml d'eau ultra-pure, pH 7.2 à 7.4.
   4. Amener le volume total à 50 ml avec PBS stérile et centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante.
   5. Jeter le surnageant et laver le culot avec 50 ml de PBS stérile, centrifuger la couche leuco-plaquettaire à 300 g pendant 10 min à température ambiante.
   6. Remettre en suspension les cellules dans1 ml de milieu PBMNC, tels que décrits précédemment ^22, composé de: IMDM et de Ham F-12 (rapport 1: 1), 1% de l'insuline-transferrine-Selenium-éthanolamine (ITS-X), 1% des chimique définie Concentré de lipides (CDL), 1% de pénicilline / streptomycine, 0,005% d'acide L-ascorbique, 0,5% de sérum-albumine bovine (BSA), 1-thioglycérol (concentration finale de 200 uM), Stem Cell Factor SCF (100 ng / ml), l'interleukine -3 IL-3 (10 ng / ml), de l'érythropoïétine EPO (2 U / ml), Insuline-like Growth Factor IGF-1 (40 ng / ml), la dexaméthasone (1 pM) et holo-transferrine (100 ug / ml ).
   7. Les transférer dans un puits d'une plaque à 12 puits avec un traitement de surface de culture de tissu standard, sans revêtement, à une densité de 2 x 10 ⁶ cellules / ml. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO ₂ dans un incubateur humidifié pendant 48 heures, jusqu'à ce que l'étape moyen de changer (voir la section 3).
2. PBMNCs obtenus après séparation par gradient de densité
   1. Pour démarrer le protocole utilisant PBMNCs congelés aprèsséparation par gradient de densité, une dégel flacon de cellules dans un bain-marie à 37 ° C, transférer les cellules dans 5 ml de milieu PBMNC. Centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante.
   2. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu PBMNC et les transférer dans un puits d'une plaque à 12 puits, à une densité de 2 x 10 ⁶ cellules / ml. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO ₂ dans un incubateur humidifié pendant 48 heures, jusqu'à ce que l'étape moyen de changer (voir la section 3).

3. Culture et Expansion des PBMNCs (JOUR 2-13)

1. Recueillir PBMNCs en culture en suspension, en utilisant une pipette avec une pointe de 1 ml, dans un tube de 15 ml conique et centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante.
2. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu de PBMNC frais.
3. Transférer les cellules dans des puits d'une plaque à 12 puits avec un traitement de surface de culture de tissu standard, sans revêtement, et les incuber à 37 ° C, 5% de _CO2 dans un incubateur humidifié.
4. Répétez ces étapes tous les deux jours, et de diviser les cellules à un rapport 1: 2 quand ils atteignent la confluence approprié (environ 80%).

4. La transfection de PBMNCs avec épisomique Plasmides (Jour 14)

Remarque: Effectuez l'isolement des quatre plasmides épisomiques gratuitement intergation commerciales, portant les gènes de pluripotence utilisant un kit commercial pour la purification de plasmide et d'évaluer la qualité des plasmides purifiés en utilisant une analyse de gel d'agarose, selon les instructions du fabricant.

1. Recueillir PBMNCs dans 15 ml tube conique et compter le nombre de cellules viables (sur la base de l'exclusion du bleu trypan) ^25.
2. Centrifugeuse de 2 x 10 ⁶ cellules à 300 xg pendant 10 min à température ambiante.
3. Remettre en suspension de 2 x 10 ⁶ cellules dans mélange de transfection contenant 100 pi de tampon de resuspension T et 1 pg de chaque ADN plasmidique (un plasmide portant OCT3 / 4 et shARN contre p53, un plasmide portant SOX2 et KLF4, unplasmide portant L-MYC et LIN28, et un plasmide portant EGFP, pour vérifier l'efficacité de transfection).
4. Aspirer le mélange de transfection contenant les cellules dans une pointe de 100 pi et insérer la pipette avec l'échantillon verticalement dans le tube, rempli de 3 ml de électrolytique tampon E2, placée dans la station de pipette de la machine d'électroporation, selon les instructions du fabricant.
5. Cellules efficacement électroporation en utilisant le programme suivant: 1 650 V, 10 msec, 3 impulsions.
6. Reprendre les cellules électroporées (2 x 10 ⁶ cellules) dans 2 ml de milieu PBMNC préchauffé, ajoutant 0,25 mM sodium butyrate (NAB) et compter le nombre de cellules viables après le protocole d'électroporation (sur la base de l'exclusion du bleu trypan) ^25.
7. Transférer les cellules dans un puits d'une plaque à 6 puits sans revêtement, secouez légèrement la plaque et incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO ₂ dans un incubateur humidifié.
8. Le jour après l'électroporation, Cont le nombre de cellules positives pour la GFP au microscope à fluorescence 8-10 champs aléatoires, afin d'évaluer l'efficacité de transfection.
9. Maintenir les cellules transfectées sans partage pendant 3 jours, jusqu'à ce que les étalant sur MEF (voir la section 6).
10. Remplacer 2 ml de milieu de PBMNCs frais, majoré de 0,25 mM NAB tous les deux jours.

5. préparer des plats avec des liaisons de cellules pour la co-culture (Jour 16)

1. Enduire les puits d'une plaque à 6 puits avec 1 ml de sous-sol matrice de la membrane pendant 15 min à 37 ° C et la plaque fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) à une densité de 2 x 10 ⁵ cellules / puits avec 2 ml de 10% de FBS contenait DMEM (milieu MEF) un jour avant le repiquage les PBMNCs électroporation sur les cellules-nourricières MEF.

6. PBMNCs Placage transfectées ONTO MEF (JOUR 17-19)

1. Recueillir PBMNCs en culture en suspension, en utilisant une pipette de 1 ml pointe, dans 15 ml tube conique et centrifuger transfectées PBMNCs à 300 g pendant 10 minà la température ambiante.
2. Jeter le surnageant et remettre le culot dans 2 ml de milieu de PBMNC frais, majoré de 0,25 mM NaB.
3. Plaque les cellules sur MEF revêtu 6 bien et incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO ₂ dans un incubateur humidifié.
4. Après deux jours, aspirer le milieu et le remplacer par 2 ml de milieu iPSC composé de DMEM KO (KO-DMEM), 20% KO-Sérum remplacement (KOSR), 1 mM NEAAs, 1% de pénicilline / streptomycine, 20 mM L- glutamine, 0,1 mM de β-mercaptoéthanol, le FGF 10 ng / ml (bFGF de base) et 0,25 mM de NaB.
5. Remplacer 2 ml de milieu iPSC frais tous les jours et vérifier les cellules quotidienne.
   Remarque: À propos de la Journée 22-25, les premières colonies de CSPi doivent être visibles.

7. Picking et l'expansion de Induced cellules souches pluripotentes (CISP) Clones (JOUR 30-35)

Remarque: À environ 30-35 jours après la transfection, les colonies iPSC devraient être prêts pour la cueillette et de réensemencement. L'efficacité de reprogrammation devrait être estiaccouplés que le pourcentage du nombre de colonies iPSC / nombre total de cellules par électroporation, comme indiqué précédemment ^26.

1. Le jour avant repiquage colonies iPSC, préparer le chargeur MEF dans une plaque de 12 puits (1,25 x 10 ⁵ cellules / puits).
2. Aspirer le milieu et de modifier MEF avec 1 ml de milieu iPSC avec 10 ng / ml de bFGF et 10 uM de Y-27632. Disséquer manuellement avec une aiguille une colonie à chaque fois sous le microscope de dissection dans la cueillette capot afin d'obtenir une grille, de recueillir plus petites touffes par pipetage et les transférer individuellement chacun dans un puits de la plaque 12 puits revêtue avec MEF.
3. Passage et d'élargir chaque plaque de 12 puits à une plaque de 6 puits dans un rapport 1: 2, puis chaque plaque de 6 puits dans un rapport 1: 4 pour plus de propagation. Disséquer et d'élargir CSPi manuellement pour les 2-3 premiers passages (comme décrit en détail dans l'étape 7.2), puis utiliser une procédure enzyme de dissociation (début de l'étape 7.4).
4. Pour un protocole enzyme de dissociation, propre colons iPSCes par aspiration des parties différenciées, sous le microscope à dissection dans la cueillette de capot.
5. Incuber CSPi avec 1 ml de collagénase IV (1 mg / ml) pendant 10 min à 37 ° C.
6. Aspirer la solution d'enzyme, laver les cellules avec 1 ml de DMEM-KO et de recueillir les colonies dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger à 100 g pendant 2 min à température ambiante.
7. Aspirer le surnageant, remettre en suspension les colonies dans 2 ml de milieu iPSC avec 10 ng / ml de bFGF et 10 uM Y-27632 et de la plaque sur les MEF revêtu plaque à 6 puits (rapport 1: 4).

8. Caractérisation des CSPi (Entre 5-15 Passages)

1. La coloration de phosphatase alcaline
   1. Culture colonies iPSC pour 3-5 jours dans un milieu iPSC avec 10 ng ml bFGF /.
   2. Pour démarrer un protocole phosphatase alcaline de coloration, rincer CSPi une fois avec du PBS, puis les fixer avec 1 ml de PFA à 4% pendant 20 min à température ambiante.
   3. Laver les cellules trois fois avec du PBS, pour enlever PFA résiduelle.
   4. cellules Stain fixe à l'aideun kit commercial de la phosphatase alcaline de marquage selon les instructions du fabricant.
2. Immunofluorescence
   1. Culture colonies iPSC pour 3-5 jours dans un milieu iPSC avec 10 ng ml bFGF /.
   2. Pour démarrer un test d'immunofluorescence, laver CSPi une fois avec du PBS, puis les fixer avec 1 ml de PFA à 4% pendant 20 min à température ambiante.
   3. Laver les cellules trois fois avec du PBS, pour enlever PFA résiduelle.
   4. Traiter iPSCs fixes avec 1 ml de solution de blocage / perméabilisation contenant 4% de sérum de chèvre, 0,1% de BSA, 0,1% de Triton X-100 et de l'azoture de sodium à 0,05% (NaN ₃₎ pour une heure à température ambiante.
   5. Aspirer la solution de blocage et incuber les cellules fixées avec des anticorps primaires à 3% de BSA et 0,05% _{de NaN3} solution O / N à 4 ° C (vérifiez la table de matériaux pour la liste d'anticorps primaire et suggéré anticorps facteur de dilution).
   6. Le lendemain, lavez CSPi trois fois avec du PBS, puis incuber les cellules avec Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris et Alexa FlUOR anticorps anti-chèvre de lapin 555, dilués à 1: 1000 dans 3% de BSA et 0,05% _{de NaN3} solution, pendant 1 heure à 37 ° C.
   7. Colorer les noyaux avec le DAPI (1 pg / ml) pendant 10 min à température ambiante dans l'obscurité, suivie par lavage trois fois avec du PBS.
3. Différenciation des CSPi en corps embryoïdes (EBS)
   1. Culture colonies iPSC pour 5-6 jours dans un milieu iPSC avec 10 ng ml bFGF /.
   2. Retirer parties différenciées de colonies iPSC par aspiration, sous le microscope de dissection dans la cueillette capot.
   3. Incuber CSPi avec 1 ml de collagénase IV (1 mg / ml) pendant 10 min à 37 ° C.
   4. Aspirer la solution d'enzyme, laver les cellules avec 1 ml de DMEM-KO et de recueillir les colonies dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger à 100 g pendant 2 min à température ambiante.
   5. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les colonies dans 2 ml de milieu sérique EB composé de KO-DMEM, 20% défini bovin fœtal (FBS), 1 mM NEAAs, 1% de pénicilline / streptomycine, 20 mM de L-glutamine, 0,1 mM46; mercaptoéthanol.
   6. Plate colonies iPSC en suspension pendant 6 jours sur fixation des plaques 6 puits ultra-faibles, afin de permettre la formation de corps embryoïdes sphéroïdales trois dimensions (EBS). Changez 2 ml de milieu EB frais tous les deux jours.
   7. Au jour 7, EB et recueillir les plaquer sur 0,1% de gélatine revêtu des plaques à 6 puits dans 2 ml de milieu EB EB et maintenir dans la différenciation pendant 20 jours.
   8. Changez 2 ml de milieu EB frais tous les deux jours.
4. qRT-PCR pour l'analyse de l'expression génétique
   1. Culture colonies iPSC pour 5-6 jours dans un milieu iPSC avec 10 ng ml bFGF /.
   2. Extraire l'ARN total de PBMNCs, ou CSPi EB utilisant 1 ml de réactif commercial en conformité avec les instructions du fabricant.
   3. Évaluer concentration d'ARN et la pureté par des méthodes appropriées telles que l'utilisation d'un spectrophotomètre (ARN de haute qualité avec A ₂₆₀ / A ₂₈₀ et A ₂₆₀ / A ₂₃₀ rapports> 1,8) ^27.
   4. Chèquel'intégrité de l'ARN en utilisant un kit commercial selon le protocole (ARN de haute qualité de RQI> 9.5) du fabricant ^28.
   5. Effectuer une réaction de transcription inverse sur 1 ug d'ARN total en utilisant un kit commercial de transcriptase inverse selon les instructions du fabricant.
   6. Préparer les mélanges qPCR contenant 5 ng de matrice d'ADNc, 7,5 pi SYBR GREEN Supermix, 2 pi de 5 uM amorces (avant: 1 pl et arrière: 1 pi) et 6 pi de RNase / eau DNase pour chaque réaction ^29.
   7. Effectuer la qRT-PCR en utilisant le programme suivant: une étape de dénaturation initiale à 95 ° C pendant 10 min, suivie de 40 cycles divisés en une étape de dénaturation à 95 ° C pendant 15 secondes et annelage et l'extension étape d'amorce à 60 ° C pendant 45 ²⁹ sec.
   8. Normaliser l'expression d'autres gènes en utilisant GAPDH comme gène de ménage ²⁸ (voir les amorces énumérées dans le tableau 1).
5. qPCRpour Transgene Exclusion
   1. Extraire l'ADN à partir de PBMNCs iPSCs ou en utilisant 1 ml de tampon de lyse contenant 50 mM de Tris, 100 mM d'EDTA, 100 mM de NaCl, 1% de dodécylsulfate de sodium (SDS) et 20 pg / ml de proteinase K.
   2. Ajouter un volume égal (1 ml) de 100% d'isopropanol, mélanger par inversion trois fois afin de permettre la précipitation de l'ADN et centrifuger à 10 000 xg pendant 5 min à température ambiante.
   3. Jeter le surnageant, laver le culot d'ADN avec 1 ml d'éthanol à 70% et centrifuger à 10 000 xg pendant 5 min à température ambiante. Aspirer et jeter le surnageant et remettre en suspension dans RNase / eau DNase.
   4. Évaluer la concentration de l'ADN et la pureté par des méthodes appropriées telles que l'utilisation d'un spectrophotomètre (ARN de haute qualité avec A ₂₆₀ / A ₂₈₀ et A ₂₆₀ / A ₂₃₀ rapports> 1,8) ^27.
   5. Préparer les mélanges qPCR contenant 5 ng de matrice d'ADN, 7,5 pi SYBR GREEN Supermix, 2 pi de 5 pm amorces (avant: 1 pl et arrière: 1 pi) et 6 &# 181; l de RNase / eau DNase pour chaque réaction ^29.
   6. Normaliser l'expression de plasmide épisomique spécifique EBNA-1 génique utilisant FBX-15 comme gène de ménage ²⁹ (voir les amorces énumérées dans le tableau 1).
6. Analyse caryotype
   1. Culture colonies iPSC pour 5-6 jours ONTO sol matrice de la membrane sans chargeur-plaque enduite avec un milieu d'entretien commerciale définie libre-alimentation pour CSPi, suivant les instructions du fabricant.
   2. Pour commencer le protocole d'analyse du caryotype, détacher colonies iPSC avec 1 ml d'une solution de détachement cellulaire pendant 5 min à 37 ° C, jusqu'à l'obtention d'une seule cellule de dissociation.
   3. Recueillir des cellules et centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
   4. Remettre en suspension CSPi dans 2 ml d'un milieu spécifiquement développé pour la culture de cellules pour les techniques de diagnostic prénatal. Plate iPSCs monocellulaires sur une matrice de verre revêtu plats de la membrane basale et incuber dans un 37 ° C, 5% CO _{2 <}/ Sub> incubateur.
   5. Après 2-4 jours, ajouter 10 ul / ml colchicine directement sur ​​les cultures et mettre en incubation pendant 3 heures à 37 ° C, 5% de _CO2 dans un incubateur humidifié.
   6. Aspirer le milieu et incuber iPSCs dans 1 ml d'une solution hypotonique (citrate de sodium à 0,6% et 0,13% de chlorure de potassium) pendant 10 min à température ambiante.
   7. Rincer les cellules avec 1 ml de solution d'acide acétique à 5% et fixer avec iPSCs / solution d'acide acétique-méthanol (rapport 3: 1) dans une machine à température et humidité contrôlées (28 ° C, 42% HR).
   8. Plongez et les cellules tache fixe avec une solution Quinacrine pendant 15-20 min à température ambiante dans l'obscurité (pour obtenir Q-bandes) ^30.
   9. Acquérir métaphases de cellules sous un microscope de fluorescence à ²⁹ 100X.

Résultats

Dans cette étude, un protocole simple et efficace pour la génération de iPSCs viraux exempts de reprogrammation de PBMNCs isolées à partir de couches leucocytaires congelée après centrifugation du sang total et la comparaison avec une reprogrammation de PBMNCs obtenus après séparation par gradient de densité est rapportée. La figure 1A montre une représentation schématique de le protocole détaillé. Après décongélation, les PBMNCs isolées, montrant une forme typique arrondie, sont dév...

Discussion

Dans le passé, la seule façon d'obtenir des cellules souches pluripotentes humaines porteuses d'une mutation génétique particulière était de recruter les parents subissant un diagnostic génétique pré-implantatoire et de générer des cellules souches embryonnaires à partir de leurs blastocystes rebut ^31,32. En utilisant une approche de reprogrammation, les chercheurs peuvent désormais générer des CSPi de patients porteurs de pratiquement tout le génotype. La possibilité de démarrer à ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube	Terumo	VF-054SBCS07
Ammodium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Potassium bicarbonate	Sigma-Aldrich	60339
EDTA disodium powder	Sigma-Aldrich	E5134	0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)	Gibco	21056-023	No phenol red
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)	Gibco	51500-056	1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031	1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)	PeproTech	300-07	100 ng/ml (Stock:100 µg/ml)
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)	PeproTech	200-03	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)	PeproTech	100-11	40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin	R&D Systems	2914-HT	100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II	Gibco	11269016	Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1	StemCell Technologies	5850	Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010	0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa	R&D Systems	4114-TC	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503	10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum	Hyclone	SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Merck-Millipore	ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230
Collagenase, Type IV	Gibco	17104-019	1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007	Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)	Global Stem	GSC-6201G	1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK	Addgene	27078	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL	Addgene	27080	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP	Addgene	27082	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit	Stemgent	00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody	Merck-Millipore	MAB4304	1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody	Merck-Millipore	MAB4360	1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody	Merck-Millipore	MAB4381	1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-9081	1/500
Anti-Nanog Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-33759	1/500
Anti-Troponin I Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-15368	1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody	Sigma-Aldrich	A7732	1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody	Covance Research Products Inc	MMS-435P-100	1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Calbiochem	657012	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse	Molecular Probes	A-11029	1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit	Molecular Probes	A-21429	1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate	Corning	3471
Trizol Reagent	Ambion	15596-018	reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Invitrogen	11754050	Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	185-5195
Experion Automated Electrophoresis System	Bio-Rad	700-7000	Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit	Bio-Rad	7007105	Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )	Zeiss	495007
NeonTransfection System 100 µl Kit	Invitrogen	MPK10025	Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit