Ramsay Testi Kullanımı sıvı salgılanması ve İyon Flux fiyatlar Tedbir<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Malpighi Tübül

Özet

Bu protokol, Drosophila melanogaster izole Malpighian (renal) tübüllerin sıvı sekresyon oranları ölçmek için Ramsay tahlilinin kullanımı açıklanmaktadır. Buna ek olarak, belirli bir iyon elektrotların kullanımı transepitelyal iyon akışının hesaplanmasını sağlayan, salgılanan sıvının içinde sodyum ve potasyum konsantrasyonlarını ölçmek için, tarif edilmektedir.

Özet

Böbrek epitel iyon taşıma modülasyonu organizmalar dış koşullar değişen yüzüne iyonik ve osmotik homeostazı korumak için olanak sağlar. Drosophila melanogaster Malpighi (böbrek) tübül dolayı bu organizmanın ve fizyolojik çalışmaya renal tübüllerin erişilebilirlik güçlü genetiğe, epitel iyon taşıma moleküler mekanizmaları incelemek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Burada, salgılanan sıvının sodyum ve potasyum konsantrasyonları ölçmek için iyon belirli elektrotların kullanımı ile izole edilmiş uçucu renal tüplerin sıvı sekresyon oranları ölçmek için Ramsay tahlilinin kullanımı açıklanmaktadır. Bu deney iyonu konsantrasyonunu ölçmek için ayrı bir cihaz ile salgılanan sıvıyı transfer etmeye gerek kalmadan, 20 tübüller bir kerede transepitelyal sıvısı ve iyon akılarının çalışma ~ sağlar. Genetik olarak farklı tübüller taşıma süreçlerinde belirli genlerin rolünü değerlendirmek için analiz edilebilir. Buna ek olarak, bathing tuzlu su ilave kimyasal özellikleri ya da ilaçlar ya da hormonların etkilerini incelemek için modifiye edilebilir. Özetle, bu teknik, bu taşıma mekanizmaları epitel iyon Drosophila tübülde ulaştırma yanı sıra, düzenlemenin temel mekanizmaları moleküler karakterizasyonu sağlar.

Giriş

Böbrek epitel iyon taşıma organizma iono- ve osmotik düzenleme temelini oluşturmaktadır. Drosophila melanogaster Malpighi (böbrek) tübül epitel iyon taşıma moleküler mekanizmaları incelemek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Bu fizyolojik çalışmaya renal tübüllerin erişilebilirlik ile eşleştirilmiş Drosophila güçlü genetik, birleşimi kaynaklanmaktadır. Tekniği ¹ öncülük araştırmacı adını Ramsay deneyi, izole Malpighi tüplerinin sıvı sekresyon oranları ölçen ve Dow ve arkadaşları ² tarafından 1994 yılında Drosophila kurulmuştur. Bu sıvı salgılanması düzenleyen hücre spesifik sinyal yolları tanımlamak için, Drosophila gibi GAL4 UAS sistemi ^3,4 olarak genetik araçları kullanılarak ileri çalışmalar için yol açtı. Bir örnek diğerleri ^6,7 arasında bir peptit hormonu ⁵ yanıt olarak, kalsiyum sinyal içerir.

Sinek tübülün ana segmentten bir potasyum klorid zengin sıvının salgılanması ile gerçekleşir in ve_content "> genetik teknikler ve klasik fizyolojik çalışmanın bir kombinasyonu idrar nesil göstermiştir. Bu öncelikle, katyon paralel transepitelyal salgılama yoluyla gerçekleşir ^{K +,} Na +, aynı zamanda, ana hücre, ve Cl yoluyla ^-. stellat hücre ^8-12 aracılığıyla salgılama ayrıca transepitelyal ^K + ^Na + akıları ölçmek için yeteneği, sıvı sekresyon ölçümünün taşıma mekanizmaları daha ayrıntılı bir karakterizasyonu sağlar yalnız. Örneğin, unstimulated Drosophila tübüllerde Na ^{+ / K +} ATPaz inhibitörü uvabain sıvı salgılanması ² üzerinde hiçbir etkisi yoktur, asıl hücrelere onun alımı organik anyon taşıyıcısı inhibitörü torokolat ¹³ tarafından inhibe bile. Ancak, Linton ve O'Donnell ouabain depolarize gösterdibazolateral membran potansiyeli ve Na ⁺ akımına ⁹ artar. Örnek Sonuçlar gösterildiği gibi, bu bulguları teyit edilmiş, ve eş zamanlı olarak ¹⁴ azalma ^K + akı olduğunu göstermiştir; artan Na ⁺ akışı ve K ⁺ azalmış akışı salgılanmasında net bir değişikliğe neden sıvı sekresyon karşıt etkileri vardır. . Böylece, "ouabain paradoks," yani iki çözünürlükleri vardır, Drosophila tübül sıvı salgılanması üzerinde hiçbir etkisi yoktur ouabain ilk gözlem: Birincisi, uyarılmış tübüllerde sıvı salgılanması üzerindeki ouabainin etkisi belirgin değildir nedeniyle organik anyon taşıyıcısı ¹³ tarafından alımı; ve ikinci, uyarılmamış tübüllerde, uvabain (Temsilci Sonuçlar ve ref bakın. 9) sıvı salgılanması hiçbir net bir değişiklik sonuçlanan transepitelyal Na ⁺ ve K ⁺ akı üzerindeki etkilerini karşıt vardır. Bu nedenle, ^Na + birincil rolü / ^K + ATPuyarılmamış tübüllerde ase Na ⁺ bazolateral membran boyunca taşıma işlemleri -coupled için uygun bir konsantrasyon gradyanı oluşturmak için hücre içi Na ⁺ konsantrasyonunu düşürmek için. Nitekim, ayrı ayrı ^Na + ve ^K + akıları ölçerek, biz tübüller sinek sodyum potasyum-2-klorür kotransportörü (NKCC) eksik ouabain ilavesinden sonra başka bir azalma ile, transepitelyal K ⁺ akı azalmış ve transepitelyal hiçbir değişiklik göstermiştir Na ^{+ 14} akı. Bu bulgular, NKCC ile hücreye giren Na ^{+ Na + / K +} -ATPase'ın deveran eden sonucunu desteklemiştir. Başka bir örnekte, Ianowski ve ark., 10 mM mM ile 6 banyo K ⁺ konsantrasyonunun azaltılması sıvı sekresyonunda net bir değişiklik ile, Rhodnius prolixus gelen tübüllerde transepitelyal K ⁺ akışı ve artan transepitelyal Na ⁺ akımına azaldığı görülmüştür 15. Larva tübüller ^arasında, Na + ^ve K + akı akı diferansiyel etkileri de tuzluluk ¹⁷ yetiştirme yanıt olarak değişen bir tuzu diyetler ¹⁶ ve iki sivrisinek türlerde karşılık olarak Drosophila tübüllerde gözlenmiştir.

Ramsay tahlil hazırlığında transepitelyal iyon akışının ölçümünde büyük zorluk salgılanan sıvı içinde iyon konsantrasyonlarının belirlenmesidir. Bu meydan okuma alev photometery ^18, radyoaktif iyonların ¹⁹ kullanımı ve elektron prob dalga boyu dağıtıcı spektroskopisi ²⁰ olmak üzere değişen çözümleri ile karşılandı. Bu teknikler iyon konsantrasyonlarının ölçümü için bir enstrümana salgıladığı sıvı damla transferini gerektirir. Uyarılmamış Drosophila tübül salgılanan sıvının miktarı az olduğundan, genelde ~ 0.5 nl / min, bu teknik bir sorun teşkil etmektedir ve salgılanan sıvının bir kısmını ise de hata getirmektedirtransferi üzerine kaybetti. Buna karşılık, iyon belirli elektrotların kullanılması in situ (iyon konsantrasyonu hesaplanabilir olan) iyonu aktivitesinin ölçülmesini sağlar. Geçerli protokol K ⁺ iyonoforu ²¹ olarak Valinomycin kullanılarak Rhodnius tübül boyunca transepitelyal K ⁺ akının ölçülmesi için iş Maddrell ve arkadaşlarının kullandığı uyarlanmıştır ve aynı zamanda, bir 4-tert--butylcalix [4] aren-tetraasetik asit kullanımını tarif edilmiştir tetraetil ester bazlı Na Messerli et ile karakterize -spesifik iyon spesifik elektrot ^+. ark. ^22. İyon spesifik elektrotlar erişkin ^9,23 ve larva ¹⁶ Drosophila melanogaster Ramsay tahlilinde Malpighian tübüller tarafından salgılanan sıvının iyon konsantrasyonunu ölçmek için kullanılmıştır, Yeni Zelanda Alpine Weta (Hemideina maori) ²⁴ ve sivrisinek ^17.

Burada, biz ayrıntılı olarak Ramsay kullanımını diye tanımladıklarıSıvı salgılanması Drosophila melanogaster gelen Malpighian tübüllerde oranları, hem de salınan sıvı ^içinde, K +, Na ^{+ 'nın} konsantrasyonlarını belirlemek için iyon belirli elektrotların kullanılmasını ve böylece transepitelyal iyonu akılarının hesaplama ölçmek için demek. Tahlilinde bir genel görünüşü Şekil 1'de verilmektedir.

Malpighi Pipet Şekil 1. şematik ve İyon Konsantrasyonları Tedbir İyon özel elektrotlar kullanımı ile Ramsay Deneyi. Bu rakam Ramsay testi için kurulum göstermektedir. (A) Her bir sinek, dört tübüller, ön tübüllerin bir çift ve arka tübüller bir çift hemolimf çevrili karın boşluğunda yüzer sahiptir. Her bir çiftin iki tübülleri sonra midgut ve hindgu kavşakta idrar üreter boşaltır, at katılmakt. Tübüller kör uçlu. İdrar (kırmızı ile gösterilen) sıvı salgılayan ana kesimi tarafından üretilen ve bağırsak içine üreter doğru ve dışarı akar. Diseksiyon sonra tübül çifti üreter bölücü ile barsaktan ayrılır. (B) tübül çifti sonra deney kabına içinde banyo salin damlacık içine aktarılır. Burada adlandırılan iki tübül biri "çapa tübül," bir metal pim etrafında sarılır ve inert olan bir. Diğer tübül salgılayan tubule olduğunu. İlk bölüm (sıvı salgılar değildir) ve salgılayan tübülün ana segmenti yıkanma tuzlu su damlacık içinde kalır. In vivo oluşacak şekilde daha sonra İyonlar ve banyo tuzlu ve ana segment tübül lümenine su taşımak ve, üreter doğru hareket. Alt segment (mavi) banyo tuzlu ve bu nedenle atıl dışında. Üreter kesilir yana, salgılanan sıvı üreter kesik ucundan bir damlacık olarak ortaya çıkmaktadır. TO salgılanması devam ederken sıvı damlacık zamanla genişletir salgılanır ve çapı oküler mikrometre kullanılarak ölçülür. Mineral yağ tabakası salgılanan sıvının buharlaşmasını önler. Referans ve iyon spesifik elektrotlar salgılanan sıvının iyon konsantrasyonunu ölçmek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Protokol

1. Hazırlanması Diseksiyon, Kalibrasyon ve Deney Yemekleri

Not: Bu adımda, silikon elastomer kaplı üç plastik petri hazırlanır: Ramsay deneyi ("tahlil çanak") gerçekleştirmek için diseksiyon için bir tek ve kalibrasyonu için bir. Bu yemekler deneme deneyden yeniden kullanılır ve bu nedenle bu adım sadece bir tabak kırılması halinde tekrarlanması gerekmektedir. Deney kabı bir resmi, Şekil 2 'de gösterilmiştir.

Şekil 2. Deney Bulaşık. Ramsay tayini için kullanılan çanak burada gösterilir. Bu silikon elastomer ile kaplı olduğu bir 10 cm petri olduğunu. 20 ile 25 kuyu elastomer oyulmuştur. (Deneyci solak ise, ya da sol) yarıya bir Minutien metal pim, her iyi sağında yer alıyor.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53144/53144fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1. Eldiven kullanarak, bir cam behere ~ 80 g silikon elastomer tabanı dökün. 10/01 ağırlık (8 g) silikon elastomer tedavi ekleyin. Bir metal karıştırıcı ile karıştırın. Tüm kabarcıklar kaldırılmış kadar birkaç saat süre ile, örneğin, 100 rpm, hafif bir hızda üstü düz bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
2. Temiz plastik petri kaplarının içine silikon elastomer dökün: diseksiyon ve tahlil yemekleri için 100 mm x 15 mm yemekleri ve kalibrasyon yemek için 35 x 10 mm. 35 mm tabak için 100 mm'lik kaplara 7 mm, ~ 5 mm - elastomer tabakasının kalınlığı ~ 6 olmalıdır.
3. 48 saat - ~ 24 (sertleşir) tedavisi için oda sıcaklığında (RT) bankta yemekleri yerleştirin.
4. Deney çanağı kuruduğu zaman, adım 1.1, 1 g tedavi örn., 10 gr silikon elastomer baz gibi silikon elastomer daha küçük bir toplu hazırlar. Yörünge üzerinde çalkalayınadım 1.1 olarak çalkalama hava kabarcıkları artık mevcut olana kadar. Bunun, elastomer aşama 1.5.4 kullanılacak ve önceki aşamada sertleşmesine izin verilmemelidir.
5. Cerrahi neşter ve standart kesici önlemler sayesinde, 100 mm silikon elastomer kaplı petri birinde kuyu yapmak. Bu tahlil yemek olacak.
   1. 4 mm - ayrı ve ~ 3 arasında bir çapa sahip kuyu ~ 1 cm sağlayın. 25 kuyu kolayca 100 mm tahlil çanak sığabilir. Wells. Çanak duvarları çıkartılmış en az 6 mm 2 kuyu aralığı göstermektedir Şekil gerekir. Her iyi deney sırasında bir sıvı salgılayan tubule içerecektir. Bu durumda, 25 kuyu ihtiva eden bir tabak 25 tübüller analiz edilecek sağlayacaktır.
   2. Gerekirse kuyuların pozisyonunu işaretlemek için kalıcı bir kalem kullanın.
   3. Elastomerdeki neşter yerleştirerek, sonra çanak 360 ° döndürmek için ters elinizi kullanarak mümkün yanı sıra pürüzsüz duvarlarını olun.
   4. Ardından, standart SHA kullanarak önlemleri rps, aşama 1,4 olmayan sertleştirilmiş elastomer bir 30 G iğne daldırma ve her bir alt kısmında küçük bir damla yerleştirin. Bu kuyunun dibine dışarı yumuşatır. 48 saat - kurumaya bırakınız (sertleşmesine) 24 x.
6. Minutien işaretçilerine hazırlayın.
   1. 1 inçlik standart laboratuvar etiketleme bant parçası üzerinde üst üste 0,15 mm siyah eloksal Minutien işaretçilerine yerleştirin. Pin 'uzun eksen bandın uzun eksenine göre ortogonal olmalıdır. İki yaklaşık olarak eşit parçalara (Şekil 3), her bir iğne koparmaya için kendi uzunluğu boyunca bant kesin. Her bir oyuk için bir yarım uç kullanın.

Şekil 3. Minutien Pins Kesme. Pimleri paralel olarak etiketleme bant parçası üzerinde dizilmiş. Daha sonra, makas devre işaretçilerini kesmek için kullanılır.ge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. Silikon elastomer de her sağında yaklaşık 1 mm içine her yarım pimini takın (sağ elini ise; solak, her iyi solundaki pimi eklerseniz). Diseksiyon stereomikroskop altında düşük güçte kuyu görselleştirilmesi ve künt forseps kullanımı ile destekli olduğunda bu en kolay yapılır. 2 pim konumlanmasını göstermektedir Şekil.

İnce Cam Çubuklar Hazırlama 2.

Not: Bu adımda, bir cam çubuk banyo damla halinde kesme çanak tübülleri aktarmak için kullanılabilir ki hazırlanır. Cam çubuk deneme deneyden yeniden kullanılır, bu nedenle bu adımı sadece bir kez çubuk sonları ve yeni bir ihtiyaç olmadıkça yapılır.

1. Bir hobi mağazasında ve uygun camdan 3 mm (1/8 inç) kalınlığında lekeli siyah cam yaprak edininBöyle bir cam kesici ve pense gibi donanımları -Kesici. Uygun güvenlik cihazı (kalın eldiven, gözlük) kullanın.
2. ~ 6 mm genişliğinde x 10 cm uzunluğunda şeritler halinde kesin cam
3. Her elinde bir cam şeridi tutun. Uygun güvenlik önlemleri kullanarak, Bunsen beki alevi boyunca her şeridin kısa ucunu yumuşatın. Ardından, birlikte iki şerit uçları itmek ve bir kolu ile ince bir cam çubuk oluşturmak için yumuşak hareketle ayrı çekin.

3. Fizyoloji Kur

Not: Bu adımda, mikroskop, elektrometre ve elektrik devresi kurulur. Gümüş tel ve elektrometrenin (adım 3.8) yeniden kalibrasyon periyodik yeniden klorid edilmesine (adım 3.2) dışında bu adımı sadece bir defa yapılır. 4 kurulumunu göstermektedir Şekil.

4. Fizyoloji Kur Şekil. fizyoloji kurulumu burada resmedilmiştir. Kurulum (A) genel bakış. Stereomikroskop iki tarafında mikromanipülatörler ile Faraday kafesi içine yerleştirilir. Bir fiber optik ışık Faraday kafesi yan bir delikten geçirilir. Elektrometre Faraday kafesi dışına yerleştirilir. Kaplamaz gümüş teller klorür (B), tel ağartıcı içine batırılır. (C) kurulum Close-up. Soldaki bu resimde gösterilen düz mikroelektrod tutucu, elektrometrenin prob üzerine dişli. Iyon spesifik elektrod sonra elektrot tutucu içine gümüş tel üzerinden dişli olacak. Sağda, referans elektrot 45 ° mikroelektrod sahibinin gümüş tel üzerinden dişli. Devre sonra uygun topraklanmalıdır. Ölçümler zaman yerleştirilmiş olacak gibi tahlil çanak gösterilir. LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

1. Faraday kafesi içinde oküler mikrometre ile stereomicrosope yerleştirin. Daha sonra elektrometrenin şasi toprak topraklı Faraday kafesi, iç zemin. Mikroskobu (Şekil 4A) her iki tarafında mikromanipülatörler yerleştirin.
2. En az 1 saat boyunca çamaşır suyu daldırarak Klorür iki gümüş tel. Gerektiğinde (O / N), gece boyunca (Şekil 4B) uzatın. Gümüş teller onlar görünüşte gri yerine siyah örneğin, yeniden klorid edilmesine gerektiğinde bu adımı yineleyin.
3. Konu tek mikroelektrot sahiplerinin her birine gümüş tel Tekrar klorid.
4. Uygun topraklama ile elektrik devresini kurmak. Örneğin, mikromanipülatör (Şekil 4C) üzerine sabitlenir elektrometre prob üzerinde iyon spesifik elektrot (ISE) yapacak havalandırıldı düz mikroelektrot tutucu, yerleştirin.
5. Diğer mikromanipülatör (Şekil 4C) üzerine, referans elektrodu yapacak Bacalı, 45 ° mikroelektrod tutucu, sabitleyin. Sonra elektrometrenin devre toprağa topraklayın.
6. Elektrometrenin şasi toprağa elektrometrenin "AB dışı" çıkışı BNC topraklayın.
7. Faraday kafesi (Şekil 4A) bir delikten dişli boynu boru ile, Faraday kafes dış fiber optik ışık kaynağı yerleştirin.
8. Set up ve üreticinin talimatlarına göre elektrometreyi kalibre. Yeniden kalibre düzenli olarak elektrometreyi (her 1-2 hafta). Tamamlandığında ve ölçümler arasında, "IN" metre girdi ayarlamak için ayarlanmış pozisyon geçiş ile "bekleme" modunda elektrometreyi terk etmek set "A" ve aralık için "200 mV."

4. Diseksiyon ve Banyo Çözümleri hazırlayın

1. Hazırlamak Tablo 1 'de detaylı Drosophila salin. deneylerde kullanım için, bir 50 ml konik bir tüp içine ~ 40 mi dökün ve oda sıcaklığında saklayın. Bakteriyel veya fungal büyüme kanıt olmadığını atın.
2. Schneider ortamı ile 1 ve 0.22 um'lik bir şırınga filtresinden geçtiği: Standart banyo ortamı (SK) hazırlamak için, Drosophila tuzlu su 1 karıştırın. 4 ° C'de, mağaza ve bakteriyel veya mantar büyümesi kanıt varsa atın - küçük alikotları (15 ml ~ 10) 'de hazırlayın. Schneider ortamı bileşenleri Tablo 2 de listelenmiştir.

5. İyon özgü Elektrodun yapma: Silanizing Pipetler

Not: Bu adımda, diklorodimetilsilan hafifçe "Silanize" iyon belirli bir elektrot kullanılır. Bu hidrofobik iyonofor korumak sağlar elektrotun içine bir hidrofobik kaplama ekler. Aşırı silanizasyon m yaparken mineral yağ alımını önlemek için önleniryağ altında damla easurements. Silanlanmış elektrotlar birkaç hafta için iyidir. Bu nedenle, bu adım her birkaç haftada gerçekleştirilmektedir.

1. Alev lehçe 5 uçları - uygun güvenlik önlemlerini kullanarak Kısık ateşte 6 unfilamented borosilikat cam kapiller tüplerin (dış çap 1.2 mm, iç çapı 0.69 mm, uzunluğu 10 cm).
2. 1 L'lik bir cam beher alt kılcal tüpler yerleştirin.
3. Bir başlık ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanırken,% 70 nitrik asit dökmek: kılcal tüpler üzerinde (DİKKAT Yanıcı ve aşındırıcı, güvenli depolama ve taşıma talimatlar için Malzeme Güvenlik Bilgi Formuna bakınız) ve 5 dakika bekletin.
4. Geri bir cam şişe içine nitrik asit dökün. Sonraki nitrik asit yıkama için yeniden kullanımı.
5. Behere deiyonize H ₂ O ~ 200 ml ilave edilir. Nitrik asit atıkları için özel bir cam şişenin içine boşaltın atık. Deiyonize _H2O ilave 200 ml ile tekrarla Th kurumsal yönergeleri izleyinasit atıkların e güvenli bertaraf.
6. Deiyonize büyük hacimlerde su ile üç ek yıkar yapın. Lavabonun içine boşaltın.
7. Kaput, 20 dakikada, optimal olarak 1 saat içinde en az seramik üst 200 ° C'ye set ve kuru sıcak bir levha üzerinde kılcal tüpleri. Aynı zamanda, daha uzun bir süre için bırakılabilir.
8. 2 um - Bir pipet çektirmesi (Şekil 5A) üzerinde ~ 1 bir ucu çapına pipetleri çekin.
9. En az 10 dakika süreyle, ipuçları kırmaya özen geri ocak üzerine optimal 30 dk çekti pipetleri yerleştirin ama daha uzun süre kalabilir.
10. 20 diklorodimetilsilan ul ekleyin: 15 cm'lik cam petri içine (DİKKAT Yanıcı, aşındırıcı, akut toksisite, güvenli saklama ve taşıma talimatlar için Malzeme Güvenlik Bilgi Formuna bakınız) ve sıcak plaka (Şekil 5B) üzerine pipetleri üzerinde çanak ters çevirin. En az 20 dakika boyunca bir yerde optimal 2 saat bırakın. Aynı petri sonraki deneylerde tekrar kullanılabilir.
    1. Amou belirleyin diklorodimetilsilan ve nt deneme yanılma tarafından eklenmiştir. Iyonofor (adım 8.4) ilave edildikten sonra, iyonofor ve dolgu çözeltisi arasında arayüz (Şekil 5C) düz olduğundan emin olun. Arayüzü konkav ise, bu aşırı silanizasyon göstermektedir ve daha az silan kullanılır. Arabirim dış bükey ise, bu altı silanizasyon gösterir ve daha çok silan kullanılır.
       Not:. Diklorodimetilsilan yani daha az etkili silanizasyon silan aynı hacimde ile elde edilir, zamanla "kapalı" gitmek eğilimindedir. Bu noktada, ya yeni silan sipariş edilebilir veya eşdeğer miktarda silanizasyondan elde etmek için ayarlanır.
11. Sıcak plaka kapatın ve soğumasını bekleyin. Cam petri çıkarın ve kuruma tutar silika jel içeren depolama kavanoza pipetleri aktarmak. Dikkatle kırma ucu önlemek için (faydalı forseps) pipetleri taşıyınız.

5 "src =" / files / ftp_upload / 53144 / 53144fig5.jpg "/>

Şekil 5. Silanizing Pipetler. (A) pipet çektirmenin örneği. Sıcak plaka çekti pipetleri (B) Resim. Diklorodimetilsilan bir damla içeren cam tabak çekti pipetleri üzerinde ters olmuştur. (C) şematik İyonofor kokteyl ve dolgu çözeltisi arasındaki arayüzü gösteren. Düz arayüzü optimum silanizasyondan gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

6. Negatif Emme Cihazı hazırlanması

Not: Bu adımda, basit negatif emme cihazı hazırlanır (Şekil 6) belirli bir iyon elektrodu doldurmak için kullanılabilir olacaktır. Bu adım sadece bir kez yapılır.

1. Luer kilitli 3 yollu bir 3 ml şırınga takın. Atvana karşı ucu, döner yaka ve bekçi içeren, dikenli ucu dişi bir kilitleme diş birleştiricide vida. Daha sonra, bağlayıcı dikenli ucuna, silikon boru, 1/8 inç dış çaplı 1/16 inç iç çapa ekleyin. Daha sonra, 1/32 inç iç çap ve 3/32 inç dış çaplı plastik boru eklemek

Negatif emme cihazının bileşenlerinin Şekil 6. Negatif Emme Cihazı. Resim (luer kilitli 3 ml şırınga, dönen yaka ve bekçi, dikenli sonu ile dişi luer kilit bağlantısı, silikon tüp, plastik boru ile 3-yollu musluk) ve Nihai ürün. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Diseksiyon <7. toplayın Sinekler / p>

1. Sinek haçlar kurmak ve gerektiğinde değiştirmek üzere standart sinek hayvancılık teknikleri ²⁵ kullanın. Örneğin, artan GAL4 aktivitenin istendiği deneylerde sıcaklığı (örneğin, 28 ° C) daha fazla kullanılması.
   Not: sinekler aşırı kalabalık ortamlarda yetiştirilen olmadığı önemlidir; Erkek ve kadın ebeveynlerin numaraları bu durumda azaltılmalıdır. Farklı genotip kullanıldığında, erkek ve dişi ebeveynlerin numaraları döllerinin yaklaşık olarak benzer bir dizi elde etmek üzere ayarlanmalıdır.
2. Eclosion 2 gün - 1 içinde diseksiyon (adım 11) kullanarak standart sinek yetiştirme teknikleri ²⁵ sinekler toplayın. Kadın sinek kamışı daha kolay kesilip alınmıştır, ancak gerektiğinde veya arzu edildiği takdirde bir erkek sinek tübülleri de kullanılabilir. Yeri sinek gıda içeren bir şişenin içine uçuyor. Diseksiyon önce - 5 gün 3 için istenen sıcaklıkta şişeleri yerleştirin.

8. İyon belirli Elektrodun Dolum (İMKB)

e_content "> Not:.. Bu adımda, İMKB bir tuz çözeltisi ile geri doldurulur ve daha sonra iyonofor ucu sokulur iyi çalışıyor İMKB sürece günden güne yeniden kullanılabilir Bu nedenle, bu adım gerektiği gibi birkaç günde gerçekleştirdi.

1. Bir ^K + 'e özgü bir elektrot için, (deney için deneyden elde edilen yeniden kullanımı mikrofilamanlar) 1 ml şırınga ve mikrofilaman kullanılarak 0.5 M KCI ile bir silanize pipeti geri doldurulması. Ucu hiçbir hava - dolgu çözüm pipet çok uç doldurur emin olun. Emin değilseniz, bir bileşik mikroskop altında görselleştirmek. Yavaşça pipet hafifçe vurarak hava kabarcıklarını çıkarmak.
   1. Na ⁺ 'e özgü elektrot için, 150 mM NaCI ile geri doldurulması.
2. Kaput 6. adımda hazırlanan negatif emme cihazının plastik boru içine İMKB arka ucunu takın, yerine sabitlemek için modelleme kil parçası ile ters plastik 3.5 cm'lik petri üzerine İMKB'ye yerleştirin.
3. Negatif p üretmekEmme cihazı kullanarak basıncını kontrol edin. Yan ağzına doğru işaret musluk sap "off" ile geri şırınga çizin. 0,7 ml - ama değişir geri çekilmesi miktarı 0,6 aralığında genellikle. "Kapalı" tüp doğru bakacak şekilde Ardından musluk kolu çevirin.
4. (.: Toksik güvenli depolama ve taşıma talimatlar için Malzeme Veri Güvenlik Sayfası'na bakın DİKKAT) iyonofor çözeltisi içine 10 ul pipet ucu - uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak kaput ve 1 batırın. Pipet ucu büyük ağzına eldivenli parmak koyarak küçük bir damla sınırdışı. Ardından, İMKB ucu bozulmaması için pipet ucu ile İMKB ucu dokunmadan, İMKB ucuna iyonofor damla dokunun.
   1. "Olduğu gibi." Malzemeler Tablo l'de listelenen, potasyum iyonofor kullanarak sodyum iyonofor hazırlamak için,% 10 4-tert--butylcalix [4] aren-tetraasetik asit tetraethylester (ağırlık / ağırlık% olarak) bir çözeltisini yapmak, 890,75% nitrofenil oktil eter ve% 0.25 sodyum borat tetrafenil (DİKKAT:. Toksik güvenli depolama ve taşıma talimatlar için Malzeme Veri Güvenliği fişine bakınız). Folyo ile sarılmış bir cam şişede mağazası ışıktan korumak için.
5. Iyonofor İMKB ucu içine ve iyonofor / dolgu çözüm arayüzü (adım 5.10.1 ve Şekil 5C bakınız) düz olup olmadığını "alınmış" olup olmadığını belirlemek için bir bileşik mikroskop kullanılarak 40X büyütme altında İMKB'ye inceleyin.
   1. Herhangi bir iyonofor içine alınır ise, emme cihazı ile oluşturulan negatif basınç miktarını arttırır. Bu başarısız olursa, elektrod yetersiz silanize edilmiş olabilir. Diklorodimetilsilan daha büyük bir miktarda kullanarak 5. adımı yineleyin.
6. Kısmen 150 mM KCl ile dolu bir kabın duvarı üzerine, aşağı ucu, İMKB'ye yerleştirin. Beher yüzüne modelleme kil yerleştirerek İMKB'ye sabitleyin. Ucu 150 mM KCl içinde yatıyor. İMKB ov kullanmaya devam ediner birden fazla gün sürece iyi çalışıyor gibi (adım 10.6 bakınız).
   1. Bir Na ⁺ ISE için, 150 mM NaCI içinde elektrot saklayın.

9. Başvuru Elektrod hazırlayın

Not: 9,1 Adım - 9.3 önceden gerçekleştirilebilir. 9.4 Adımları - 9.6 her deneysel gün yapılmaktadır.

1. Alev lehçe güvenlik önlemleri kullanarak Kısık ateşte 10 filamented borosilikat cam kapiller tüplerin (dış çap 1.2 mm, iç çapı 0.69 mm, uzunluğu 10 cm), uçları.
2. 2 um - Bir pipet çektirmesi üzerine, ~ 1 bir ucu çapına pipetleri çekin.
3. Kullanılana kadar bir pipet depolama kavanozda saklayın pipetler. Pipetler süresiz olarak saklanabilir.
4. Deney gününde, bir mikrofilaman ve şırınga kullanılarak, 1 M sodyum asetat, pipet ucu ve şaft doldurun. Orada emin olun hiç hava kabarcığı olduğunu ve çözüm ucuna gider. Hava kabarcıkları varsa yavaşça pipet fiske.
5. Bir saniye kullanmamicrofilament ve şırınga, 3 M KCl ile pipet dolduramaz. Yine, hava kabarcıkları mevcut olmadığından emin olun.
6. 150 mM KCl içeren bir cam kapta saklayın referans elektrodu (adım 8.6 bakınız).

İMKB 10. Kalibrasyon

Not: Bu adım deney gününde üç defa yapılır: günün erken saatlerinde İMKB öncesi ve 20 ölçümlerinden sonra o çalışıyor ve emin olmak için - 25 salgılanan sıvı damla (Tablo 3).

1. 15 mM, 75 mM, 150 mM ve 200 mM Potasyum İMKB kalibrasyonu için, iki 0,6 ul (aşama 1 'de hazırlanan) silikon elastomer kaplı 3,5 cm'lik petri üzerine KCI yandaki dört konsantrasyonda her damla yerleştirin. Dikkatle damla üzerinde mineral yağ 2 ml katman.
   1. Sodyum ISE için, 15 mM ve 150 mM NaCI kalibrasyon damla kullanılır.
2. Faraday kafesi içinde stereomikroskopta sahneye kalibrasyon çanak yerleştirin ve aydınlatmak.
3. Threreklam İMKB ve referans gümüş teller üzerinde elektrot ve mikroelektrot sahipleri içine sıkın.
4. Mikromanipülatörler kullanarak, 15 mM KCI damla içine İMKB ve referans elektrotlar ilerlemek.
5. Modu "yürütmeyi" elektrometreyi geçin. Yerleşmek için okumaya izin verin.
6. Dizüstü Record okuma. 75 mM tekrarlayın, 150 mM ve 200 mM düşer. İMKB iyi çalışıyor olup olmadığını belirlemek için yamaç hesaplayın (13.1 ve Tablo 3 adım bakınız). Değilse, yeni İMKB'ye hazırlar.
   Not: İMKB de çalışmadığını İşaretler: bir okuma almak için başarısızlık; (birkaç saniye veya daha uzun) dengelenmesi yavaş; kararsız okuma; eğim ^{+ veya Na + konsantrasyonu 49 mV / decile değişimi.}
7. (Adım 8.6 açıklandığı gibi) aşama 11 (tübül diseksiyonlarının) ifası sırasında yani günün ilk kalibrasyon ve 12. adımda gerçekleştirilen ölçümlerde, arasında, 150 mM KCl İMKB ve referans elektrotlar saklayın.

11. Borucuk Diseksiyon

Not: Bu adım deney gününde yapılır.

1. Kısım üzerinden az miktarda - Standart banyo ortamı (SBM) (± 500 600 ul), deney günü kullanılmak üzere, aşama 4.2'de hazırlanan ve oda sıcaklığına ısınmaya bırakın. Bu durum, bilinen diseksiyonlara en az 30 dakika yapılması gereken, aynı zamanda daha önce yapılabilir. Ayrıca, RT Drosophila serum fizyolojik (adım 4.1) disseksiyonların başlayan mevcut önce en az 20 ml var.
2. Disseksiyonların başlamadan hemen önce: bir stereo mikroskop altında 10x büyütme deney çanağı görüntülemek 10 ve 30 ul arasında, tipik olarak yaklaşık deney tabağına her bir dolduracak kadar SBM ekleyin. Uyuşturucu veya peptid orta deneyi SBM eklenecek gidiyorsun, SBM tam hacminin bir not her bir ilave yapmak. Aşırı doldurma deney sırasında uzak yüzen tübül yol açabilir, bu da kuyusunu kaçının.
3. Dikkatle ~ 12 katmanı - üst mineral yağ 13 ml böylece kuyu biryeniden kaplı. Bu deney sırasında salgılanan sıvı damlaların buharlaşmasını önlemek olacaktır.
4. Yer CO ₂ pad üzerinde disseke uçar.
5. Yerine sinek sabitlemek için bir Minutien iğne ile toraks Impale 1. adımda hazırlanan silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak sırtını (ventral yüzü yukarı) bir forseps ve yeri ile bacak veya kanat üzerinden bir sineği Pick up.
6. Tuzlu su içinde sinek batırmak için RT Drosophila serum fizyolojik (adım 4.1) bir damla ekleyin.
7. İsteğe bağlı: kanatlarını ve bacaklarını klibi. Uygulamada, bu genellikle gerekli değildir.
8. Torakoabdominal kavşakta sineğin karın "tutmak" için dominant olmayan el forseps kullanın. Torakoabdominal kavşakta başlayan ve anında kuyruk sonuna doğru hareket, uzakta karın manikür soymak için dominant el forseps kullanabilir. Ekli Malpighi tüplerinin ile gut, bu manevra ile açık olmalıdır.
9. Tübüller dokunmadan, ücretsiz teşrih midgut /arka bağırsak ve ekli tübül. Hiçbir gözyaşı veya kiralar tübül içine esastır fly.It gelen bağırsak ve ücretsiz olarak tübülleri ayrılmakta, baskın olmayan elle forseps gut tutun ve bağırsak üreteri sever 30 G iğne kullanın üreter de başka.
   Not: tübüller ön çifti en kolay, ancak arka tübülleri de kullanılıyor olabilir, disseke edilir.
10. İnce cam çubuk (adım 2) kullanarak, tübül çifti pick up ve tahlil yemeğin kuyunun içine aktarın.
11. Tübül çifti kuyuya devredilmiştir hemen sonra, cam çubuk ile tübüller birinin sonunu pick up üreter kesme ucu pim ve banyo damla ve şal arasında yarım kadar banyo damla çekilme Cam çubuk kullanarak pim etrafında tübül sonu. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bu manevra sonunda, bir tübül banyo salin damla kalır ve üreter kesilmiş ucundan sıvı salgılar . Şekil 1'de "çapa tubule" etiketli başka borucuk, pim etrafına sarılır. Bu yerinde salgılayan borucuk, yağ ile çevrilidir çapa ve sıvı salgılar değildir.
12. Hemen adım 11.11 sonra bu sıvı tübül tarafından salgılanan edilecek başlayacak başlama zamanı (kuyu (örneğin, A, B, C), borucuk tanımlayan bilgiler (örn., Genotip veya durum), ve zaman yazmak deniz tuz damlacık).
13. Bir sonraki diseksiyon ile devam edin. , Tübüllerin bir çift incelemek banyo tuzlu aktarabilirsiniz ve pin etrafında çapa tubule sarmak için 4 dakika - deneyci bu tekniğin yetenekli sonra, tipik olarak 3 alır. Bu nedenle, 20-25 tübüller 1.5 saat içinde Ramsey deneyinde ayarlanabilir. Bir önceki tübül başlama saatinden sonra 4 dk - Her tübülün başlangıç ​​zamanı, bu nedenle yaklaşık 3 olacak.

12. Yapımı Ölçümleri

Not: Bu adım, deney gününde yapılır.

1. İMKB (adım 10), ilk ölçümden önce yaklaşık 20 dakika ayarlayın. Bu, gerekirse yeni bir İMKB'ye yapmak için zaman tanır.
   Not: İstenilen zamanda, salgılanması 2 saat sonra, örneğin, her bir tübül salgıladığı sıvı damla ölçümü için hazır hale gelir.
2. Ölçme zamanını kaydedin. Oküler mikrometre ve kayıt kullanılarak salgılanan sıvı damla çapını ölçün. Örneğin, 50X büyütme unutmayın.
3. Sıvı damla içine İMKB ve referans elektrot Advance. ". Işletmek" için elektrometreyi geçin okuma stabilize etmek için izin verin. Değerini kaydedin.
4. Bir sonraki damla için tekrarlayın.
5. Deneyin sonunda, kalibrasyon ölçümlerini (aşama 10) tekrarlayın.

13. Hesaplamalar

Not: Bu adım, deney gününün sonunda olarak gerçekleştirilebilir, ya da daha sonraki bir zamanda yapılabilir.

1. Ortalamasını hesaplayınpotasyum konsantrasyonunda eğim / decile değişimi. Bir örnek için Tablo 3'e bakınız.
   Not: sodyum için, değerler 15 mM ve 150 mM NaCI ölçümler arasındaki fark olacaktır.
2. 200 mM KCl (ya da 150 mM NaCl) iki ölçümün (önce ve sonra) ortalama değerini belirler.
3. Her damla hacmini hesaplayın. D adımında 12.2 oküler mikrometre ile ölçülen damlacık çapı V = πd ^3/6.
4. V adımda 13.3 belirlenen damlacık hacmi salgı oranı = V / saat (nL / dak / borucuk), hesaplayın ve zaman zaman tubule salgıladığı sıvı (= ölçüm süresi uzunluğu - çekme üreter zamanı ) banyo damlacık dışarı.
5. Salgılanan sıvının ölçülen potansiyeli arasındaki Δv (mV cinsinden) farkı = formül [K] = 10e (Δv / S) x 200 ya da [Na] = 10e (Δv / S) * 150, kullanılarak iyon konsantrasyonunu hesaplamak damla ve 200 mM kalibrasyon damla potansiyeli (fveya potasyum; Sodyum 150 mM damla). S adımda 13.1 belirlenen eğim =.
6. Iyon akı = [iyon] x sıvı salgılanması hızını hesaplayınız. Drosophila tübüller için, bu pmol / dak / tubule olacaktır.

14. Temizlik Up

Not: Bu adım deney günün sonunda yapılır.

1. Kuyuların kapsamlı temizlik artık tuz kristalleri gelecek deneylerde iyon konsantrasyonunu ve ozmolariteyi değiştirerek, kuyularda kalmaz emin olmak için gereklidir.
2. Mineral yağ tahliye bekleyin.
3. Tahlil yemeğin kuyu durulayın. A 200 ul pipetlemeyin ucu hafifçe kalan tuz kristali kazımak için kullanılır. Musluğa takılı plastik boru kullanarak, iyice her iyi durulama sıcak su yüksek basınçlı jet oluşturmak için boru sıkmak.
4. O / N kurumaya bırakın. Seçenek olarak ise, bir darbe kurutma kuyu kurumasına kullanılabilir.
5. Deiyonize H forseps durulayın _{2 O} vebirkaç saat 15 dakika boyunca etanol ile ıslatın.
6. Kalibrasyon çanak kapalı yağını boşaltın ve sıcak su ile yıkayın. Yanı sıra uzun iyice durulanır olarak sabun kullanın. Distile H ₂ O. ile son durulama yapınız
7. Distile H _{2 O} ile yıkayın mikrofilamentler ve şırıngalar

Sonuçlar

7 Şekil 8 genetik ve farmakolojik farklı K ⁺ ve Na ⁺ akıları, yalnız sıvı sekresyon oranları ölçülerek yakalanan değildir bilgileri ayırt edebilir ^K + ^Na + konsantrasyonlarını ölçmek için iyon spesifik elektrotlar ile Ramsay testinin bu kullanımını göstermek. Şekil Na ⁺ akımı (Şekil 7B) değişmez ise NKCC bir homozigot mütasyon taşıyan sinekler tübüllerdeki sıvı sekresyonunda azalma...

Tartışmalar

Birlikte iyon spesifik elektrotlar ile Ramsay testinin kullanımı, izole böcek Malpighi (böbrek) tübüllerde sıvı salgılanması oranları ve iyon akışlarının ölçülmesini sağlar. Yirmi ya da daha fazla nitro tübüller microperfused tübül bireyin tahlili ile karşılaştırıldığında daha yüksek verim sağlayarak bir zamanda analiz edilebilir. Buna ek olarak, belirli bir iyon elektrotlar ikinci düzeneğe sıvının küçük hacimlerde transferinde sokulabilir hataları sınırlayı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30 G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionophore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.