Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Resumen

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Resumen

Las células somáticas pueden ser reprogramadas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) forzando la expresión de cuatro factores de transcripción (octubre-4, Sox-2, Klf-4, y c-Myc), por lo general expresado por las células madre embrionarias humanas (hESCs) . Debido a su similitud con hESCs, iPSCs se han convertido en una herramienta importante para el potencial de la medicina regenerativa específica del paciente, evitando problemas éticos asociados con hESCs. Con el fin de obtener células adecuadas para la aplicación clínica, CMPI-transgén libre necesitan ser generados para evitar la reactivación del transgén, expresión de genes alterados y la diferenciación equivocada. Por otra parte, un método de reprogramación altamente eficiente y de bajo costo es necesario derivar iPSCs suficientes para fines terapéuticos. Ante esta necesidad, un enfoque eficiente no integrar plásmido episomal es la opción preferible para IPSC derivación. Actualmente, el tipo de célula más común usado para los propósitos de reprogramación son fibroblastos, el aislamiento de los cuales requiere biopsia de tejido, una iprocedimiento quirúrgico nvasive para el paciente. Por lo tanto, la sangre periférica humana representa el tejido más accesible y menos invasivo para la generación de IPSC.

En este estudio, un protocolo rentable y viral gratis con no-integración de plásmidos episomales se reporta para la generación de células iPS a partir de células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados después de toda la centrifugación de sangre y sin densidad de separación en gradiente.

Introducción

En 2006, el grupo de Shinya Yamanaka ¹ demostró por primera vez que las células somáticas de ratones y seres humanos adultos se pueden convertir en un estado pluripotente por la expresión ectópica de cuatro factores de reprogramación (octubre-4, Sox-2, Klf-4, y c-Myc), generando las llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) ^2. CMPI-paciente específico se parecen mucho a las células madre embrionarias humanas (hESCs) en términos de la morfología, la proliferación y la capacidad de diferenciarse en los tipos de células de tres germinales (mesodermo, endodermo y ectodermo), mientras que carece de los problemas éticos asociados a la utilización de hESCs y derivación posible rechazo inmune ^3. Por lo tanto, iPSCs aparece como una de las fuentes más importantes de las células específicas del paciente para la investigación básica, la detección de drogas, el modelado de la enfermedad, la evaluación de la toxicidad y efectos de medicina regenerativa ^4.

Varios enfoques se han utilizado para la generación de IPSC: vectores de integración virales⁽⁵ retrovirus, lentivirus ^6), virales no-integración de vectores (adenovirus ^7), Sendai virus ^8, transposones BAC ^9, vectores episomales ^{10, 11} proteínas o ARN entrega ^12. Aunque el uso de métodos mediada por virus puede conducir a la reprogramación de alta eficiencia, los vectores virales se integran en el genoma de células huésped y por lo tanto potencial mutagénesis de inserción al azar, alteración permanente de la expresión génica, y la reactivación de transgenes silenciados durante la diferenciación no se puede excluir ^13.

Para hacer iPSCs más seguro para la medicina regenerativa, se han hecho esfuerzos para derivar iPSCs sin la integración de ADN exógeno en genomas celulares. Aunque se han desarrollado vectores virales y transposones sujetos a impuestos especiales, todavía no está claro si las secuencias del vector cortos, que inevitablemente permanecen en las células transducidas después de la escisión, y transposasa expresión, podrían inducir alteración en la celdaular funcionan ^13. A pesar de su alta eficiencia de reprogramación, virus Sendai representa un enfoque caro y llegar a través de las preocupaciones de licencia con la empresa que desarrolló este sistema tiene el potencial de limitar su aplicación en estudios de traducción. Además, la necesidad de la introducción directa de proteínas y ARN requiere la entrega múltiplo de la reprogramación de moléculas con las limitaciones técnicas inherentes esto conlleva la introducción, y la eficiencia general de reprogramación es muy baja ^14. De nota, métodos virales libres y no integrador rentables basados ​​en el uso de plásmidos episomales se han reportado con éxito para la reprogramación de fibroblastos de la piel ^15. En concreto, en el presente trabajo hemos decidido utilizar plásmidos episomales-integración libre de comerciales disponibles, como se informó anteriormente ^10,15.

Hasta la fecha, los fibroblastos de la piel representan el tipo de célula donante más popular ^5. Sin embargo, otras fuentes de células han sido éxitosfully reprogramado en iPSCs incluyendo queratinocitos ^16, células madre mesenquimales de médula ósea ^17, las células del estroma adiposo ^18, folículos pilosos ^19, y las células de la pulpa dental ^20. El aislamiento de estas células requiere procedimientos quirúrgicos, y se necesitan varias semanas para la expansión de células in vitro con el fin de establecer un cultivo celular primario.

En este sentido, la selección de iniciar tipo de célula es crítica y es igualmente importante ser capaz de producir células iPS a partir de tejidos de fácil acceso y menos invasivas como la sangre. Tanto las células mononucleares de sangre de cordón (CBMNCs) ^21,22 y células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) ^14,22-24 representan fuentes adecuadas de células para la derivación de células iPS.

Aunque la eficiencia de adulto PBMNC reprogramación es 20-50 veces menor que la de CBMNCs ^22, siguen siendo el tipo de célula más conveniente para el propósito de muestreo. EnDe hecho, el muestreo PBMNC tiene la ventaja de ser mínimamente invasiva, y además, estas células no requieren extensa expansión in vitro antes de los experimentos de reprogramación. Hasta la fecha, diferentes protocolos han informado de que PBMNCs después de la separación en gradiente de densidad pueden ser congeladas y descongeladas días a varios meses después de la congelación y se expandieron para pocos días antes de la reprogramación en iPSCs ^22,23. Sin embargo, en lo que somos conscientes no hay informes han descrito reprogramación de PBMNCs de buffy abrigos congelados. Es importante destacar que, buffy abrigos congelados recogidos sin separación en gradiente de densidad representan las muestras de sangre más comunes almacenados en bancos de datos genéticos a gran escala a partir de los estudios de población, lo que representa una piscina de fácil acceso de material para la producción de IPSC que evita además la recogida de muestras.

Aquí nos presenta por primera vez la generación de CMPI-virales libres de capas leucocitarias congelados humanos, sobre la base de un protocolo previamente descrito ^22. EnAdemás, CMPI se generaron a partir PBMNCs congelados obtenidos después de la separación en gradiente de densidad, como un protocolo de control para los resultados PBMNC gradiente de densidad no purificada.

Protocolo

Células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) fueron aisladas de muestras de sangre periférica humana de donantes sanos después de firmado el consentimiento y la aprobación del Comité Ético de la provincia del Tirol del Sur informado. Los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con los principios expresados ​​en la Declaración de Helsinki. Todos los datos fueron recogidos y analizados de forma anónima.

1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs)

1. PBMNCs obtuvieron a partir de capas leucocitarias después de la centrifugación de la sangre entera, sin separación en gradiente de densidad.
   1. Suma 8 ml de sangre periférica venosa en un citrato de sodio tamponada tubo de plástico, y se almacena a temperatura ambiente (25 ° C). Proceso de sangre dentro de las 12 horas después de la recolección.
   2. Centrifugar el tubo a 2000 xg durante 15 min a 4 ° C en un rotor basculante, la desconexión de los frenos de centrífuga.
   3. Recoger la capa leucocitaria nublado (la capa entre la fase de plasma superior y la inferiorfase que contiene la mayoría de los eritrocitos), que contiene la fracción enriquecida PBMNC (500 l) en un tubo criovial.
   4. Resuspender 500 l de capa con 500 l de medio de congelación 2x ​​que contiene 90% de FBS y 20% de DMSO, anteado el fin de obtener un volumen total de 1 ml con una concentración de DMSO 10%.
   5. Congele el frasco en un recipiente de congelación a velocidad controlada a -80 ° C. Las células de las tiendas en nitrógeno líquido durante períodos más largos.
2. PBMNCs obtuvieron después de la separación en gradiente de densidad
   1. Recoger 12 ml de sangre periférica venosa en un citrato de sodio tamponada tubo de plástico, y se almacena a temperatura ambiente. Proceso de sangre dentro de las 12 horas después de la recolección.
   2. Diluir la sangre con PBS estéril hasta un volumen final de 35 ml.
   3. Con cuidado y lentamente, capa de 35 ml de sangre diluida en 15 ml de solución polysucrose (utilizado para la separación en gradiente de densidad) (p = 1,077) en un tubo cónico de 50 ml (relación 3: 1).
   4. Centrifugar el tubo a 800 xg durante 30 min a TA enun rotor basculante, la desconexión de los frenos de centrífuga.
   5. Aspirar la fase amarilla que contiene el plasma superior y descartarlo. Con cuidado, transferir la capa de interfase de color blanco opaco que contiene PBMNCs a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
   6. Llevar volumen total a 30 ml con PBS estéril y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA.
   7. Descartar el sobrenadante y resuspender las células con 30 ml de PBS. Contar el número de células viables, basados ​​en la exclusión de azul de tripano ^25.
   8. PBMNCs Centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y se descartan.
   9. Resuspender el sedimento celular en una cantidad apropiada de medio de congelación que contiene 90% de FBS y 10% de DMSO, con el fin de obtener una concentración de 5 x 10 ⁶ células / ml.
   10. Alícuota 1 ml por vial (aproximadamente 5 x 10 ⁶ células / ml) y congelar el vial en una velocidad controlada congelación recipiente en - 80 ° C. Las células de las tiendas en nitrógeno líquido durante períodos más largos.

2. Descongelación y Chapado de PBMNCs (día 0)

1. PBMNCs obtuvieron a partir de capas leucocitarias después de la centrifugación de la sangre entera, sin separación en gradiente de densidad.
   1. Para iniciar el protocolo usando PBMNCs de capas leucocitarias congelados, descongelar 1 vial de células en un baño de agua a 37 ° C y diluir la capa leucocitaria con PBS estéril hasta un volumen final de 2 ml.
   2. Transferir la capa leucocitaria diluida en un tubo cónico de 50 ml, añadir 10 ml de tampón de lisis celular rojo y se incuba durante 10 min a TA.
   3. Para preparar 500 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos, añadir 0,5 g de bicarbonato de potasio, 4,145 g de cloruro de amonio, 100 l de solución de EDTA 0,5 M a 500 ml de agua ultrapura, pH 7.2 a 7.4.
   4. Llevar volumen total a 50 ml con PBS estéril y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA.
   5. Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento con 50 ml de PBS estéril, centrifugar la capa leucocitaria a 300 xg durante 10 min a TA.
   6. Resuspender las células en1 ml de medio PBMNC, como se ha descrito previamente ^22, integrado por IMDM y de Ham F-12 (relación 1: 1), concentrado de lípidos 1% de la insulina-transferrina-selenio-etanolamina (ITS-X), el 1% de química definida (CDL), 1% penicilina / estreptomicina, 0,005% de ácido L-ascórbico, 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA), 1-Tioglicerol (concentración final 200 mM), Stem Cell Factor SCF (100 ng / ml), interleucina -3 IL-3 (10 ng / ml), eritropoyetina EPO (2 U / ml), similar a la insulina factor de crecimiento IGF-1 (40 ng / ml), dexametasona (1 M) y holo-transferrina (100 g / ml ).
   7. Transferencia de ellos en un pocillo de una placa de 12 pocillos con superficie tratada de cultivo de tejidos estándar, sin recubrimiento, a una densidad de 2 x 10 ⁶ células / ml. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO ₂ en un incubador humidificado durante 48 horas, hasta que el paso medio cambiante (ver Sección 3).
2. PBMNCs obtuvieron después de la separación en gradiente de densidad
   1. Para iniciar el protocolo utilizando PBMNCs congelados despuésla separación en gradiente de densidad, deshielo 1 vial de células en un baño de agua a 37 ° C, la transferencia de las células en 5 ml de medio PBMNC. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA.
   2. Resuspender las células en 1 ml de medio de PBMNC y transferirlos a un pocillo de una placa de 12 pocillos, a una densidad de 2 x 10 ⁶ células / ml. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO ₂ en un incubador humidificado durante 48 horas, hasta que el paso medio cambiante (ver Sección 3).

3. Cultura y Expansión de PBMNCs (DIA 2-13)

1. Recoger PBMNCs en cultivo en suspensión, usando una pipeta con una punta de 1 ml, en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA.
2. Descartar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de PBMNC fresco.
3. Transferencia de las células en 1 pocillo de una placa de 12 pocillos con superficie tratada de cultivo de tejidos estándar, sin revestimiento, y se incuba ellos en 37 ° C, 5% de _CO2 en un incubador humidificado.
4. Repita estos pasos cada dos días, y dividir las células en una proporción 1: 2 cuando alcanzan la confluencia apropiada (alrededor de 80%).

4. La transfección de PBMNCs con episomal plásmidos (DIA 14)

Nota: Realizar el aislamiento de los cuatro plásmidos episomales-intergation libre comerciales, que lleva los genes de pluripotencia utilizando un kit comercial para la purificación del plásmido y evaluar la calidad de los plásmidos purificados utilizando un análisis en gel de agarosa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

1. Recoger PBMNCs en tubo cónico de 15 ml y contar el número de células viables (sobre la base de la exclusión de azul de tripano) ^25.
2. Centrifugar 2 x 10 ⁶ células a 300 xg durante 10 min a TA.
3. Resuspender 2 x 10 ⁶ células en la mezcla de transfección que contiene 100 l de tampón de resuspensión T y 1 g de cada ADN plásmido (un plásmido que lleva OCT3 / 4 y shRNA contra p53, un plásmido SOX2 transporte y KLF4, unoplásmido que lleva la L-MYC y Lin28, y una plásmido que lleva EGFP, para comprobar la eficacia de transfección).
4. Aspirar la mezcla de transfección que contiene las células en una punta 100 l e insertar la pipeta con la muestra verticalmente en el tubo, llenado con 3 ml de Buffer electrolítico E2, colocado en la estación de pipeta de la máquina de la electroporación, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Las células de manera eficiente electroporar utilizando el siguiente programa: 1650 V, 10 ms, 3 pulsos.
6. Resuspender las células electroporadas (2 x 10 ⁶ células) en 2 ml de medio de PBMNC pre-calentado, la adición de 0,25 mM butirato de sodio (NaB) y contar el número de células viables después de protocolo de electroporación (sobre la base de la exclusión de azul de tripano) ^25.
7. Transferencia de las células en un pocillo de una placa de 6 pocillos sin recubrimiento, roca suavemente la placa e incubar las células a 37 ° C, 5% de _CO2 en un incubador humidificado.
8. El día después de la electroporación, Count el número de células positivas para GFP bajo microscopía de fluorescencia 8-10 campos aleatorios, con el fin de evaluar la eficiencia de transfección.
9. Mantener las células transfectadas y sin división por 3 días, hasta que ellos chapado en MEFs (véase la sección 6).
10. Reemplazar 2 ml de medio fresco PBMNCs, además de 0,25 mM NaB cada dos días.

5. Preparar Platos con alimentador células para el Co-cultura (DIA 16)

1. Escudo los pocillos de una placa de 6 pocillos con 1 ml de matriz de membrana basal de 15 min a 37 ° C y la placa de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) a una densidad de 2 x 10 ⁵ células / pocillo con 2 ml de 10% de FBS contenía DMEM (medio MEF) un día antes de los pases PBMNCs electroporación en células alimentadoras MEF.

6. PBMNCs Chapado transfectadas Onto MEFs (DIA 17-19)

1. Recoger PBMNCs en cultivo en suspensión, usando una pipeta con 1 ml punta, en 15 ml de tubo cónico de centrífuga y transfectadas PBMNCs a 300 xg durante 10 mina TA.
2. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 2 ml de medio PBMNC fresca, más 0,25 mM NAB.
3. Placa de las células sobre recubierta-MEF 6 placa de pocillos e incubar las células a 37 ° C, 5% de _CO2 en un incubador humidificado.
4. Después de dos días, aspirar el medio y reemplazarlo con 2 ml de medio IPSC compuesto por nocaut DMEM (KO-DMEM), el 20% de reemplazo KO-Suero (KOSR), 1 mM NEAAs, 1% penicilina / estreptomicina, 20 mM de L- La glutamina, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 10 FGF ng / ml (bFGF básico) y 0,25 mM NaB.
5. Reemplace 2 ml de medio fresco cada día IPSC y comprobar las células diariamente.
   Nota: A eso de las 22 a 25 días, las primeras colonias de células iPS deben ser visibles.

7. picking y expansión de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) Clones (DIA 30-35)

Nota: A unos 30 a 35 días después de la transfección, las colonias IPSC deben estar listos para la cosecha y replating. La eficiencia de reprogramación debe ser estiacoplado como el porcentaje de número de colonias IPSC / número total de células electroporadas, como se informó anteriormente ^26.

1. El día antes de pases colonias IPSC, preparar el alimentador MEF en una placa de 12 pocillos (1,25 x 10 ⁵ células / pocillo).
2. Aspirar el medio MEF y cambiar con 1 ml de medio de IPSC con 10 ng / ml de bFGF y 10 M Y-27632. Diseccionar manualmente con una aguja de una colonia en cada momento bajo el microscopio de disección en el picking del capó con el fin de obtener una rejilla, recoger terrones más pequeños mediante pipeteo y transferirlos individualmente cada uno en un pocillo de placa de 12 pocillos recubierta con MEFs.
3. Passage y ampliar cada placa de 12 pocillos a una placa de 6 pocillos en una proporción de 1: 2, entonces cada placa de 6 pocillos en una proporción 1: 4 para su posterior propagación. Diseccionar y ampliar iPSCs manualmente durante los primeros 2-3 pasajes (como se describe a fondo en el paso 7.2), a continuación, utilizar un procedimiento de disociación enzimática (empezar desde el paso 7.4).
4. Para un protocolo de enzima de disociación, limpio coloni IPSCes por aspiración partes diferenciadas, bajo el microscopio de disección en la cosecha del capó.
5. Incubar iPSCs con 1 ml de colagenasa IV (1 mg / ml) durante 10 min a 37 ° C.
6. Aspirar la solución de enzima, enjuagar las células con 1 ml de DMEM-KO y recoger las colonias en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 100 xg durante 2 min a TA.
7. Aspirar el sobrenadante, resuspender las colonias en 2 ml de medio de IPSC con 10 ng / ml de bFGF y 10 M Y-27632 y la placa de ellos en la placa de 6 pocillos recubiertos de MEF (relación 1: 4).

8. Caracterización de iPSCs (Entre 5-15 Passages)

1. Fosfatasa alcalina tinción
   1. Cultura las colonias IPSC para 3-5 días en medio IPSC con 10 ng ml bFGF /.
   2. Para iniciar un protocolo de tinción de la fosfatasa alcalina, enjuagar iPSCs una vez con PBS y luego fijarlas con 1 ml de PFA al 4% durante 20 min a RT.
   3. Lavar las células tres veces con PBS, para eliminar PFA residual.
   4. Células Stain fijo que utilizanun kit de tinción de fosfatasa alcalina comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. La inmunofluorescencia
   1. Cultura las colonias IPSC para 3-5 días en medio IPSC con 10 ng ml bFGF /.
   2. Para iniciar un ensayo de inmunofluorescencia, lavar iPSCs una vez con PBS y luego fijar con 1 ml de PFA al 4% durante 20 min a RT.
   3. Lavar las células tres veces con PBS, para eliminar PFA residual.
   4. Tratar iPSCs fijos con 1 ml de permeabilización / solución de bloqueo que contiene 4% de suero de cabra, 0,1% de BSA, 0,1% de Triton X-100 y 0,05% de azida sódica (NaN ₃₎ para 1 hr a RT.
   5. Aspirar la solución de bloqueo e incubar las células fijadas con anticuerpos primarios en 3% de BSA y 0,05% _{de NaN3} solución S / N a 4 ° C (compruebe la tabla de materiales para la lista de anticuerpo primario y el factor de dilución de anticuerpo sugerido).
   6. El día siguiente, lavar iPSCs tres veces con PBS, a continuación, se incuban las células con Alexa Fluor 488 de cabra anti-ratón y Alexa FlUOR 555 anticuerpos de cabra anti-conejo, diluido 1: 1000 en BSA al 3% y 0,05% NaN solución _3, durante 1 hora a 37 ° C.
   7. Tinción de los núcleos con DAPI (1μg / ml) durante 10 min a TA en la oscuridad, seguido por lavado tres vez con PBS.
3. La diferenciación de las células iPS en cuerpos embrioides (EBS)
   1. Cultura las colonias IPSC para 5-6 días en medio IPSC con 10 ng ml bFGF /.
   2. Eliminar partes diferenciadas de colonias IPSC aspirando, bajo el microscopio de disección en la cosecha del capó.
   3. Incubar iPSCs con 1 ml de colagenasa IV (1 mg / ml) durante 10 min a 37 ° C.
   4. Aspirar la solución de enzima, enjuagar las células con 1 ml de DMEM-KO y recoger las colonias en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 100 xg durante 2 min a TA.
   5. Aspirar el sobrenadante y resuspender las colonias en 2 ml de medio de suero EB compuesto de KO-DMEM, 20% define fetal bovino (FBS), 1 mM NEAAs, 1% penicilina / estreptomicina, 20 mM de L-glutamina, 0,1 mM46; mercaptoetanol.
   6. Placa colonias IPSC en la suspensión durante 6 días en fijación placas de 6 pocillos ultra-bajas, con el fin de permitir la formación de cuerpos embrioides esferoidales tridimensionales (EBS). Cambie 2 ml de medio EB fresca cada dos días.
   7. El día 7, recoger EBs y placa ellos en 0,1% de gelatina recubierto placas de 6 pocillos en 2 ml de medio de EB y mantener EBS en la diferenciación por 20 días.
   8. Cambie 2 ml de medio EB fresca cada dos días.
4. QRT-PCR para el Análisis de la Expresión Génica
   1. Cultura las colonias IPSC para 5-6 días en medio IPSC con 10 ng ml bFGF /.
   2. Extraer el ARN total de PBMNCs, iPSCs o EBs utilizando 1 ml de reactivo comercial, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   3. Evaluar la concentración de ARN y la pureza por métodos adecuados, como el uso de un espectrofotómetro (ARN de alta calidad con A ₂₆₀ / A ₂₈₀ y A ₂₆₀ / A ₂₃₀ ratios de> 1,8) ^27.
   4. ComprobarLa integridad del ARN utilizando un kit comercial según el protocolo (ARN de alta calidad RQI> 9,5) del fabricante ^28.
   5. Realizar una reacción de transcripción inversa en 1 g de ARN total usando un kit comercial de la transcriptasa inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   6. Preparar las mezclas que contienen qPCR 5 ng de cDNA plantilla, 7,5 l de SYBR Green Supermix, 2 l de 5 M primers (adelante: 1 l e inversa: 1 l) y 6 l de RNasa / agua libre de DNasa para cada reacción ^29.
   7. Realice la qRT-PCR utilizando el siguiente programa: una etapa de desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido por 40 ciclos divididos en un paso de desnaturalización a 95 ° C durante 15 seg y la etapa de recocido y extensión del cebador a 60 ° C durante 45 sec ^29.
   8. Normalizar la expresión de otros genes usando GAPDH como gen de mantenimiento ²⁸ (ver los cebadores listados en la Tabla 1).
5. qPCRpara transgénica Exclusión
   1. Extraer ADN de PBMNCs o iPSCs utilizando 1 ml de tampón de lisis que contenía Tris 50 mM, EDTA 100 mM, NaCl 100 mM, 1% dodecilsulfato de sodio (SDS) y 20 mg / ml de proteinasa K.
   2. Añadir un volumen igual (1 ml) de 100% de isopropanol, se mezcla por inversión tres veces con el fin de permitir la precipitación de ADN y se centrifuga a 10.000 xg durante 5 min a TA.
   3. Descartar el sobrenadante, lavar el sedimento de ADN con 1 ml de etanol al 70% y se centrifuga a 10.000 xg durante 5 min a TA. Aspirar y desechar el sobrenadante y resuspender en RNasa / agua libre de DNasa.
   4. Evaluar la concentración de ADN y la pureza por métodos adecuados, como el uso de un espectrofotómetro (ARN de alta calidad con A ₂₆₀ / A ₂₈₀ y A ₂₆₀ / A ₂₃₀ ratios de> 1,8) ^27.
   5. Preparar las mezclas que contienen qPCR 5 ng de ADN molde, 7,5 l de SYBR Green Supermix, 2 l de 5 M primers (adelante: 1 l e inversa: 1 l) y 6 &# 181; l de RNasa / agua libre de DNasa para cada reacción ^29.
   6. Normalizar la expresión del plásmido episomal específica gen EBNA-1 utilizando FBX-15 como limpieza de genes ²⁹ (ver los primers que figuran en la Tabla 1).
6. Análisis Cariotipo
   1. Cultura las colonias IPSC para 5-6 días sobre la placa recubierta matriz de membrana basal-alimentador libre con un medio de mantenimiento comercial definido alimentador libre para CMPI, siguiendo las instrucciones del fabricante.
   2. Para iniciar el protocolo de análisis de cariotipo, separar colonias IPSC con 1 ml de solución de desprendimiento de las células durante 5 min a 37 ° C, hasta obtener la disociación de una sola célula.
   3. Recoger las células y centrifugar a 400 xg durante 5 min a TA.
   4. Resuspender iPSCs en 2 ml de un medio desarrollado específicamente para el cultivo de células para técnicas de diagnóstico prenatal. IPSCs Plate unicelulares Onto matriz recubierto platos de cristal de la membrana basal y se incuba en un 37 ° C, 5% de CO _{2 <}/ Sub> incubadora.
   5. Después de 2-4 días, añadir 10 l / ml de colchicina directamente a los cultivos y se incuba durante 3 horas a 37 ° C, 5% de _CO2 en un incubador humidificado.
   6. Aspirar el medio y se incuba iPSCs en 1 ml de una solución hipotónica (0,6% de citrato de sodio y cloruro de potasio 0,13%) durante 10 min a RT.
   7. Enjuagar las células con 1 ml de solución de ácido acético al 5% y fijar iPSCs con solución de metanol / ácido acético (relación 3: 1) en una máquina con temperatura y humedad controlada (28 ° C, 42% HR).
   8. Sumerja y mancha fijo células con solución quinacrina durante 15-20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad (para obtener Q-bandas) ^30.
   9. Adquirir metafases de células bajo un microscopio de fluorescencia a un aumento de 100X ^29.

Resultados

En este estudio un protocolo simple y eficaz para la generación de CMPI-virales libre por reprogramación de PBMNCs aislados a partir de capas leucocitarias congelados después de la centrifugación de sangre total y la comparación con la reprogramación de PBMNCs obtenidos después de la separación en gradiente de densidad se informó. La Figura 1A muestra una representación esquemática de el protocolo detallado. Después de la descongelación, las PBMNCs aisladas, que muestran una típica forma r...

Discusión

En el pasado, la única forma de obtener células madre pluripotentes humanos con una mutación genética particular era reclutar a los padres sometidos a diagnóstico genético pre-implantación y generar células madre embrionarias a partir de sus blastocistos descartado ^31,32. Utilizando un enfoque de reprogramación, los investigadores ahora pueden generar células iPS de pacientes portadores de prácticamente cualquier genotipo. La posibilidad de empezar de una línea celular específica del paciente y u...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube	Terumo	VF-054SBCS07
Ammodium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Potassium bicarbonate	Sigma-Aldrich	60339
EDTA disodium powder	Sigma-Aldrich	E5134	0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)	Gibco	21056-023	No phenol red
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)	Gibco	51500-056	1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031	1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)	PeproTech	300-07	100 ng/ml (Stock:100 µg/ml)
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)	PeproTech	200-03	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)	PeproTech	100-11	40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin	R&D Systems	2914-HT	100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II	Gibco	11269016	Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1	StemCell Technologies	5850	Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010	0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa	R&D Systems	4114-TC	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503	10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum	Hyclone	SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Merck-Millipore	ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230
Collagenase, Type IV	Gibco	17104-019	1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007	Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)	Global Stem	GSC-6201G	1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK	Addgene	27078	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL	Addgene	27080	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP	Addgene	27082	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit	Stemgent	00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody	Merck-Millipore	MAB4304	1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody	Merck-Millipore	MAB4360	1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody	Merck-Millipore	MAB4381	1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-9081	1/500
Anti-Nanog Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-33759	1/500
Anti-Troponin I Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-15368	1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody	Sigma-Aldrich	A7732	1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody	Covance Research Products Inc	MMS-435P-100	1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Calbiochem	657012	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse	Molecular Probes	A-11029	1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit	Molecular Probes	A-21429	1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate	Corning	3471
Trizol Reagent	Ambion	15596-018	reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Invitrogen	11754050	Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	185-5195
Experion Automated Electrophoresis System	Bio-Rad	700-7000	Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit	Bio-Rad	7007105	Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )	Zeiss	495007
NeonTransfection System 100 µl Kit	Invitrogen	MPK10025	Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit