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Method Article
* Estos autores han contribuido por igual
Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.
Las células somáticas pueden ser reprogramadas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) forzando la expresión de cuatro factores de transcripción (octubre-4, Sox-2, Klf-4, y c-Myc), por lo general expresado por las células madre embrionarias humanas (hESCs) . Debido a su similitud con hESCs, iPSCs se han convertido en una herramienta importante para el potencial de la medicina regenerativa específica del paciente, evitando problemas éticos asociados con hESCs. Con el fin de obtener células adecuadas para la aplicación clínica, CMPI-transgén libre necesitan ser generados para evitar la reactivación del transgén, expresión de genes alterados y la diferenciación equivocada. Por otra parte, un método de reprogramación altamente eficiente y de bajo costo es necesario derivar iPSCs suficientes para fines terapéuticos. Ante esta necesidad, un enfoque eficiente no integrar plásmido episomal es la opción preferible para IPSC derivación. Actualmente, el tipo de célula más común usado para los propósitos de reprogramación son fibroblastos, el aislamiento de los cuales requiere biopsia de tejido, una iprocedimiento quirúrgico nvasive para el paciente. Por lo tanto, la sangre periférica humana representa el tejido más accesible y menos invasivo para la generación de IPSC.
En este estudio, un protocolo rentable y viral gratis con no-integración de plásmidos episomales se reporta para la generación de células iPS a partir de células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados después de toda la centrifugación de sangre y sin densidad de separación en gradiente.
En 2006, el grupo de Shinya Yamanaka 1 demostró por primera vez que las células somáticas de ratones y seres humanos adultos se pueden convertir en un estado pluripotente por la expresión ectópica de cuatro factores de reprogramación (octubre-4, Sox-2, Klf-4, y c-Myc), generando las llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) 2. CMPI-paciente específico se parecen mucho a las células madre embrionarias humanas (hESCs) en términos de la morfología, la proliferación y la capacidad de diferenciarse en los tipos de células de tres germinales (mesodermo, endodermo y ectodermo), mientras que carece de los problemas éticos asociados a la utilización de hESCs y derivación posible rechazo inmune 3. Por lo tanto, iPSCs aparece como una de las fuentes más importantes de las células específicas del paciente para la investigación básica, la detección de drogas, el modelado de la enfermedad, la evaluación de la toxicidad y efectos de medicina regenerativa 4.
Varios enfoques se han utilizado para la generación de IPSC: vectores de integración virales(5 retrovirus, lentivirus 6), virales no-integración de vectores (adenovirus 7), Sendai virus 8, transposones BAC 9, vectores episomales 10, 11 proteínas o ARN entrega 12. Aunque el uso de métodos mediada por virus puede conducir a la reprogramación de alta eficiencia, los vectores virales se integran en el genoma de células huésped y por lo tanto potencial mutagénesis de inserción al azar, alteración permanente de la expresión génica, y la reactivación de transgenes silenciados durante la diferenciación no se puede excluir 13.
Para hacer iPSCs más seguro para la medicina regenerativa, se han hecho esfuerzos para derivar iPSCs sin la integración de ADN exógeno en genomas celulares. Aunque se han desarrollado vectores virales y transposones sujetos a impuestos especiales, todavía no está claro si las secuencias del vector cortos, que inevitablemente permanecen en las células transducidas después de la escisión, y transposasa expresión, podrían inducir alteración en la celdaular funcionan 13. A pesar de su alta eficiencia de reprogramación, virus Sendai representa un enfoque caro y llegar a través de las preocupaciones de licencia con la empresa que desarrolló este sistema tiene el potencial de limitar su aplicación en estudios de traducción. Además, la necesidad de la introducción directa de proteínas y ARN requiere la entrega múltiplo de la reprogramación de moléculas con las limitaciones técnicas inherentes esto conlleva la introducción, y la eficiencia general de reprogramación es muy baja 14. De nota, métodos virales libres y no integrador rentables basados en el uso de plásmidos episomales se han reportado con éxito para la reprogramación de fibroblastos de la piel 15. En concreto, en el presente trabajo hemos decidido utilizar plásmidos episomales-integración libre de comerciales disponibles, como se informó anteriormente 10,15.
Hasta la fecha, los fibroblastos de la piel representan el tipo de célula donante más popular 5. Sin embargo, otras fuentes de células han sido éxitosfully reprogramado en iPSCs incluyendo queratinocitos 16, células madre mesenquimales de médula ósea 17, las células del estroma adiposo 18, folículos pilosos 19, y las células de la pulpa dental 20. El aislamiento de estas células requiere procedimientos quirúrgicos, y se necesitan varias semanas para la expansión de células in vitro con el fin de establecer un cultivo celular primario.
En este sentido, la selección de iniciar tipo de célula es crítica y es igualmente importante ser capaz de producir células iPS a partir de tejidos de fácil acceso y menos invasivas como la sangre. Tanto las células mononucleares de sangre de cordón (CBMNCs) 21,22 y células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) 14,22-24 representan fuentes adecuadas de células para la derivación de células iPS.
Aunque la eficiencia de adulto PBMNC reprogramación es 20-50 veces menor que la de CBMNCs 22, siguen siendo el tipo de célula más conveniente para el propósito de muestreo. EnDe hecho, el muestreo PBMNC tiene la ventaja de ser mínimamente invasiva, y además, estas células no requieren extensa expansión in vitro antes de los experimentos de reprogramación. Hasta la fecha, diferentes protocolos han informado de que PBMNCs después de la separación en gradiente de densidad pueden ser congeladas y descongeladas días a varios meses después de la congelación y se expandieron para pocos días antes de la reprogramación en iPSCs 22,23. Sin embargo, en lo que somos conscientes no hay informes han descrito reprogramación de PBMNCs de buffy abrigos congelados. Es importante destacar que, buffy abrigos congelados recogidos sin separación en gradiente de densidad representan las muestras de sangre más comunes almacenados en bancos de datos genéticos a gran escala a partir de los estudios de población, lo que representa una piscina de fácil acceso de material para la producción de IPSC que evita además la recogida de muestras.
Aquí nos presenta por primera vez la generación de CMPI-virales libres de capas leucocitarias congelados humanos, sobre la base de un protocolo previamente descrito 22. EnAdemás, CMPI se generaron a partir PBMNCs congelados obtenidos después de la separación en gradiente de densidad, como un protocolo de control para los resultados PBMNC gradiente de densidad no purificada.
Células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) fueron aisladas de muestras de sangre periférica humana de donantes sanos después de firmado el consentimiento y la aprobación del Comité Ético de la provincia del Tirol del Sur informado. Los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Todos los datos fueron recogidos y analizados de forma anónima.
1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs)
2. Descongelación y Chapado de PBMNCs (día 0)
3. Cultura y Expansión de PBMNCs (DIA 2-13)
4. La transfección de PBMNCs con episomal plásmidos (DIA 14)
Nota: Realizar el aislamiento de los cuatro plásmidos episomales-intergation libre comerciales, que lleva los genes de pluripotencia utilizando un kit comercial para la purificación del plásmido y evaluar la calidad de los plásmidos purificados utilizando un análisis en gel de agarosa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Preparar Platos con alimentador células para el Co-cultura (DIA 16)
6. PBMNCs Chapado transfectadas Onto MEFs (DIA 17-19)
7. picking y expansión de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) Clones (DIA 30-35)
Nota: A unos 30 a 35 días después de la transfección, las colonias IPSC deben estar listos para la cosecha y replating. La eficiencia de reprogramación debe ser estiacoplado como el porcentaje de número de colonias IPSC / número total de células electroporadas, como se informó anteriormente 26.
8. Caracterización de iPSCs (Entre 5-15 Passages)
En este estudio un protocolo simple y eficaz para la generación de CMPI-virales libre por reprogramación de PBMNCs aislados a partir de capas leucocitarias congelados después de la centrifugación de sangre total y la comparación con la reprogramación de PBMNCs obtenidos después de la separación en gradiente de densidad se informó. La Figura 1A muestra una representación esquemática de el protocolo detallado. Después de la descongelación, las PBMNCs aisladas, que muestran una típica forma r...
En el pasado, la única forma de obtener células madre pluripotentes humanos con una mutación genética particular era reclutar a los padres sometidos a diagnóstico genético pre-implantación y generar células madre embrionarias a partir de sus blastocistos descartado 31,32. Utilizando un enfoque de reprogramación, los investigadores ahora pueden generar células iPS de pacientes portadores de prácticamente cualquier genotipo. La posibilidad de empezar de una línea celular específica del paciente y u...
The authors have nothing to disclose.
The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
NeonTransfection System 100 µl Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
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