In Vitro génération de cellules dendritiques plasmacytoïdes murin de Common lymphoïde progéniteurs utilisant le système de chargeur AC-6

Résumé

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

Résumé

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont de type I puissant interféron (IFN-I) des cellules productrices qui sont activés en réponse à une infection ou au cours des réactions inflammatoires. Malheureusement, l'étude de la fonction PDC est entravé par leur faible fréquence dans les organes lymphoïdes et les méthodes existantes pour vitro génération DC favorise principalement la production des CDC sur les pDC. Ici, nous présentons une approche unique pour générer efficacement des pDC de progéniteurs lymphoïdes communs (cLPS) in vitro. Plus précisément, le protocole décrit les détails comment purifier CLPs de la moelle osseuse et de générer des pDC par co-culture avec AC-6 cellules nourricières gamma-irradiées en présence de ligand Flt3. Une caractéristique unique de ce système de culture est que les PLC migrent au-dessous des cellules AC-6 et deviennent des cellules de la zone formant pavées, une étape cruciale pour l'expansion pDC. PED morphologiquement distinctes, à savoir PDC et les CDC, ont été générés après environ deux semaines avec une composition de 70-90% pDC dans des conditions optimales. En règle générale, le nombre de pDC générés par ce procédé est d'environ 100 fois du nombre de têtes de série PLC. Par conséquent, cela est un nouveau système avec lequel pour générer vigoureusement le grand nombre de pDC nécessaires pour faciliter d'autres études sur le développement et la fonction de ces cellules.

Introduction

Les cellules dendritiques (CD) sont des cellules présentatrices d'antigène professionnelles qui jouent un rôle important dans le contrôle des réponses immunitaires ^1. Alors que les PED sont hétérogènes, ils peuvent être classés en deux populations, les CD classique (CDCS) et DCS plasmacytoïdes (pDC) ^2,3. En plus des organes lymphoïdes, CDCS et pDC sont également présents dans les tissus y compris les poumons, l'intestin et de la peau ^2. La morphologie du CDCS et pDCs diffère, avec CDCS présentant projections de dendrites-like et la forme des PDC comme étant des cellules plus de plasma. En outre, le marqueur DC de la souris commune, CD11c, est plus fortement exprimé sur CDCS que sur les pDC. En outre, CDC peut encore être divisé en CD11b ⁺ CD24 ^- CDCS et CD11b ^- CD24 ⁺ CDCS, qui expriment toutes deux des niveaux plus élevés de CMH de classe II et molécules costimulatrices que font pDCs ^2. PDCs matures, d'autre part il a été démontré, pour exprimer sélectivement Siglec-H et BST2 ^4. Functionally, CDCS sont meilleures cellules présentatrices d'antigène que sont pDCs; Toutefois, pDCs peuvent produire une grande quantité d'interféron de type I lors de l'infection par le virus ou la stimulation inflammatoire ^5.

Les deux CDCS et pDC sont de courte durée, et par conséquent, doivent être constamment reconstituées à partir de progéniteurs dans la moelle osseuse (BM) ^6,7. Le transfert adoptif de progéniteurs myéloïdes communs (CMPS) et les progéniteurs lymphoïdes communs (cLPS) dans des souris mortellement irradié démontre que CDCS et pDCs peuvent être générés à partir de deux lignées ^8-10. Cependant, il existe un sous-ensemble de pDC qui expriment RAG1 / 2 et possédant des segments réarrangés DJ au locus IgH ^11,12. Ces cellules partagent aussi des similitudes moléculaires avec des lymphocytes B, y compris l'expression du marqueur de B220, récepteurs de l'acide détection nucléiques (TLR7 / TLR9), et les facteurs de transcription (SPIB et BCL11A) ^13, dispose de tous croit être les signatures de la lignée lymphoïde. Par conséquent, CLPs peut être un bon choix pour la production in vitro de la lignée de pDC parce similitude.

Bien que la fréquence des deux CDCS et pDC chez les humains et les souris est très faible ^6, les DC, en particulier CDCS, peut être produite in vitro à partir de progéniteurs BM ou en présence de cytokines, telles que GM-CSF ou le ligand Flt3 ^11,14 (FL ) en utilisant des systèmes sans cellules nourricières ^11,15,16. Malheureusement, il est impossible de produire un grand nombre de pDC in vitro utilisant FL ^11,15,16. Auparavant, nous avons démontré que les pDC peuvent être générées de manière efficace in vitro de PLC au moyen du système d'alimentation ^AC-17 6. L'avantage d'utiliser la lignée cellulaire stromale AC-6 dans le système de culture est que cela permet un contact cellule-cellule et sécrétion de cytokines qui favorisent la production d'un grand nombre de pDC à partir de PLC. Bien que la production de ce système est très robuste, la réplication attentif des procédures décrites ci-dessous est nécessaire in Afin d'assurer la production efficace des PDC.

Protocole

/ 6 souris de type sauvage C57BL ont été achetées au Laboratoire national Animal Center (NLAC), Taiwan. Toutes les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques. Protocoles et des procédures d'utilisation des animaux ont été examinés et approuvés par le soin et l'utilisation des animaux dans les institutions Comité National Taiwan University College of Medicine (Numéro de permis: 20120075). En outre, les chercheurs ont fait tous les efforts pour réduire le potentiel de la douleur, de la souffrance ou de la détresse chez les animaux tout en effectuant des expériences. Toutes les procédures décrites ont été effectuées à la température ambiante, tout en portant des gants.

1. Préparation de l'AC-6 cellules nourricières

Remarque: L'AC-6.21 (AC-6 en court) ligne de cellules stromales ¹⁸ (fourni par I. Weissman, l'Université de Stanford) doit être maintenue dans un milieu RPMI complété avec du sérum fœtal bovin inactivé à la chaleur 15% (FBS). Pour servir de cellules nourricières, AC-6 cellules sont γ-irradié avec 3000 rad (30 Gy) un jour avant la co-culture pour empêcher leur prolifération. Remarque èmeAC-6 cellules ont tendance à perdre leur capacité de différenciation de soutien si surpeuplé gauche lors de l'entretien, ou si leur numéro de passage est de plus de 20.

1. Laver AC-6 cellules une fois avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) et retirer DPBS par aspiration. Traiter AC-6 cellules avec 0,8 ml de solution de trypsine (0,05% de trypsine et 0,5 mM d'EDTA dans du DPBS) pour 3-5 minutes à 37 ^{° C,} 5% de CO _2, puis arrêter la réaction par dilution avec 10 volumes de milieu de culture à faire suspension cellulaire unique.
2. Semences AC-6 dans des cellules 5.9x10 ^{4 cellules} / puits dans des plaques à 12 puits et incuber à 37 ^{° C,} 5% CO ₂ H / N.
   Note: La densité de l'AC-6 cellules est très important car une densité inférieure favorisera génération CDC. Ensemencement à une densité de 5.9x10 ⁴ cellules / puits permettront AC-6 pour atteindre la confluence le lendemain, ce qui est optimal pour la dérivation des PDC du CLP.
3. Irradier AC-6 cellules à 3000 rad (30 Gy) en utilisant γ-irradiation.
   Note: La dose utilisée pour irradier AC-6 est optimisé pour empêcher les cellules de proliférer et de les garder viable assez longtemps pour fournir les cytokines et contact cellule-cellule nécessaire à la différenciation des PED de CLPs encore.
4. Aspirer le milieu et le remplacer avec 1 ml de RPMI complet (RPMI avec 10% de FBS inactivé à la chaleur, 50 pg / ml de gentamycine et 50 uM de β-mercaptoéthanol).

2. Isolat de cellules BM de souris

1. Sacrifiez souris par _asphyxie au CO2 et dislocation cervicale. Placez les souris sur une plaque de dissection et stériliser avec 70% d'éthanol. Faire une incision au milieu de l'abdomen et enlevez la peau de la partie distale de la souris, y compris la peau qui recouvre les extrémités inférieures.
2. Disséquer les souris dans une hotte semi-stérile. Pour libérer le fémur et le tibia, le fémur le clip ci-dessus et ci-dessous tibias l'articulation du genou. Détachez les muscles des os à l'aide de ciseaux et placer les os dans une boîte de Pétri de 6 cm contenant 5 ml RPMI complet.
3. Déplacer vers une hotte de culture stérile. Remplir une seringue de 3 ml relié à une aiguille 27G avec RPMI complet. Coupez les deux extrémités des os à l'aide de ciseaux, et insérer l'aiguille de 27G pour rincer la moelle des os en injectant doucement RPMI complet une fois à chaque extrémité.
4. Préparer une suspension cellulaire unique par pipetage doux les cellules de haut en bas 3-5 fois dans la boîte de culture en utilisant la seringue sans aiguille.
5. Centrifuger les cellules pendant 5 minutes à 500 xg et décanter le surnageant.
6. Lyse des globules rouges avec une ml de tampon ACK (150 mM de _NH 4 Cl, 10 mM de _KHCO3, EDTA 0,1 mM) l'incubation pendant 1 min et arrêt de la réaction par dilution avec 10 volumes de milieu RPMI complet. Laisser les cellules reposer pendant 5 min pour sédimenter bas amas de cellules mortes et les débris de tissu par gravité.
   Note: Ne pas se tenir plus de 5 minutes que cela se traduira par la perte de cellules due à régler de cellules viables.
7. Lentement décantation surnageant contenant les cellules à un nouveau tube de débris laissantderrière dans le tube d'origine.
8. Centrifuger pendant 5 min à 500 g pour sédimenter les cellules, puis retirer et jeter le surnageant.
9. Reprendre cellules totales BM (typiquement 4-6 x 10 ⁷ BM cellules sont obtenues à partir d'une souris) dans 100 pi de tampon FACS (1x PBS + 2% de FBS + EDTA 1 mM).

3. Analyse FACS et le tri des PLC

1. Ajouter anti-CD16 / 32 (clone hybridome 2.4G2 supernant, 50 ul / réaction ou 2.1 ug / réaction) dans des cellules dans un tampon FACS (étape 2.9) pendant 1-2 min afin de bloquer les récepteurs Fc.
   Remarque: anti-CD16 / 32 est également appelé bloc Fc, qui est ajouté pour empêcher une liaison non spécifique d'anticorps à des cellules exprimant des récepteurs Fc, y compris les granulocytes, les monocytes et les lymphocytes B.
2. Cellules simultanément tacher avec les anticorps fluorescents suivants marqués par un colorant (pour 4x10 ⁷ cellules) pendant 15 min sur la glace, en évitant la lumière ambiante. Anticorps: marqueurs de la lignée PE-conjugués (0,2 ug chacun) y compris anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53 à 6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-Ter119 (TER-119) et anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 ug anti-c-Kit PerCP-Cy5.5- (2B8), 1 ug anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 ug anti-de M-CSFR-APC (AFS98), et 0,2 ug anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
3. Laver les cellules avec 3 ml de tampon FACS, et centrifuger pendant 5 min à 500 x g.
4. Remettre les cellules dans 300 pi de tampon FACS et les cellules de filtre à travers un tamis cellulaire de 40 pm.
5. Laver le tube avec un tampon supplémentaire de 100 pi FACS pour récupérer toutes les cellules restantes et filtrer dans un FACS stériles tri tube en utilisant le même tamis cellulaire.
6. Effectuer une analyse de cytométrie de flux immédiatement après la coloration en utilisant des filtres et des tensions appropriées pour la détection du signal. Utilisez 488 nm laser pour détecter les anticorps FITC, PerCP-Cy5.5 marqués, 561 nm laser pour détecter la PE- et des anticorps PE-Cy7-labelded et 633 nm lasER pour détecter l'anticorps marqué APC.
7. Trier PLC en fonction des marqueurs suivants lin c-kit ^- Sca-1 ^{int int} M-CSFR IL-7Rα ^{- +} (comme dans l'étape 3.2 tachée) en utilisant un trieur de cellules. Recueillir les cellules triées dans un tube de 15 ml contenant 8 ml de RPMI complet comme un coussin.
8. Notez le nombre absolu de cellules triées comme indiqué par le trieur de cellules à la fin de la course. Typiquement, 5x10 ⁴ PLC peuvent être obtenus à partir de la BM de souris une.

4. coculture CLP et AC-6

1. Centrifuger les cellules triées de l'étape 3.7 pendant 10 min à 500 g, éliminer le surnageant et remettre le culot cellulaire avec assez de RPMI complet pour obtenir une densité cellulaire d'environ 5x10 ⁴ cellules / ml. Seed 500 cellules / puits dans la plaque de 12 puits contenant des cellules nourricières préparés à l'étape 1.4.
2. Ajouter 100 ng / ml FL ¹⁹ (hu-Flt3L-Ig généré en interne en utilisant un système d'expression fournie par M. Manz, UniversiHôpital ty Zürich, Suisse) et incuber à 37 ^{° C,} 5% de CO ₂ avec un contrôle visuel périodique de développement continu sous un microscope.
   Remarque: disponible dans le commerce FL humaine recombinante ou la souris FL peuvent être utilisés comme un substitut pour hu-Flt3L-Ig pour soutenir le développement continu.
3. Recueillir les cellules dans le surnageant à 12 jours et laver les puits une fois avec 0,5 ml de milieu RPMI compléter combinant les surnageants résultants. Ajouter 0,5 ml de milieu frais et débris les cellules adhérentes avec un racleur de cellules.
4. Moissonneuse le milieu contenant les cellules à partir des deux parties et centrifuger pendant 5 min à 500 x g.
5. Cellules surnageant et remettre Décanter dans un tampon FACS de 50 pi. Ajouter 50 ul anti-CD16 / 32 surnageant d'hybridome et incuber pendant 1-2 min pour bloquer les récepteurs Fc.
6. Énumérer et colorer toutes les cellules avec les anticorps suivants (0,05 ug chacun) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b FITC-et anti-B220-PE.
7. Lavez et centrifuger les cellules que décrired à l'étape 3.3.
8. Reprendre les cellules dans 100 pi de tampon FACS, porte sur CD11c ⁺ et d'analyser pour CDCS (CD11c ⁺ CD11b ⁺ B220 ^-) et pDC (CD11c ⁺ CD11b ^- B220 ^{+) 17.}

Résultats

Un total de ⁷ 4-6x10 cellules BM sont généralement isolé de fémurs et tibias d'un 6-8 sem-vieux, de type sauvage C57BL / 6 souris. Pour trier CLP, cellules totales BM sont colorées avec des anticorps PE-conjugué contre des marqueurs de la lignée (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, GR-1, Thy1.1, NK1.1, Ter119, et CMH-II), Anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-de M-CSFR et APC-anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analysées et triées avec un trieur de cellules. La stratégie de tri pour CLP est représenté ...

Discussion

Ici, nous décrivons un système in vitro en culture pour la génération robuste des pays en développement, et en particulier les pDC, à partir d'un petit nombre de CLP. Le caractère unique de ce système de culture est due à l'utilisation de l'AC-6, les cellules d'une lignée cellulaire stromale, en tant que dispositifs d'alimentation. Cette approche a été montré pour fournir non seulement les cytokines, telles que IL-7, SCF, M-CSF et FL ^20, mais aussi le contact...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5	Biolegend	108408	linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136	Biolegend	108708	linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70	Biolegend	101208	linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3	Biolegend	115508	linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2	Biolegend	103208	linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2	Biolegend	100308	linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7	Biolegend	100707	linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4	Biolegend	107608	linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119	Biolegend	116208	linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51	eBioscience	12-0900-83	linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98	Biolegend	135510	FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8	Biolegend	105824	FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7	Biolegend	108106	FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34	Biolegend	135014	FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418	Biolegend	117328	FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70	Biolegend	101206	FACS
FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
FACS sorting tube	BD Biosciences	352054
FlowJo	FlowJo LLC		Flow analysis sofrware