Использование Рамсей анализе измерить жидкости секреции и поток ионов ставки в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Мальпигиев канальцев

Резюме

Этот протокол описывает использование анализа Ramsay для измерения скорости жидкости секреции изолированных мальпигиев (почечная) канальцев из дрозофилы. Кроме того, использование ион-специфических электродов для измерения концентрации натрия и калия в секретируемого жидкости, что позволяет рассчитать потока ионов трансэпителиальная, описан.

Аннотация

Модуляция почечной транспорта ионов эпителиальной позволяет организмы для поддержания ионной и осмотическое гомеостаз в условиях различной внешних условий. Дрозофилы мальпигиев (почечная) трубочка предлагает уникальную возможность для изучения молекулярных механизмов транспорта ионов эпителия, из-за мощных генетики этого организма и доступности ее почечных канальцах физиологического исследования. Здесь мы описываем использование анализа Ramsay для измерения скорости жидкости секреции изолированные мух почечных канальцев, с использованием ион-специфических электродов для измерения концентрации натрия и калия в секретируемого жидкости. Этот анализ позволяет изучение трансэпителиальная жидкости и ионных потоков ~ 20 трубочек в то время, без необходимости переноса секретируемый жидкости в отдельном устройстве для измерения концентрации ионов. Генетически различные трубочки могут быть проанализированы, чтобы оценить роль специфических генов в процессах переноса. Кроме того, бathing солевой могут быть изменены с целью изучения воздействия своих химических характеристик, или наркотиков или гормонов добавил. Таким образом, эта методика позволяет молекулярной характеристики основных механизмов транспорта ионов в эпителиальной канальца Drosophila, а также регулирование этих транспортных механизмов.

Введение

Почечная транспорт эпителиальных ионов лежит в основе организменном ионосферы и осморегуляции. Дрозофилы мальпигиев (почечная) трубочка предлагает уникальную возможность для изучения молекулярных механизмов транспорта ионов эпителия. Это связано с комбинацией мощных генетики дрозофилы, в паре с доступностью его почечных канальцев к физиологическому изучению. Рамсей анализ, названный в честь исследователя, который впервые технику ^1, измеряет жидкость цены секреции из изолированных мальпигиевых канальцев, и была создана в 1994 году дрозофилы в Доу и коллег ^2. Это проложило путь для дальнейших исследований с использованием генетических Drosophila инструменты, такие как системы GAL4-UAS ^3,4, чтобы определить соты сигнальные пути, регулирующие секрецию жидкости. Пример включает в себя сигнализацию кальция в ответ на это пептидный гормон, ⁵ среди многих других ^6,7.

ve_content "> Сочетание генетических методов и классического физиологического исследования показали, что поколение мочи в лету происходит через секреции хлорида богатых жидкости калия из основного сегмента канальцев. Это происходит через трансэпителиального секреции параллельно катионов, прежде всего, ^К +, но и ^Na +, через основной камере, и ^Cl -. секреции через звездчатого клетки ^8-12 Способность отдельно измерить трансэпителиальная потоков ^К + и ^Na + позволяет более подробную характеристику транспортных механизмов, чем измерение секреции жидкости в покое. Например, в нестимулированных канальцев Drosophila, ^Nа + / ^К + -АТФазы ингибитор оуабаин не имеет никакого эффекта на секрецию ² жидкости, даже когда его поглощение в основных клетках ингибируется органический анион транспортер ингибитора таурохолата ^13. Тем не менее, Линтон и О'Доннелл показал, что уабаин деполяризуетбазолатеральный мембранный потенциал, и увеличивает поток ^Na + ^9. Как показано в представительных результатов, мы воспроизвели эти результаты и показали, что поток ^К + одновременно снизился ^14; увеличение потока Na ⁺ и ^K + снизился поток имеет противоположные эффекты на секрецию жидкости, в результате чего не чистого изменения в секреции. Таким образом, есть две резолюции к "уабаина парадокса", т.е., начальное наблюдение, что уабаина не имеет никакого эффекта на секрецию жидкости в канальцах Drosophila:. Во-первых, в стимулированных канальцев, эффект уабаина на секрецию жидкости не является очевидным из-за его поглощение в органический анион транспортер ^13; во-вторых, в нестимулированных канальцев, оуабаин имеет противоположные эффекты на трансэпителиальная ^Na + ^и К + потока, что приводит к отсутствию изменений в чистой секреции жидкости (см Представитель Результаты и Ref. 9). Таким образом, основная роль Na ⁺ / ^K + -АТФазы в стимулированных канальцев снизить концентрацию внутриклеточного ^Na + для создания благоприятного градиента концентрации для ^Na +, -coupled транспортных процессов по базолатеральной мембране. Действительно, отдельно измерения Na ^{+ и K} + потоки, мы показали, что канальцы не хватает на лету натрия калия-2-хлорида котранспортера (NKCC) снизились трансэпителиальный ^K + поток, без дальнейшего снижения после уабаина того, и никаких изменений в трансэпителиального ^Na +, поток ^14. Эти данные поддержал наш вывод, что ^Na +, введя ячейку через NKCC возвращают через Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы. В другом примере, Ianowski и др. Наблюдали, что снижение ванны ^{концентрации} К + от 10 мм до 6 мм уменьшилось трансэпителиальный ^K + поток и увеличение трансэпителиальный ^Na +, в канальцах поток от Rhodnius prolixus, без чистого изменения в секреции жидкости 15. Дифференциальные воздействие на поток и K ^{+ Na} + поток через личиночной канальцев наблюдали также в Drosophila канальцев в ответ на разной соли диеты ^{16 и} в двух видов комаров в ответ на выращивании соленость ^17.

Самой большой проблемой в измерении потока ионов трансэпителиальная в подготовке Рамсей анализа является определение концентраций ионов внутри секретируется жидкости. Эта задача была выполнена с различной решений, в том числе фотометрию пламени ^18, применение радиоактивных ионов ^19, и волны зонда электронного дисперсионные спектроскопии ^20. Эти методы требуют передачи секретируемого капли жидкости на прибор для измерения концентрации ионов. Поскольку объем жидкости, секретируемый нестимулированных Drosophila трубочку мала, обычно ~ 0,5 нл / мин, это создает техническую проблему, а также вносит ошибку, если некоторые из секретируемого жидкостипотеряли при передаче. В противоположность этому, использование ион-специфических электродов позволяет измерять активности ионов (из которой концентрация ионов может быть рассчитано) на месте. Текущий протокол был адаптирован от используемого Maddrell и коллегами для измерения трансэпителиальный ^K + поток через трубочку Rhodnius в использовании валиномицина как ^K + ионофор ^21, а также описывает использование 4-трет--butylcalix [4] арена-этилендиаминтетрауксусной кислоты тетраэтилсвинец на основе сложного эфира ^Na + Определённые ионный конкретных электрод характеризуется Messerli др. др. ^22. Ион-специфичные электроды были также использованы для измерения концентрации ионов в жидкости, выделяемой мальпигиевых канальцев в анализе Рамсей во взрослой ^9,23 и личинок дрозофилы ^16, Новой Зеландии Горные Weta (Hemideina маори) ^{24 и} в ¹⁷ комаров.

Здесь мы подробно использование Рамсей какговорят, чтобы измерить жидкости цены секреции в канальцах мальпигиевых из дрозофилы, а также использование ион-специфических электродов для определения концентрации K ^{+ и} Na ⁺ в секретируемого жидкости и, таким образом расчет трансэпителиальная ионных потоков. Обзор анализа обеспечивается на фиг.1.

Рисунок 1. Схема мальпигиевых и Рамсей Анализ с использованием ион-специфических электродов измерить концентрации ионов. Эта цифра показывает установку для анализа Рамсей. (А) Каждый муха имеет четыре трубочки, пару передних канальцев и пару задних канальцев, которые плавают в брюшной полости, окруженной гемолимфы. В каждой паре, две трубочки соединяются в мочеточнике, который затем впадает мочи на стыке кишки и hindguт. Трубки слепы состава. Моча образуется в жидкости, секретирующие основной сегмент (показан красным), и течет к мочеточника и вышел в кишечнике. После вскрытия, пара трубочка диссоциирует из кишечника по пересекающих мочеточник. (B) пара канальцев затем переносили в капле физиологического раствора купания в лунку анализа блюдо. Один из двух трубочек, называют здесь как "якоря трубочку," обернут вокруг металлический штырь и инертен. Другой трубочка является секрецию канальцев. Начальный участок (который не секретирует жидкость) и основной сегмент, секретирующих трубочку оставаться в капле физиологического раствора купания. Ионы и вода переход от купания и солевом растворе в просвете канальцев основной сегмент, а затем перейти к мочеточника, как это происходит в естественных условиях. Нижний сегмент (синий) находится за пределами купания физиологического раствора, и поэтому инертны. Поскольку мочеточник вырезать, секретируемый жидкости возникает как капли от срез мочеточника. ТОн секретируется капель жидкости увеличивает течением времени, как секреции продолжается, и его диаметр измеряется с помощью окулярного микрометра. Слой минерального масла предотвращает испарение жидкости секретируемого. Конкретные ссылки и ионов электроды измерения концентрации ионов секретируемого жидкости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

протокол

1. Подготовка рассечение, калибровка и Пробирной Блюда

Примечание: На этом этапе, три пластиковые чашки Петри выложены силиконового эластомера получают: один для вскрытия, один для выполнения Ramsay анализа ("Анализ блюдо"), и один для проведения калибровки. Эти блюда используются повторно от эксперимента к эксперименту, и, таким образом этот шаг необходим только повторить, если блюдо перерывов. Изображение для анализа блюдо показано на фиг.2.

Рисунок 2. Анализ блюдо. Блюдо для анализа Рамсей показано здесь. Он находится в 10 см чашку Петри, которая выстлана силиконового эластомера. Между 20 и 25 скважин, вырезанные из эластомера. Minutien металлический штырь, разрезать пополам, находится справа от каждой скважины (или влево, если экспериментатор левша).TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53144/53144fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

1. Использование перчатки, залить ~ 80 г силиконового эластомера базу в стеклянном стакане. Добавить 1/10 веса (8 г) силиконовой эластомерной лекарство. Перемешать с металлической мешалкой. Поместите на орбитальном шейкере с плоской вершиной на пологом скорости, например, 100 оборотов в минуту, в течение нескольких часов, пока все пузырьки не будут удалены.
2. Вылейте силиконового эластомера в чистоте пластиковые чашки Петри: 100 мм х 15 мм блюда для вскрытия и анализа блюд и 35 х 10 мм для калибровки блюдо. Толщина слоя эластомера должно быть ~ 6 - 7 мм для мм чашки 100 и ~ 5 мм для 35 мм чашку.
3. Поместите посуду на скамейке при комнатной температуре (RT), чтобы вылечить (твердеют), ~ 24 - 48 ч.
4. После того, как анализ блюдо вылечить, подготовить меньшую партию силиконового эластомера, как в шаге 1.1., Например, 10 г силиконовой базе эластомера с 1 г лечения. Встряхнуть на орбитальнойне шейкер, как и в шаге 1.1 до пузырьки воздуха больше не присутствует. Это эластомер быть использован на стадии 1.5.4 и не должны затвердеть до этого шага.
5. Использование хирургического скальпеля и стандартные меры предосторожности острых предметов, сделать скважин в одном из 100 мм силиконового эластомера покрытием чашки Петри. Это будет тест блюдо.
   1. Сделать скважин ~ 1 см друг от друга и с диаметром ~ 3 - 4 мм. 25 скважин может легко поместиться в 100 мм анализа блюдо. Скважины должны быть не менее 6 мм, удаленные от стенок тарелки. Рисунок 2 иллюстрирует расстояния между скважинами. Каждый хорошо будет содержать одну жидкости секретирующих трубочку во время эксперимента. Таким образом, блюдо, содержащее 25 скважин позволит 25 канальцы, которые будут проанализированы.
   2. Используйте постоянный маркер, чтобы отметить положение скважин при необходимости.
   3. Сделать стены хорошо так гладко, как это возможно путем размещения скальпель в эластомера, а затем с помощью противоположной стороны, чтобы повернуть блюдо на 360 °.
   4. Затем, используя стандартную ша RPS меры предосторожности, окуните 30 G иглу в Неотвердевший эластомера с шага 1.4 и поместите небольшое падение на дно каждой лунки. Это сглаживает дно колодца. Разрешить вылечить (затвердевают) х 24 - 48 ч.
6. Подготовьте штифты Minutien.
   1. Поместите 0,15 мм черный анодированный Minutien булавки в ряд на куске 1 дюйм стандарт маркировки лабораторного ленты. Длинная ось булавки "должны быть ортогональны продольной оси ленты в. Разрежьте ленту вдоль его длины для того, чтобы разорвать каждый штифт на две приблизительно равные половины (рисунок 3). Используйте одну половину-контактный для каждой скважины.

Рисунок 3. Резка Minutien Pins. Штифты выстроились на части маркировки ленты параллельно. Затем, ножницы используются для резки контакты в половине.ge.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Вставьте каждую половину-штифт в силиконового эластомера примерно 1 мм вправо каждой скважины (если правша, если левша, вставьте штифт слева от каждой скважины). Это легко делается при визуализации скважин на малой мощности при вскрытии стереомикроскопом и автоматизированного с помощью тупого пинцета. Рисунок 2 иллюстрирует позиционирование булавки.

2. Подготовка Изысканные стеклянные палочки

Примечание: На этом этапе, стеклянный стержень получают, что будет использоваться для передачи канальцев из рассекает блюдо в каплю купания. Стеклянный стержень используется повторно от эксперимента к эксперименту, поэтому этот шаг выполняется только один раз, если стержень ломается и новый не требуется.

1. Получить листов 3 мм (1/8 дюйма) окрашивали черного стекла с хобби магазин и соответствующей стекла-cutting оборудование, такое как стеклорез и плоскогубцы. Используйте соответствующее оборудование безопасности (толстые перчатки, защитные очки).
2. Вырезать стекло на полоски длинных ~ 6 мм в ширину х 10 см
3. Держите полоску стекла в каждой руке. Смягчить короткий конец каждой полоски над пламенем горелки Бунзена, используя соответствующие меры предосторожности. Затем нажмите концы двух полос вместе и растащить в плавное движение, чтобы создать прекрасный стеклянный стержень с ручкой.

3. Физиология установки

Примечание: На этом этапе, микроскоп, электрометр и электрическая цепь установки. Кроме периодической повторной хлорирующим (шаг 3.2) серебряных проводов и повторной калибровки электрометра (шаг 3.8), этот шаг выполняется только один раз. Рисунок 4 иллюстрирует настройку.

Рисунок 4. Физиология установки. Настройка физиология фото здесь. (А) Обзор установки. Стереомикроскопом находится внутри клетки Фарадея с микроманипуляторами по обе стороны. Волоконно-оптический свет продет через отверстие в стороне клетки Фарадея. Электрометр находится вне клетки Фарадея. (B), хлорид пальто серебряные провода, проволока погружается в отбеливатель. (С) Крупным планом установки. Прямой держатель микроэлектрод, как показано на рисунке слева, с резьбой на зонд электрометра. Ионный конкретных электрод будет иметь резьбу на серебряной проволоки в держатель электрода. Справа, электрод имеет резьбу на серебряной проволоки держателя микроэлектродов 45 °. Схема затем должны быть соответствующим образом заземлен. Анализ блюдо показано, как он будет установлен при выполнении измерений. Пожалуйста,Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

1. Поместите stereomicrosope с окулярного микрометра внутри клетки Фарадея. Первый в интерьере клетки Фарадея, которая затем заземленной на шасси земли электрометра. Поместите микроманипуляторами по обе стороны микроскопа (фиг.4А).
2. Хлорид две серебряные провода при погружении в хлорной извести в течение, по крайней мере 1 час. Продлить ночь (O / N), при необходимости (рис 4B). Повторите этот шаг, когда серебряные провода должны быть повторно хлорированном, например, если они окрашены в серый внешний вид, а не черный.
3. Автор одной хлорированном серебряной проволоки в каждый из держателей микроэлектродов.
4. Установите электрическую цепь с соответствующим заземлением. Например, разместить вентилируемый, прямой держатель микроэлектрода, который будет содержать ион-специфических электродов (ISE), на электрометра зонда, который закреплен на микроманипулятором (фиг.4С).
5. Закрепите вентилируемый, 45 ° держатель микроэлектродного, который будет держать электрод сравнения, на другой микроманипулятора (рис 4C). Тогда земля с печатной земли на электрометра.
6. Заземление "AB" из вывода BNC электрометра на шасси земли электрометра.
7. Поместите оптический источник света за пределами клетки Фарадея, с моноблочной трубы резьбового через отверстие в клетке Фарадея (рис 4а).
8. Настройка и калибровка электрометр в соответствии с инструкциями изготовителя. Re-калибровку электрометра на регулярной основе (каждые 1 - 2 недели). После завершения, а между измерениями, оставьте электрометр в режиме "Standby" с позиции переключателя установлен на "В", вход метр установлен в "А" и ряд установлен в "200 мВ".

4. Подготовьте решения рассекает и баня

1. Подготовка дрозофилы физиологического раствора как указано в таблице 1. Для использования в экспериментах, залить ~ 40 мл в 50 мл коническую трубку и держать при комнатной температуре. Откажитесь, если есть доказательства бактериальной или грибковой роста.
2. Для приготовления стандартного купальный среду (SBM), смешать Drosophila солевой раствор 1: 1 со средой Шнайдера, и проходят через фильтр в шприце 0,22 мкм. Подготовьте небольшими аликвотами (~ 10 - 15 мл), хранят при температуре 4 ° С и отбросить, если имеются данные о бактериальной или грибковой роста. Компоненты среды Шнайдера приведены в таблице 2.

5. Создание ион-специфических электродов: Silanizing Пипец

Примечание: На этом этапе, дихлордиметилсиланом используется, чтобы слегка "silanize" ион-специфических электродов. Это добавляет гидрофобный слой на внутренней стороне электрода, что позволяет ему сохранить гидрофобный ионофор. Чрезмерное силанизация избежать, чтобы предотвратить поглощение минерального масла при изготовлении мeasurements в каплях под масла. Силанизированные электроды хорошо в течение нескольких недель. Таким образом, этот этап выполняется каждые несколько недель.

1. Пламя-польский концы 5 - 6 unfilamented труб из боросиликатного стекла капиллярных (внешний диаметр 1,2 мм, внутренний диаметр 0,69 мм, длина 10 см) на слабом огне, используя соответствующие меры предосторожности.
2. Поместите капилляры в нижней части 1 л стеклянном стакане.
3. В капюшоне и с помощью соответствующих средств индивидуальной защиты, залить 70% азотную кислоту (ВНИМАНИЕ: легковоспламеняющиеся и коррозионные см Паспорт безопасности для безопасного хранения и обработки инструкций) по капилляров и выдержите в течение 5 мин.
4. Налейте азотную кислоту обратно в стеклянную колбу. Повторное использование для последующей промывкой азотной кислоты.
5. Добавить ~ 200 мл деионизированной H _{2 O} в стакан. Пусто отходов в специальную стеклянную бутылку для отходов азотной кислоты. Повторите с дополнительными 200 мл деионизированной _H 2 O. Следуйте институциональные рекомендации по гое безопасное удаление кислотных отходов.
6. У трех дополнительных промывок с большими объемами деионизированной воды. Слейте в раковине.
7. В капот, разместить капиллярных трубок на горячей плите с керамической верхней набора до 200 ° С и сухой в течение как минимум 20 мин, оптимально 1 часа. Он также может быть оставлен на более длительные периоды времени.
8. На пипетки съемник (рис 5А), потяните пипец диаметром кончика ~ 1 - 2 мкм.
9. Поместите вытащил пипец обратно на плиту, стараясь не сломать советы, по крайней мере, 10 мин, 30 мин оптимально, но можно оставить на дольше.
10. Добавьте 20 мкл дихлордиметилсилана (ВНИМАНИЕ: легковоспламеняющиеся, коррозионные, острой токсичности, см Паспорт безопасности для безопасного хранения и обработки инструкций) в 15 см стекло Петри и инвертировать блюдо в течение пипец на горячей плите (рис 5B). Оставьте на месте в течение по крайней мере 20 мин, оптимально 2 ч. То же самое Петри могут быть повторно использованы в последующих экспериментах.
    1. Определить Amou нт дихлордиметилсиланом добавлен методом проб и ошибок. После ионофор добавляется (этап 8.4), убедитесь, что интерфейс между ионофора и засыпки раствора плоская (5С). Если интерфейс является вогнутой, то это указывает чрезмерно силанизацией, и менее силан должен быть использован. Если интерфейс является выпуклым, то это указывает под силанизацией и более силан должен быть использован.
       Примечание: дихлордиметилсиланом имеет тенденцию к "выключено" в течение долгого времени, то есть, менее эффективны силанизация достигается с таким же объемом силана.. В этот момент, как новых, силан можно заказать, или количество доводили до достижения эквивалентной силанизация.
11. Выключите плитку и дайте ему остыть. Удалить стеклянную чашку Петри и передачи пипетки с хранения сосуд, содержащий силикагель, которая поддерживает высыхание. Осторожно обращайтесь пипец (щипцы полезно), чтобы предотвратить нарушение чаевые.

5 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53144 / 53144fig5.jpg "/>

Рисунок 5. Silanizing Пипец. (A) Пример пипетки съемника. (Б) Изображение выдернутыми пипец на горячей плите. Стекло блюдо, содержащее каплю дихлордиметилсилана была перевернутой над вытащил пипец. (С) схему, иллюстрирующую взаимосвязь между коктейля ионофором и засыпки раствора. Плоский интерфейс показывает оптимальную силанизация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

6. Подготовка отрицательный всасывающего устройства

Примечание: На этом этапе, простой отрицательной всасывающее устройство подготовлено (рисунок 6), который будет использоваться для заполнения ион-специфических электродов. Этот этап выполняется только один раз.

1. Прикрепите 3 мл шприц с 3 ходовой кран с люэровского. Впротивоположный конец кран, содержащий вращающуюся воротник и охранник, винт в охватывающий соединитель Люэра замок с колючей конце. Затем прикрепите силиконовые трубки, 1/16 дюйма внутренний диаметр 1/8 дюйма с внешним диаметром, с колючей конце разъем. Затем вставьте пластиковые трубы с 1/32 дюйма внутреннего диаметра и 3/32 дюйма внешний диаметр

Рисунок 6. Отрицательный всасывания устройств. Изображение компонентов отрицательного всасывающего устройства (3 мл шприц с Луер замок, 3-полосная кран с вращающимся воротником и гвардии, женской Луер блокировки разъема с колючей конце, силиконовой трубки, пластиковые трубы) и конечный продукт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

7. Соберите Мухи для вскрытия < / P>

1. Используйте стандартные методы животноводства лету ²⁵ настроить летать кресты и изменять по мере необходимости. Например, можно использовать повышение температуры (например, 28 ° C) в экспериментах, где увеличена GAL4 желательна его активность.
   Примечание: Важно, чтобы мухи не воспитал в чрезмерно стесненных условиях; число мужчин и женщин, родителей должен быть уменьшен в этом случае. Если разные генотипы используются, число мужчин и женщин, родителей должны быть скорректированы, чтобы получить примерно одинаковое количество потомства.
2. Соберите мух для вскрытия (шаг 11) с использованием методов стандартной летать животноводства ²⁵ в течение 1 - 2 дней Eclosion. Трубочки из женских мух легче рассеченные, но канальцев самцов мух также может быть использован, если это необходимо или желательно. Место летит в пробирку, содержащую летучую пищу. Поместите флаконов при желаемой температуре в течение 3 - 5 дней до вскрытия.

8. Заполнение Ion-специфический электрод (ISE)

e_content "> Примечание:.. На этом этапе, ИНО засыпается раствором соли, а затем ионофор вводится в наконечник ИНО может быть повторно использован изо дня в день, пока он работает хорошо Таким образом, этот шаг выполняется каждые несколько дней по мере необходимости.

1. Чтобы сделать K ⁺ Определённые электрод, засыпки в Силанизированные пипетки с 0,5 М KCl с помощью шприца 1 мл и микрофиламентов (повторного использования микрофиламентов от эксперимента к эксперименту). Убедитесь, что засыпка решение заполняет до самого кончика пипетки - без воздуха в наконечник. Если неизвестно, визуализировать под микроскопом соединение. Выбить пузырьки воздуха, осторожно стряхивая пипетки.
   1. Для ^Na + -специфический электрода, засыпки 150 мМ NaCl.
2. Вставьте заднюю часть ISE в пластиковой трубки отрицательного всасывающего устройства, полученного на стадии 6. В капотом, разместить ISE на перевернутой пластмассовой 3.5 см чашки Петри с куском пластилина, чтобы обеспечить на месте.
3. Создание негативного рия с помощью всасывающего устройства. Нарисуйте назад на шприц с "OFF" на кран ручки указывая в сторону боковой порт. Количество отступая будет варьироваться, но обычно находится в диапазоне от 0,6 - 0,7 мл. Затем поверните ручку краном так "от" направлен в сторону трубки.
4. В капюшоне и с помощью соответствующих средств индивидуальной защиты, опустите 1 - 10 мкл пипетки наконечник в ионофором раствора (ВНИМАНИЕ: токсичные См ПАСПОРТ БЕЗОПАСНОСТИ для безопасного хранения и обработки инструкций.). Выгнать небольшую каплю путем размещения палец в перчатке над большим открытием наконечника пипетки. Затем коснитесь капли ионофора к оконечности ISE, без касания кончиком ISE с наконечником пипетки, чтобы избежать нарушения кончик ISE.
   1. Используйте ионофор калия, перечисленных в таблице материалов "как есть". Чтобы подготовить ионофор натрия, чтобы решение (в% вес / вес) 10% 4-трет -butylcalix [4] арена-тетрауксусной тетраэтиловый кислоты, 89.75% Нитрофенил октил эфира и 0,25% натрия борат тетрафенилборат (ВНИМАНИЕ:. Токсичен См ПАСПОРТ БЕЗОПАСНОСТИ для безопасного хранения и обработки инструкций). Хранить в стеклянном флаконе, завернутые в фольгу, чтобы оградить от света.
5. Изучить ISE под 40-кратном увеличении с использованием сложного микроскопа, чтобы определить, является ли ионофор был "рассмотрен" в наконечник и ISE ли интерфейс ионофор / засыпки решение является плоской (см шаг 5.10.1 и 5С).
   1. Если нет ионофор не был рассмотрен, увеличить количество отрицательного давления, создаваемого всасывающим устройством. Если это не удается, электрод может быть недостаточно силанизированы. Повторите шаг 5, используя большее количество дихлордиметилсилана.
6. Поместите ISE, чаевые вниз, на стене стакане, частично заполненной 150 мМ KCl. Закрепить ISE, помещая моделирования глины на стороне стакана. Наконечник находится в пределах 150 мМ KCl. Продолжайте использовать ISE овэр несколько дней, пока он работает хорошо (см шаг 10,6).
   1. Для Na ⁺ ISE, хранить электрод в 150 мМ NaCl.

9. Подготовьте электрод сравнения

Примечание: Шаги 9,1 - 9,3 могут быть выполнены заранее. Шаги 9.4 - 9.6 выполняются каждая экспериментальная день.

1. Пламя-польский концы труб 10 филаментированных боросиликатного стекла капиллярных (внешний диаметр 1,2 мм, внутренний диаметр 0,69 мм, длина 10 см) на слабом огне, используя меры предосторожности.
2. На пипетки съемник, потяните пипец диаметром кончика ~ 1 - 2 мкм.
3. Храните пипец в памяти пипетки банку до использования. Пипец можно хранить неопределенно долго.
4. В день эксперимента, используя шприц и микрофиламентов, заполнить наконечник и хвостовик пипетки с ацетатом натрия 1 М. Убедитесь, нет пузырьков воздуха и это решение идет в конце. Аккуратно вылить пипетки, если пузырьки воздуха присутствуют.
5. С помощью второгомикрофиламентных и шприцев, засыпки пипетки с 3 М KCl. Опять же, обеспечить воздушные пузырьки не присутствуют.
6. Хранить электрод в химический стакан, содержащий 150 мМ KCl (см шаг 8,6).

10. Калибровка ISE

Примечание: Этот шаг выполняется три раза в день эксперимента: в начале дня, чтобы убедиться, что ИНО работает, а затем до и после измерений 20 - 25 капель жидкости секретируемых (таблица 3).

1. Для калибровки калия ISE, поместите два 0,6 мкл капли каждого из следующих четырех концентрациях KCl на силиконового эластомера покрытием 3,5 см чашку Петри (полученного на стадии 1): 15 мм, 75 мм, 150 мм и 200 мм. Тщательно слой 2 мл минерального масла в течение капель.
   1. Для натрия ISE, использовать калибровочные капель 15 и 150 мм NaCl.
2. Поместите калибровочный блюдо на стадии стереомикроскопом в клетке Фарадея и осветить.
3. АвтошоуОбъявление ИНО и электрод сравнения в течение серебряных проводов и закрепите в держатели микроэлектродов.
4. Использование микроманипуляторами, продвигать ISE и электродов сравнения в каплю 15 мМ KCl.
5. Включите электрометр, чтобы "работать" режим. Разрешить чтение, чтобы обосноваться.
6. Запись чтение в блокнот. Повторите с 75 мм, 150 мм и 200 мМ падает. Рассчитать наклон, чтобы определить, является ли ISE работает хорошо (см шаг 13.1 и таблицу 3). Если нет, подготовить новый ISE.
   Примечание: Знаки, что ISE не работает хорошо: отказ получить чтение; медленно, чтобы уравновесить (несколько секунд или больше); нестабильная чтение; Наклон <49 мВ / изменение децильная в K ^{+ или Na} + концентрации.
7. Между первой калибровки дня и измерений, выполненных на этапе 12, то есть во время выполнения шага 11 (канальцев вскрытия), хранить ISE и электродов сравнения в 150 мМ KCl (как описано в шаге 8.6).

11. Вскрытие канальцев

Примечание: Этот этап выполняется в день эксперимента.

1. Аликвоты из небольшого количества (~ 500 - 600 мкл) стандарт ванны среды (SBM), полученного на стадии 4.2, для использования в день эксперимента, и позволяют нагреваться до комнатной температуры. Это должно быть сделано по крайней мере, за 30 мин до вскрытия, но также может быть сделано ранее. Кроме того, по крайней мере, 20 мл физиологического раствора РТ Drosophila (шаг 4.1) доступны перед началом вскрытия.
2. Непосредственно перед началом вскрытия: смотреть анализа блюдо в 10-кратным увеличением при помощи стереомикроскопа и добавить достаточно SBM почти заполнить каждую лунку в аналитическом блюдо, как правило, между 10 и 30 мкл. Если наркотики или пептид будет добавлен в SBM середине эксперимента, сделать замечание о точном объеме SBM добавляли в каждую лунку. Избегайте чрезмерного заполнения скважины, так как это может привести к трубочку уплывает в ходе эксперимента.
3. Тщательно слой ~ 12 - 13 мл минерального масла на вершине, так что скважинахвновь закрыты. Это позволит предотвратить испарение капель жидкости секретируемых в ходе эксперимента.
4. Место летит разрезать на _СО 2 подушки.
5. Возьмите муху через его ногу или крыло с пинцетом и место на спине (вентральной стороной вверх) на силиконовый эластомер покрытием рассекает блюдо, полученного на стадии 1. Прокалывание грудную клетку с булавкой Minutien обеспечить муху на месте.
6. Добавить каплю РТ Drosophila физиологического раствора (шаг 4.1), чтобы погрузиться муху в физиологическом растворе.
7. Дополнительно: обрезать крылья и ноги. На практике это обычно не требуется.
8. Используйте не доминантной рукой пинцет, чтобы "держать" живот мухи на торакоабдоминальной перехода. Используйте доминирующую руку пинцет, чтобы очистить брюшную кутикулы прочь, начиная с торако-абдоминальной перехода и движется в направлении задней части лету. Кишка, с прикрепленными мальпигиевых канальцев, должны подвергаться с этого маневра.
9. Не касаясь канальцы, рассекают бесплатно средняя кишка /задняя кишка и прикрепленные трубочки. Держите кишки в не доминантной рукой пинцетом и использовать 30 G иглу, чтобы разъединить мочеточник из кишечника, снятие канальцев из кишечника и бесплатно от fly.It важно, что без слез или арендная плата не будет введена в трубочку, кроме как по мочеточнику.
   Примечание: Передняя пара канальцев наиболее легко рассекали, однако задние канальцы могут быть также использованы.
10. Использование тонкой стеклянной палочкой (шаг 2), подобрать пару канальцев и передачи в лунку анализа блюдо.
11. Сразу же после пара трубочка была передана в колодец, подобрать конец одного из канальцев с стеклянной палочкой, отказаться от падения купальный пока срез мочеточника не находится на полпути между штифтом и падения купания, и обертки конец трубочки вокруг штифта с помощью стеклянной палочки. В конце этого маневра, один канальцев остается в капле ванны соли и секретируют жидкость из обрезанный конец мочеточника, как показано на рисунке 1 . Другой трубочка, назвал "якорь трубочку" на рисунке 1, обернута вокруг пальца. Это закрепляет секрецию канальцев на месте, в окружении нефти, и не выделяют жидкость.
12. Сразу после шага 11.11, запишите хорошо (например, А, В, С), трубочка идентификации информации (например,., Генотип или состояние), и время (это время начала, когда жидкость начнет быть секретируется трубочку в капле физиологического раствора для купания).
13. Переходите к следующей вскрытия. После того, как экспериментатор специалистам в этой технике, это обычно занимает 3 - 4 минут, чтобы рассекать пару трубочек, передавать их для купания физиологическим раствором, и оберните якорный трубочку вокруг пальца. Таким образом, 20 - 25 канальцы могут быть установлены в анализе Ramsay течение 1,5 ч. Поэтому время начала каждого канальца будет около 3 - 4 мин после начала времени предыдущего трубочку.

12. Проведение измерений

Примечание: Этот этап выполняется в день эксперимента.

1. Калибровка ISE (шаг 10) примерно 20 мин до первого измерения. Это позволяет время, чтобы сделать новую ISE, если необходимо.
   Примечание: в заданное время, например, после 2 часов секреции, секретируемый падение жидкости каждого канальца готов к измерению.
2. Запишите время измерения. Измерить диаметр секретируемого капли жидкости с помощью окулярного микрометра и запись. Обратите внимание на увеличение, например, 50X.
3. Продвигайте ISE и электрод сравнения в капле жидкости. Включите электрометр, чтобы "работать". Позвольте стабилизации показаний. Запишите значение.
4. Повторите для следующего падения.
5. В конце эксперимента, повторить измерения калибровки (шаг 10).

13. Расчеты

Примечание: Этот шаг может быть выполнен либо в конце дня эксперимента, или в более позднее время.

1. Рассчитать среднееНаклон / изменение децильная концентрации калия. Таблицу 3 в качестве примера.
   Примечание: Для натрия, значения будут разницу между 150 измерений мМ NaCl в 15 мМ и.
2. Определить среднее значение двух измерений (до и после) 200 мм KCl (или 150 мМ NaCl).
3. Рассчитайте объем каждой капли. V = πd ^3/6, где d представляет собой диаметр капли измеренного с окулярного микрометра на шаге 12.2.
4. Рассчитать скорость секреции = V / время (Нл / мин / канальцев), где V является объем капли, определенной в шаге 13,3, а время длина время трубочка секретируется жидкости (= время измерения - время, потянув мочеточника из купания капли).
5. Рассчитать концентрацию ионов по формуле [K] = 10e (Dgr; v / S) * 200 или [Na] = 10е (Dgr; v / S) * 150, где Av = разность (в мВ) между потенциалом измеряемой секретируемого жидкости падение, и потенциал падения 200 мм калибровки (Fили калия; 150 мМ падение для натрия). S = наклон определено на этапе 13.1.
6. Рассчитать потока ионов = [] ионный х жидкости скорость секреции. Для Drosophila канальцев, это будет пмоль / мин / канальцев.

14. Очистка

Примечание: Этот этап выполняется в конце дня эксперимента.

1. Тщательная очистка колодцев необходимо для того, чтобы остаточные кристаллы соли не остаются в скважинах, изменяя концентрацию ионов и осмолярность в будущих экспериментах.
2. Разрешить минеральное масло для отвода.
3. Промыть лунки анализа блюдо. Пипетки наконечник 200 мкл могут быть использованы, чтобы аккуратно соскрести остаточный кристаллов соли. Использование пластиковых труб, прикрепленный к крану, выжать трубки, чтобы создать самолет высокого давления горячей воды, чтобы тщательно промыть каждую лунку.
4. Дайте высохнуть O / N. В качестве альтернативы, сушилка удара могут быть использованы для высыхают колодцы.
5. Смойте щипцы деионизированной _H 2 O изамочить в этаноле в течение 15 мин до нескольких часов.
6. Слейте масло от калибровки блюдо и мыть горячей водой. Используйте мыло, а также пор, пока она тщательно смыть. Выполните окончательную промыть дистиллированной H _{2 O.}
7. Флеш микрофиламенты и шприцы с дистиллированной _H 2 O.

Результаты

7 и 8 показывают, что применение анализа Ramsay с ион-специфических электродов для измерения концентрации ^К + и ^Na + можно выделить генетически и фармакологически отличный ^K + и флюсы ^Na +, информацию, которая не захвачен измерения плавные частоты секреции в пок?...

Обсуждение

Применение анализа Ramsay вместе с ион-специфических электродов, позволяет измерять жидкости ставок секреции и ионных потоков в изолированных насекомых мальпигиевых (почечных канальцев). Двадцать и более канальцы могут быть проанализированы в то время, позволяя более высокую пропускну?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30 G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionophore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.