在体外产生的常见淋巴祖使用AC-6馈线系统的小鼠浆细胞样树突细胞

摘要

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

摘要

浆细胞样树突细胞（pDC细胞）是强有力的I型干扰素（IFN-I）的生产被响应于感染或在炎症反应的活化细胞。不幸的是，的pDC功能的研究是由它们的低频在淋巴器官受阻，并在体外直流代现有的方法主要有利于生产cDC上的过度的pDC。在这里，我们提出了一个独特的方法来有效地生成常见淋巴祖（的CLP） 在体外 pDC的。具体地，该协议描述细节如何从骨髓纯化的CLPs和通过用γ照射的AC-6饲养细胞在Flt3配体的存在下共培养产生的pDC。该培养系统的一个独特的特征是所述的CLPs迁移对AC-6细胞的下面，并成为鹅卵石区形成细胞，用于扩展的pDC的关键步骤。形态不同的DC，即的pDC和cDC上，产生后约2周为7的组合物最佳条件下0-90％的pDC。通常情况下，用这种方法产生的pDC的数目大约是100倍的CLPs播种的数目。因此，这是一种新的系统，用以有力产生大量以促进进一步的研究进入这些细胞的发育和功能所需的pDC的。

引言

树突细胞（DC）是专业抗原呈递细胞，在控制免疫反应¹起着重要的作用。而DC是异质的，它们大致可分为两个群体，常规的DC（cDC上）和浆树突（pDC细胞^）2,3-。除了 ​​淋巴器官，和cDC上的pDCs还发现在组织中，包括肺，肠，皮肤和^2。 cDC上和的pDC的形态不同，与cDC上呈现枝蔓状凸起和的pDCs更加浆细胞样的形状。此外，常见的小鼠DC标记，CD11c的，更高度表达于cDC上比上的pDC。此外，cDC上可进一步分成的CD11b ⁺ CD24 ^- cDC上和CD11b ^- CD24 ⁺ cDC上，这两者都表达MHC II类的更高水平和共刺激分子比的pDC ^2。成熟的pDCs，另一方面，已经显示出选择性表达的Siglec-H和BST2 ^4。 Functionally，cDC上有更好的抗原呈递细胞比是pDC的;然而，pDC细胞可以产生类型的大量的I型干扰素后，病毒感染或炎症刺激^5。

既cDC上和的pDCs是短暂的，因此，必须不断从骨髓（BM）的^6,7-内祖细胞补充。继转移的常见髓系祖细胞（中医）和公共淋巴祖细胞（的CLPs）到致死照射的小鼠表明cDC上和pDC细胞可以从两个谱系^8-10产生。然而，有表达RAG1 / 2和具有重新排列的DJ片段在IgH基因基因座^11,12的pDC的子集。这些细胞也与B淋巴细胞，包括B220标志物的表达，核酸感应受体（TLR7 / TLR9），和转录因子（SPIB和^BCL11A）13共享分子的相似性，提供所有认为是淋巴谱系的签名。因此，电S可以是用于体外代因为谱系相似的pDC的很好的选择。

同时兼具cDC上和的pDC在人类和小鼠的频率很低^6，DCS，尤其cDC上， 可以在细胞因子，如GM-CSF或^11,14 Flt3配体的存在下，从BM或祖细胞体外生成（佛罗里达州）采用无饲养系统^11,15,16。然而不幸的是，它是不可能产生大量使用FL ^11,15,16 体外的pDC的。先前我们表明pDC细胞可以有效地在体外从使用AC-6馈线系统¹⁷的CLPs生成。使用AC-6基质细胞系在培养系统的优点是，它提供了细胞 - 细胞接触和支持大量的pDC的产生从体CLPs细胞因子的分泌。虽然生产该系统是相当强劲，手续如下所述小心复制需要我n阶确保有效产生的pDC的。

研究方案

C57BL / 6野生型小鼠购自国家实验动物中心（NLAC），台湾购买。所有小鼠饲养，并保持无特定病原体的条件下。协议和动物使用的程序进行审查和批准国家医学台湾大学的机构动物护理和使用委员会（许可证号:20120075）。另外，研究人员尽一切努力，以减少疼痛，痛苦，还是痛苦的潜力，而动物进行实验。描述的所有步骤均在室温戴手套。

1.制备AC-6饲养细胞的

注意:所述的交流6.21（AC-6在短）基质细胞系^18（由一威斯曼，斯坦福大学提供）应维持在RPMI补充有15％热灭活的小牛血清（FBS）。作为饲养细胞，AC-6细胞是γ-照射3000拉德（30GY）之一天共培养，以防止其扩散之前。注日在AC-6细胞往往会失去其分化配套能力强，如果在维护期间离开人满为患，或者如果他们通过人数超过20。

1. 洗的AC-6细胞一次用1ml的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）并且通过抽吸去除的DPBS。治疗的AC-6细胞用0.8mL胰蛋白酶溶液（0.05％胰蛋白酶和0.5mM EDTA的在DPBS）3-5分钟，在^37℃，5％的CO _2，然后停止反应通过将其与10体积培养基稀释至使单细胞悬液。
2. 种子AC-6细胞以5.9x10 ^4个细胞 /孔的12孔板^{，37℃，5％}的CO _{2 O} / N。
   注意:AC-6细胞的密度是作为一个较低的密度将倾向于CDC代非常重要的。播种在5.9x10的密度^4细胞/孔将允许AC-6的第二天，这是最适合于从体CLPs的pDC的推导到达汇合。
3. 照射AC-6细胞用γ-辐照3000 RAD（30戈瑞）。
   注意:用于照射交流-6的剂量优化，以防止细胞增殖，但保持它们存活足够长的时间，以提供所需的CLPs从分化的DC的细胞因子和细胞 - 细胞接触。
4. 抽吸培养基并添加1毫升的完全RPMI（RPMI 10％热灭活FBS，50μg/ ml的庆大霉素和50μM的β巯基乙醇）。

从2小鼠分离骨髓细胞

1. 牺牲小鼠CO ₂窒息和颈椎脱位。将小鼠解剖托盘和消毒用70％的乙醇。做一个切口在中间腹部和从鼠标包括皮肤覆盖下肢的末端部分去除皮肤。
2. 在半无菌罩解剖小鼠。为了释放股骨和胫骨，夹上面的股骨和胫骨下面膝关节。分离使用剪刀骨骼肌肉，然后将骨头含5毫升完全RPMI一个6cm培养皿中。
3. 移到一个无菌的培养罩。填写3毫升注射器连接到27G针完全RPMI。切断用剪刀骨头的两端，然后将27G针头从两端轻轻注射完全RPMI一次冲洗出骨髓的骨头。
4. 制备单细胞悬浮液通过温和移液细胞上下3-5倍于使用注射器没有针头培养皿。
5. 离心细胞5分钟，在500×g离心并弃去上清液。
6. 裂解红血细胞与1ml ACK缓冲液（150mM的_氯化铵 ，10毫KHCO _3，0.1mM的EDTA）中培养1分钟，并通过用10体积的完全RPMI中稀释终止反应。允许细胞放置5分钟，以便通过重力沉淀下来死细胞团块和组织碎片。
   注意:不要站在超过5分钟，因为这会导致细胞损失，由于沉降活细胞。
7. 慢慢倾析含细胞的上清液至新管离去碎片后面在原管。
8. 离心5分钟500 XG沉淀细胞，然后捞出弃去上清液。
9. 重悬总BM细胞（通常为^4-6×10 7个骨髓细胞从一只小鼠获得）在100μlFACS缓冲液（1×PBS + 2％FBS + 1mM的EDTA）中。

3.流式细胞仪分析的CLP的排序

1. 1-2分钟，以阻断Fc受体添加的抗CD16 / 32（杂交瘤上清克隆2.4G2，50微升/反应或1-2微克/反应）进细胞在FACS缓冲液（步骤2.9）。
   注意:抗CD16 / 32也被称为Fc的块，这是添加到防止抗体的非特异性结合到表达的Fc受体，包括粒细胞，单核细胞，淋巴细胞和B淋巴细胞。
2. 同时染色细胞用下面的荧光染料标记的抗体（为4×10 ⁷个细胞）在冰上15分钟，以避免环境光线。抗体:PE-缀合谱系标记物（各0.2微克），包括抗CD3（17A2），抗CD8（53-6.7），抗B220（RA3-6B2），抗CD19（eBio1D3），抗CD11b（M1 / 70），抗Gr-1（RB6-8C5），抗Thy1.1的（HIS51）的抗NK1.1（PK136），抗TER119（TER-119）和抗MHC-II（NIMR-4），0.2微克的抗c-Kit的-PerCP-经Cy5.5 （2B8），1微克的抗Sca-1-FITC（D7），0.4微克抗M-CSFR-APC（AFS98）和0.2微克的抗IL-7Rα-PE-Cy7的（A7R34）。
3. 5分钟，在500×g下洗涤细胞用3ml FACS缓冲液，并离心。
4. 悬浮细胞在300微升FACS通过一个40微米的细胞过滤缓冲和过滤单元。
5. 与另外的100微升FACS缓冲液洗管以回收任何剩余的细胞，并过滤到无菌的FACS使用相同的细胞过滤排序管。
6. 立即用适当的过滤器和电压信号检测染色后进行流式细胞仪分析。使用488纳米的激光来检测FITC-，PerCP-Cy5.5标记抗体，561纳米的激光来检测PE-和PE-Cy7的-labelded抗体和633纳米拉斯呃检测APC标记的抗体。
7. 理出根据下列标志物的CLPs林^-使用细胞分选仪的^IL-7Rα+（如在染色步骤3.2） ^-的c-kit ^INT的Sca-1 ^INT ​​的M-CSFR。收集分选的细胞在一个15毫升管装有8毫升完全RPMI作为缓冲。
8. 记录分选的细胞的绝对数量为在运行的端部所示的细胞分选仪。典型地，5×10 ⁴的CLPs可以从一个鼠标对BM而获得。

4.共培养的CLPs和AC-6

1. 离心分选的细胞从步骤3.7 10分钟，在500×g离心，除去上清液和重悬细胞沉淀用足够的完全RPMI来获得周围5×10 ⁴细胞/ ml的细胞密度。种子500个细胞/孔进12孔平板含有在步骤1.4制备的饲养细胞。
2. 添加100毫微克/毫升FL ^{19（HU-FLT3L-Ig}的内部产生的使用由M.曼茨，Universi提供了一种表达系统TY医院苏黎世，瑞士^{），37℃，5％CO} ₂显微镜下定期可视化监控DC的发展。
   注:市售的重组人FL或鼠标FL可以用作替代HU-FLT3L-Ig的支持直流发展。
3. 收集细胞上清液中的第12天，并用0.5一次洗井ml完全RPMI培养基中组合所得到的上清液。添加0.5 ml的新鲜培养基和报废贴壁细胞用细胞刮刀。
4. 组合来自两个部件的含细胞的培养基，离心5分钟，在500×g。
5. 倒出上清，重悬细胞于50μlFACS缓冲液中。加入50微升的抗CD16 / 32杂交瘤上清液孵育1-2分钟，以阻断Fc受体。
6. 枚举和染色的所有细胞与下列抗体（每0.05微克）抗CD11c-APC（N418），抗CD11b-FITC，并且抗B220-PE。
7. 洗净离心机的细胞描述d。在步3.3。
8. 悬浮细胞在100微升FACS缓冲液，门上的CD11c ⁺和分析cDC上（表面CD11c ⁺细胞CD11b ⁺ B220 ^{- ）}和的pDCs（表面CD11c ⁺细胞CD11b ^- B220 ^+）17。

结果

共有4-6x10 ⁷骨髓细胞通常是孤立于股骨和一个6-8周龄，野生型C57BL / 6小鼠胫骨。到的CLPs梳理，总骨髓细胞用针对谱系标记物（CD3，CD8，B220，CD19，CD11b的，GR-1，​​Thy1.1的，NK1.1，TER119，和MHC-II）中，抗PE结合抗体-c-Kit的-PerCP /经Cy5.5，的抗Sca-1-FITC，抗M-CSFR-APC和抗IL-7Rα-PE / Cy7的，分析和分类用细胞分选仪。排序策略CLP 示于图1，典型地，5×10 ⁴的CLPs从一个C57...

讨论

这里，我们描述的体外培养体系为鲁棒生成的DC，和pDC细胞特别是从少数的CLPs的。该培养体系的独特性是由于使用AC-6细胞，基质细胞系，如送料器。这种方法已被证明提供的不仅是细胞因子，如IL-7，SCF，M-CSF和FL ^20，而且在细胞-细胞接触²¹必要支持直流发展。 AC-6细胞已被先前用于促进体外直流发展的研究从多个祖细胞^8,16,22。我们发现，这是至关重要的种子?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5	Biolegend	108408	linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136	Biolegend	108708	linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70	Biolegend	101208	linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3	Biolegend	115508	linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2	Biolegend	103208	linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2	Biolegend	100308	linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7	Biolegend	100707	linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4	Biolegend	107608	linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119	Biolegend	116208	linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51	eBioscience	12-0900-83	linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98	Biolegend	135510	FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8	Biolegend	105824	FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7	Biolegend	108106	FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34	Biolegend	135014	FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418	Biolegend	117328	FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70	Biolegend	101206	FACS
FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
FACS sorting tube	BD Biosciences	352054
FlowJo	FlowJo LLC		Flow analysis sofrware