使用拉姆齐试验来测量液体分泌和离子流率在<em&gt;果蝇</em&gt;马氏管

摘要

这个协议描述了使用的拉姆齐测定来测量流体分泌率从果蝇孤立马氏（肾）细管。此外，使用离子特异性电极来测量分泌的流体钠和钾的浓度，允许跨上皮离子通量的计算，进行说明。

摘要

肾小管上皮离子转运的调制允许生物体维持离子和渗透压稳态变化的外部条件的面部。 果蝇马氏（肾）肾小管提供研究上皮细胞离子转运的分子机制，因为这种微生物及其肾小管生理研究的辅助强大的遗传学一个无与伦比的机会。在这里，我们描述了使用的拉姆齐测定来测量流体分泌率从分离的飞肾小管，与使用离子特异性电极测量钠和钾的浓度，在分泌的流体。该测定允许研究的跨上皮流体和离子通量〜20小管的时间，而不需要在分泌的流体传送到一个​​单独的装置来测量离子浓度。遗传上不同的小管可以分析，以评估在运输过程特定基因的作用。另外，将bathing盐水可以被修改来检查添加其化学特性，或药物或激素的作用。综上所述，本技术允许的上皮离子输送这些传输机制中的果蝇细管，以及调控基本机制的分子表征。

引言

肾上皮细胞离子转运underlies有机体iono-和渗透压调节。 果蝇马氏（肾）肾小管提供研究上皮细胞离子转运的分子机制提供了无与伦比的机会。这是由于果蝇的强大遗传学，配对的其肾小管生理研究的可访问的组合。拉姆齐检测，谁率先技术¹研究者的名字命名，测量液体分泌率从孤立的马氏管，并建立在果蝇于1994年陶氏和他的同事^2。这种利用果蝇的遗传工具，如GAL4-UAS系统^3,4，确定细胞特异性的信号通路调节液分泌铺平了道路进一步研究。实例包括钙信号响应于肽激素⁵以及很多其他^6,7。

ve_content">遗传技术和古典生理研究的组合表明，尿代在飞是通过从细管的主要链段的氯化钾富液的分泌。这是通过阳离子的平行跨上皮分泌，主要是^K +也^钠离子，通过主细胞，和Cl ^-通过星状细胞分泌^8-12分别测量跨上皮^K +和Na ⁺通量的能力允许的传输机制比液体分泌的测量更详细的表征孤独。例如，在未刺激的果蝇细管为Na ^{+ / K + -ATP酶}抑制剂哇巴因对分泌液²没有影响，即使当其摄取到主细胞是由有机阴离子转运抑制剂牛磺胆¹³抑制。然而，林顿和奥唐纳发现，哇巴因去极化基底外侧膜电位，并增加了^钠离子通量^9。如图中代表结果，我们重复这些发现，并表明^，K +通量是伴随降低^14;增大^的 Na +通量和降低^的 K +通量对液分泌相反的作用，造成在分泌无净的变化。因此，有两项决议的"乌本苷悖论"，即，哇巴因在果蝇小管的分泌液没有效果初步观察:首先，在刺激小管，哇巴因对液体分泌的效果并不明显，由于其吸收的有机阴离子转运^13;第二，在未受刺激的小管，哇巴因一直反对对跨上皮^Na +和K ^+流的影响，导致液分泌没有净变化（见代表性的成果和参考文献9）。因此， ^钠离子的主要作用/ K ^{+ -ATP}酶在未刺激的小管是降低细胞内Na ^+的浓度 ，以产生有利的浓度梯度为^Na +的偶联的运输过程横跨基底外侧膜。事实上，通过分别测量^Na +和K ⁺通量，我们表明，小管缺乏飞钠-钾-2-氯转运蛋白（NKCC）具有降低的跨上皮^的 K +通量，与哇巴因加入后没有进一步降低，并在经上皮无变化^Na +的^线 14。这些发现支持了我们的结论，即^Na +的进入从而NKCC细胞通过的Na ⁺ / ^K + -ATP酶回收。在另一个例子中，Ianowski 等人观察到，降低浴^的 K +浓度从10mM至6毫从吸血蝽下降跨上皮^K +通量并增加经上皮^Na +的磁通在小管，并在流体分泌没有净变化 15。横跨幼虫小管上^的 Na +通量和K ^+流的不同作用也已在果蝇小管中观察到响应于不同的盐饮食¹⁶并在两个蚊种响应于饲养盐度^17。

在拉姆齐测定制备跨上皮离子通量的测定的最大挑战是分泌的流体中的离子浓度的测定。这个挑战已经取得了不同的解决方案，其中包括火焰photometery ^18，使用放射性离子¹⁹和电子探针波谱仪^20。这些技术需要分泌的液体滴转移到仪器的离子浓度的测量。因为流体的由未刺激的果蝇细管分泌的体积是小的，典型地〜0.5标升/分钟，这会带来一个技术挑战，也引入了错误，如果一些分泌的流体是在传输丢失。与此相反，使用离子特异性电极允许原位离子活性（从该离子浓度可以计算）的测量。目前的协议改编自所使用的Maddrell和同事使用缬氨霉素作为^第 K +离子载体²¹测量通过吸血肾小管跨上皮^的 K +通量，并且还描述了使用4- 叔 -butylcalix [4]芳烃-四乙酸的四乙酯基^钠离子的特征在于Messerli 等特异性离子特异性电极。人^。22。离子特异性电极也被用于测量离子浓度在流体中的拉姆齐测定在成人^9,23和幼虫¹⁶ 果蝇由马氏管分泌，新西兰阿尔派恩威塔（Hemideina毛利 ^）24和在蚊子^17。

在这里，我们详细描述了使用的拉姆齐作为说来测量流体分泌率在从果蝇马氏管，以及使用离子特异性电极以所分泌的流体中确定^的 K + ^和 Na +的浓度，从而跨上皮离子通量的计算。该试验的概述在图1中提供 。

图1.原理马氏管和拉姆齐分析与使用离子专用电极来测量离子浓度 。这个数字说明了该设置为拉姆齐检测。 （A）中的每个飞有四个小管，一对前管和一对后小管的，即浮在腹腔内通过血淋巴包围。在每一对中，两个小管联接在输尿管，然后在肠和hindgu交界清空尿吨。该管的盲端。尿被流体分泌主段（显示为红色）中产生，并朝向输尿管和流出到肠道内流动。解剖后，细管对被从肠道通过横断输尿管解离。 （B）的一对细管然后被转移到洗澡盐水的液滴内测定皿的孔中。其中的两个小管的，这里所指的"锚小管，"所缠绕的金属销和是惰性的。其他小管的分泌小管。起始段（其不分泌液）和分泌小管主体段保持洗澡盐水的液滴中。离子和水移动从洗澡盐水到主段的小管内腔，然后移向输尿管，正如在体内发生。下段（蓝色）是沐浴盐水，因此惰性外部。由于输尿管被切断时，分泌的流体出现从输尿管的切断端的液滴。 Ť他分泌流体液滴放大随时间而分泌的继续，其直径是使用目镜测微尺测定。矿物油的层防止分泌流体的蒸发。参考和离子专用电极测量分泌液的离子浓度。 请点击此处查看该图的放大版本。

研究方案

1.准备解剖，校准和检测菜

注意:在此步骤中，衬有有机硅弹性体三个塑料培养皿制备:一个用于解剖，一个用于执行拉姆齐测定（"测定法菜"），和一个用于执行校准。这些菜都是重复使用的实验，实验，因此这个步骤只需要当一盘符重复。测定盘的图象示于图2。

图2.分析道菜。用于拉姆齐分析这道菜在此显示。它是一种衬有有机硅弹性体有10厘米培养皿。 20至25口井都雕刻出来的弹性体。甲Minutien金属销，切成两半，放置到每个右井（或向左，如果实验者是左撇子）。TPS://www.jove.com/files/ftp_upload/53144/53144fig2large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

1. 使用手套，倒〜80 G型​​硅橡胶基成玻璃烧杯中。添加的1/10重量（8克）聚硅氧烷弹性体的固化。搅拌用金属搅拌器。放置在定轨振荡器有平顶以平缓的速度，例如100转，数小时，直到所有泡沫已被删除。
2. 倒入有机硅弹性体成干净的塑料培养皿:100毫米×15毫米培养皿中的解剖和化验的菜肴，和35×10毫米的刻度盘。弹性体层的厚度应为〜6 - 7毫米的100mm平皿，并〜5毫米的35mm培养皿。
3. 放在工作台上在室温（RT）的菜固化（硬化），至24 - 48小时。
4. 一旦检测菜已治愈，准备一个小批量的有机硅弹性体，如步骤1.1， 比如 ，10克的有机硅弹性体用1g治疗基地。摇上轨道摇床如在步骤1.1直到气泡不再存在。这种弹性体将在步骤1.5.4使用，不应该被允许硬化之前的步骤。
5. 用手术刀和标准的锐器的预防措施，使油井在100mm的硅弹性体涂层的培养皿之一。这将是在测定皿中。
   1. 使开并用直径〜3个孔〜1厘米 - 4毫米。 25口井可以轻松地安装在100毫米检测菜。韦尔斯应至少6毫米从盘的壁上除去。 图2示出的孔的间距。每个孔将在实验过程中含有一种流体分泌小管。因此，含有25井培养皿将允许25小管加以分析。
   2. 使用永久性标记，如果需要，以纪念井的位置。
   3. 通过将手术刀在弹性体，然后用另一只手来旋转盘360°使以及光滑的壁成为可能。
   4. 然后，使用标准的沙 RPS的预防措施，浸地下30针进入非硬化弹性体从步骤1.4，并放置一小滴在各孔的底部。此柔滑出井的底部。允许固化（硬化）×24 - 48小时。
6. 准备Minutien引脚。
   1. 放置0.15毫米黑色阳极Minutien销一排一块1英寸标准实验室标签带。销'长轴线应垂直于磁带的长轴线。切割沿其长度的胶带，以切断每个销成两个近似相等的半部（ 图3）。使用一个半针对每个孔中。

图3.切割Minutien引脚，引脚排列在一张标签带并行。然后，剪刀用于切割销一半。ge.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

2. 插入每个半销插入有机硅弹性体约1毫米至每个孔的权利（如果右撇子;如果左撇子，插入销的每个的左侧孔）。这被可视化的孔在低功率时根据解剖立体显微镜，并通过使用一个钝钳计算机辅助最容易完成的。 图2示出的销的定位。

2.准备细玻璃棒

注意:在此步骤中，用玻璃棒制备将用于从解剖盘传送管进入洗浴降。玻璃棒被重新使用从实验进行实验，所以这个步骤仅执行一次，除非在杆场所及一个新的需要。

1. 得到的3毫米（1/8英寸）厚的染色的黑色玻璃板从一个爱好商店和适当的玻璃纸机，诸如玻璃切割器和钳。使用合适的安全设备（厚手套，护目镜）。
2. 切玻璃切成条〜6mm宽×10厘米长
3. 握住双手各拿一玻璃条。软化每个带过本生灯火焰的短端，使用适当的安全防范措施。然后，两个条的端部推到一起，并​​拉开以平滑运动以创建一个细玻璃棒有把手。

3.生理设置

注:在这一步骤中，显微镜，静电和电气电路被设置。其他比银导线和静电计（步骤3.8）的重新校准的定期再氯化（步骤3.2），这个步骤仅进行一次。 图4示出了设置。

图4.生理设置。 的生理学设置在这里描绘。安装程序（一）概述。立体显微镜放置在法拉第笼内部进行两侧的显微操作。一种光纤的光通过在所述法拉第笼的侧面的孔螺纹。静电计被放置在法拉第笼外。 （B）中氯离子涂层的银导线，导线浸入漂白剂。 （C）特写设置的。直微电极保持器，在该左图所示，螺纹连接到探针上的静电计。离子专用电极将被拧在银线插入电极座。在右边，参考电极被拧在45°微电极保持器的银线。电路然后必须适当地接地。该试验盘被示为它将执行测量时被定位。 请点击此处查看该图的放大版本。

1. 将与法拉第笼子里面目镜测微尺的stereomicrosope。地面到法拉第笼，然后将其接地到静电的外壳接地的内部。将显微操作上的显微镜（图4A）的任一侧。
2. 氯化二银线通过浸入漂白至少1小时。扩展隔夜（O / N）如果有必要（ 图4B）。每当银线需要被重新氯化，例如，如果它们是灰色的外观，而不是黑色重复此步骤。
3. 线程一氯化银线到每个微电极持有人。
4. 建立该电路有适当的接地。例如，将排出的，直的微电极保持器，其将保存在离子特定电极（ISE），对静电探针，其被固定到显微操纵（图4C）。
5. 固定放空，45°微电极保持器，其将保存的参考电极，到其他显微（图4C）。然后研磨到上静电的电路接地。
6. 接地"AB出"输出BNC静电对静电的外壳接地。
7. 放置光纤光源法拉第笼的外侧，与鹅颈管通过一个孔进入法拉第笼（图4A）的螺纹。
8. 设置，并根据制造商的说明校准静电。重新校准静电定期（每1 - 2周）。一旦完成，与测量之间，留在"待机"模式的静电与位置切换设置为"IN"，计输入设定为"A"和范围设置为"200毫伏。"

4.准备解剖和巴斯解决方案

1. 准备果蝇盐水如表1详细说明。对于实验使用，倾〜40 ml的入50ml锥形管中并保持在室温。丢弃如果存在的细菌或真菌生长的证据。
2. 为了准备标准洗澡介质（SBM），混合果蝇生理盐水1:1与施耐德的媒体，并通过0.22微米注射器过滤器。准备在小等份（〜10 - 15毫升）中，储存在4℃下，并丢弃如果存在的细菌或真菌生长的证据。施耐德的培养基的成分列于表2。

5.使离子专用电极:硅烷化吸管

注意:在这一步，二氯二甲基硅烷用于轻轻"silanize"离子特定电极。这增加了的疏水性涂层，以允许其保留疏水性离子载体的电极的内部。过度的硅烷化，避免使m时，以防止矿物油的摄取easurements下油滴。硅烷化电极是好几个星期。因此，该工序中，进行每隔几周。

1. 火焰抛光的5端部 - 6 unfilamented硼硅玻璃毛细管（外径1.2毫米，内径为0.69毫米，长度为10厘米）通过低的火焰，使用适当的安全预防措施。
2. 将毛细管在1L玻璃烧杯的底部。
3. 在发动机罩，并使用适当的个人防护装备，倒入70％硝酸（注意:易燃，腐蚀性，请参阅材料安全数据表，安全储存和处理指令）在毛细管，浸泡5分钟。
4. 倒入硝酸回玻璃瓶中。再利用用于随后硝酸洗涤。
5. 加入去离子水的约_200×2 O连接到烧杯中。空废为一个专门的玻璃瓶硝酸浪费。与另外200 500ml的去离子_H 2 O的重复遵循日机构准则Ë安全处置的酸性废物。
6. 做三个额外的洗涤与大量的去离子水。清空进水槽。
7. 在引擎盖，放置毛细管上的热板上用陶瓷顶设定为200℃，干燥至少20分钟，最佳地1小时。它也可以被放置更长时间。
8. 上吸管拉出器（图5A），拉吸管至〜1的顶端直径- 2微米。
9. 放置拉出吸管返回到烤盘，小心不要弄破提示，至少10分钟，最佳地30分钟，但可以保留更长的时间。
10. 加入20微升二甲基二氯硅烷（注意:易燃，腐蚀性，急性毒性，请参阅材料安全数据表，安全储存和处理指令）转换成15cm的玻璃培养皿中，并颠倒了的菜在热板（ 图5B）的吸管。留在原地，至少20分钟，最佳地2小时。相同的培养皿可以被重新用于随后的实验。
    1. 确定amou二甲基二氯硅烷为新台币加入通过试验和错误。后离子载体被添加（步骤8.4），确保了离子载体和回填溶液之间的界面是平的（图5C）。如果接口是凹的，这表明过硅烷化，而较少的硅烷应使用。如果接口是凸的，这表明下-硅烷化，和更硅烷应该被使用。
       注:二氯二甲基趋向于"关"的时间的推移， 即不太有效硅烷化实现用硅烷的相同体积。在这一点上，无论是新的硅烷可以订购，或量调节，以实现等效硅烷化。
11. 关闭加热板，并允许冷却。除去玻璃培养皿中，并转移到吸管存储罐含有硅胶，它保持干燥。小心处理吸管（镊子有用），以防止破尖。

5"SRC ="/文件/ ftp_upload / 53144 / 53144fig5.jpg"/>

图5.硅烷化吸管。（A）吸管拉马的例子。 （B）的图像在热板上的拉吸管的。含有一滴二氯二甲基硅烷的玻璃盘已被倒置在所述拉出吸管。 （C）的示意图示出的离子载体鸡尾酒和回填溶液之间的界面。平坦界面显示最佳硅烷化。 请点击此处查看该图的放大版本。

6.准备负压吸引装置

注意:在这个步骤中，一个简单的负抽吸装置制备（图6），将用于填充离子特异性电极。这个步骤仅进行一次。

1. 连接3毫升注射器到3路阀与鲁尔锁。在活栓的另一端，将含有旋转轴环和后卫，螺丝与倒钩端阴锁定路厄氏连接器。然后，将硅管，1/16英寸内径为1/8英寸的外径，以连接器的倒钩端。然后，将塑料管与1/32英寸内径3/32英寸外径

图6.负压吸引装置，图片负压吸引装置的部件（3毫升注射器与鲁尔锁，3路阀带有旋转领守卫，有倒刺末端母鲁尔锁连接器，硅胶管，塑料管）和最终的产品。 请点击此处查看该图的放大版本。

7.收集苍蝇解剖< / P>

1. 使用标飞的养殖技术^，25设置飞十字架并根据需要修改。例如，使用在增加GAL4活动所需的实验温度升高（如28°C）。
   注意:重​​要的是，苍蝇在过于拥挤条件没有饲养;雌雄父母的数量应在这种情况下被减少。如果不同基因型被使用，雄性和雌性亲本的数目应调整，以获得后代的大致相似数目。
2. 羽化2天- 1内收集苍蝇用于使用解剖（步骤11）标飞饲养技术^25。从雌蝇小管更容易解剖，但是从雄蝇肾小管也可以在必要或期望的使用。将飞入含飞食品小瓶。放置在小瓶3所要求的温度 - 前5天解剖。

8.填充离子专用电极（ISE）

e_content">注意:在这一步，在ISE回填与盐溶液中，然后离子载体引入到末端的ISE可以从每天只要再使用，因为它是工作良好。因此，这一步骤是执行每隔几天需要。

1. 为了使^K +特异性电极，使用1ml注射器和微丝（再利用微丝从实验进行实验）回填硅烷化的吸管用0.5M氯化钾。确保回填液填充到吸管的最顶端 - 在尖没有空气。如果不确定，可视化复合显微镜下。通过轻弹吸管去除气泡。
   1. 对于^Na +的特异性电极，回填用150mM NaCl洗涤。
2. 插入在ISE的后端到在步骤6.在引擎盖制备的负抽吸装置的塑料管中，放置ISE到一个倒置的塑料3.5厘米的培养皿用一块橡皮泥到位，以固定。
3. 产生负面pressure使用抽吸装置。抽回注射器与上述活栓把手指向侧端口的"关闭"。拉回会有所不同，但所述的量通常在0.6的范围内 - 0.7毫升然后打开水龙头手柄，使"关"是指向管道。
4. 在发动机罩，并使用适当的个人防护设备，浸1 - 10微升枪头到离子载体溶液（注意:有毒见材料安全数据表的安全储存和使用指导。）。通过将戴手套的手指在吸管尖的较大的开口排出一小滴。然后，触摸离子载体下降到ISE的顶端，不接触ISE尖端的枪头，以避免破坏ISE提示。
   1. 使用在材料表中所列的钾离子载体"原样"。为了制备钠离子载体，使溶液（以％w / w的）10％4- 叔 -butylcalix [4]芳烃四乙酸四乙酯，890.75％硝基苯辛基醚，和0.25％，四苯基硼酸钠（注意:有毒见材料安全数据表的安全储存和处理指令）。储存在玻璃瓶包装在铝箔从光盾。
5. 使用的化合物显微镜，以确定是否被离子载体"吸收"进入ISE尖端和是否离子载体/回填溶液界面是平坦的（见步骤5.10.1和图5C）检查在ISE下40X放大倍数。
   1. 如果没有离子载体被吸收后，增加由吸入器产生的负压的量。如果这不成功，电极可能已被充分硅烷化。使用二氯二甲基硅烷较大量重复步骤5。
6. 放置在ISE，尖向下，到一个烧杯部分地填充有150毫米氯化钾的壁。通过将模型粘土到烧杯侧面固定在ISE。尖端位于150毫米氯化钾之内。继续使用ISE OV尔多天，只要其工作良好（见步骤10.6）。
   1. 对于^Na +的ISE，储存到150 mM氯化钠的电极。

9.准备参比电极

注意:步骤9.1 - 9.3可以提前进行。步骤9.4 - 9.6在每个实验一天进行。

1. 火焰抛光的10 filamented硼硅玻璃毛细管（外直径1.2毫米，内径0.69毫米，长度为10厘米）以上小火，使用安全注意事项的目的。
2. 在吸管拔，拉吸管的〜1尖端直径 - 2微米。
3. 存储移液管在吸管储存罐备用。吸管可无限期保存。
4. 在实验当天，用微丝和注射器，填吸管与乙1M的钠尖端和柄部。确保没有气泡和该溶液进到尖端。轻轻振动吸管，如果气泡存在。
5. 使用第二微丝和注射器，回填3米氯化钾吸管。再次，保证气泡不存在。
6. 存放在装有150毫米氯化钾烧杯中的参比电极（见步骤8.6）。

ISE的10校准

注意:此步骤在实验当天进行三次:早在一天，以确保在ISE正在工作，然后之前和20的测量值后- 25分泌流体滴（见表3）。

1. 对于钾的ISE校准，放置两个0.6微升丢弃每个以下四种浓度的KCl的到有机硅弹性体涂覆的3.5厘米的培养皿（在步骤1中制备）:15毫米，75毫米，150毫米和200毫米。仔细层2 ml的矿物油在滴。
   1. 钠离子选择电极，用15毫米和150毫米氯化钠校准滴。
2. 将校准盘子摔到了体视显微镜的阶段，在法拉第笼和照明。
3. THRE广告的ISE和参比电极在银线和固定在微电极持有人。
4. 使用显微操作，推进ISE和参比电极到15毫米氯化钾下降。
5. 切换到"运行"模式下的静电。让读数稳定。
6. 记录读数笔记本。用75mM的重复，150mM和200mM的下降。计算坡度，以确定是否ISE运行良好（见步骤13.1 和表3）。如果没有，准备一个新的ISE。
   注意:标志，一个ISE都不尽如人意:未能得到读数;慢平衡（几秒或更长）;不稳定的阅读;斜率<在^K +或Na ⁺浓度49毫伏/等分变化。
7. 一天的第一校准并且在步骤12执行的测量，步骤11（小管解剖）的性能时，即间，存储在ISE电极和参考电极在150mM的氯化钾（如步骤8.6中所述）。

11。小管解剖

注意:此步骤在实验当天进行。

1. 等分出少量（〜500 - 600微升）的标准入浴介质（SBM），在步骤4.2制备，在实验当天使用，并允许温热至室温。此之前应解剖完成至少30分钟，但也可以更早完成。此外，至少有20毫升RT 果蝇生理盐水（步骤4.1），可启动前解剖。
2. 紧接开始解剖:查看检测菜在10倍放大倍率在立体显微镜下，并补充足够的SBM几乎在实验菜以及填充每个，一般为10和30微升之间。如果药物或肽将要加入到SBM中期实验，记SBM的确切体积加入到每孔中。避免过度填充所述孔，因为这可能导致小管在实验过程中漂走。
3. 仔细层〜12 - 13 ml的矿物油的在顶部，这样的孔中一个重新覆盖。这将防止流体分泌滴蒸发实验期间。
4. 将苍蝇对CO ₂垫被解剖。
5. 拿起通过它的腿或飞翼用一个镊子和地方它在步骤1中制备的有机硅弹性体涂层解剖盘背面（腹侧）刺穿胸部用Minutien针，以确保飞行到位。
6. 加入一滴RT 果蝇生理盐水（步骤4.1），以浸没在盐水飞。
7. 可选:剪掉翅膀和腿。在实践中，这通常不是必要的。
8. 用非惯用手钳在胸腹交界处，以"持有"苍蝇的腹部。使用惯用手钳剥离腹部角质层消失，开始在胸腹交界处移向尾端飞。肠道，附有马氏管，应该用这个动作暴露出来。
9. 如果没有触摸小管，解剖免费的肠/后肠和连接管。持在非优势手钳肠道，使用地下30针从肠道切断输尿管，分离从肠道和不受fly.It肾小管至关重要的是，没有任何撕裂或租金被引入小管，比在其他输尿管。
   注意:一对前部小管的最容易解剖，但是后部细管也可以使用为好。
10. 使用细玻璃棒（步骤2），拿起肾小管对和转移到测定皿的孔中。
11. 紧接着肾小管对已转移入井，拿起用玻璃棒管之一的结束，从沐浴下降撤出，直到输尿管的切断端是中间的脚和洗澡下降，和包间周围用玻璃棒销细管的端部。在这个动作的一端时，一个小管保持在洗澡盐水降和会分泌流体从输尿管的切断端， 如图1 。其它小管， 在图1中标记为"锚细管"，缠绕在销。它锚代替小管分泌，是由油包围，不分泌液。
12. 立即步骤11.11后，记下井（例如，A，B，C）中，细管的识别信息（例如，基因型或条件），和在时间（这是当流体将开始由肾小管分泌的开始时间在洗澡盐水的液滴）。
13. 继续下一个夹层。一旦实验者精于该技术中，通常需要3 - 4分钟解剖的一对细管，将它们转移到洗澡盐水，并环绕销锚小管。因此，20 - 25管可以设置在拉姆齐试验中1.5小时。因此，每个小管的启动时间约为3 - 前一个小管的开始时间之后4分钟。

12.进行测量

注:此步骤在实验当天进行。

1. 校准ISE（步骤10）第一次测量前约20分钟。这样的时间，如果需要进行新的ISE。
   注意:在期望的时间，例如2小时分泌后，每小管的分泌流体滴是准备用于测量。
2. 记录测量的时间。测量使用目镜测微尺和记录分泌的流体滴的直径。需要注意的放大倍率， 例如，50X。
3. 推进ISE和参比电极插入液体滴。切换到静电"工作。"让读数稳定。记录该值。
4. 重复下一个下降。
5. 在实验结束时，重复校准测量（步骤10）。

13.计算

注意:此步骤可以执行或者在实验当天结束时，或在稍后的时间。

1. 计算平均值斜率/等分变化的钾浓度。 表 3列出了一个例子。
   注意:对于钠，值将是15毫米和150 mM氯化钠的测量之间的差异。
2. 确定两次测量的200mM的氯化钾（或150毫摩尔NaCl）（前和后）的平均值。
3. 计算每个液滴的体积。 V ^=πD3/6，其中d是与目镜测微尺在步骤12.2测量的液滴的直径。
4. 计算分泌率= V /时间（NL /分/小管），其中V是在步骤13.3中确定的液滴的体积，和时间是时间的小管分泌的流体（=测量的时间长度 - 拉输尿管的时间走出洗澡液滴）。
5. 使用分泌流体的测得的电势之间的式[K] = 10e中（ΔV/ S）* 200或[娜] = 10e中（ΔV/ S）* 150，其中，ΔV=差（单位为mV）计算离子浓度降，以及200mM的校准液滴的电位（六或钾; 150毫降钠）​​。 S =在步骤13.1确定的斜率。
6. 计算离子通量= [离子]×液分泌率。 果蝇细管，这将是皮摩尔/分钟/小管。

14.清理

注意:此步骤是在实验当天结束执行。

1. 孔的彻底的清洗是必不可少的，以确保残留的盐晶体不会残留在孔中，改变离子浓度和渗透压摩尔浓度在以后的实验。
2. 让矿物油流掉。
3. 冲洗试验皿的孔中。 200μl的枪头可以用来轻轻刮去残留的盐结晶。使用连接到水龙头的塑料管，挤压管材创建的热水的高压喷射彻底冲洗每个孔中。
4. 晾干O / N。可替代地，一个吹干机可用于干出的孔中。
5. 用清水冲洗干净镊子去离子_H 2 O和浸泡在乙醇中15分钟到几个小时。
6. 沥干油断电校准菜和洗涤用热水。以及只要是彻底漂洗掉使用肥皂。用蒸馏水_H 2 O执行最终漂洗
7. 冲洗微丝和注射器用蒸馏水_H 2 O

结果

图7和8表明，使用拉姆齐测定用离子特异性电极来测量^的 K + ^和 Na +浓度可以区分基因和药理学上不同^的 K + ^和 Na +通量，即不通过单独测量流体分泌率捕获的信息。 图图7示出了从果蝇携带在NKCC纯合无效突变降低流体分泌小管是通过以K ^+流中的突变体（图7A）的下降驱动，而^Na +的磁通没有改变（图...

讨论

使用该拉姆齐检测，加上离子特定电极，允许液体分泌率和离子流的隔离昆虫马氏（肾）管的测量。二十个或更多小管可以一次进行测定，从而允许更高的吞吐量相比，个别的体外 microperfused小管的测定法。此外，离子特定电极允许在原位分泌液中的离子浓度的测定，从而限制了可以在小体积的流体至第二装置的转移而引入的误差。在协议中的关键步骤包括确保小管切开而不租金或?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30 G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionophore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.