In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

Zusammenfassung

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

Zusammenfassung

Plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) sind starke Typ I Interferon (IFN-I) Herstellung von Zellen, die in Reaktion auf eine Infektion oder bei entzündlichen Reaktionen aktiviert werden. Leider wird Studium der PDC-Funktion durch ihre niedrigen Frequenz in lymphatischen Organen behindert, und die bestehenden Verfahren zur in-vitro-DC Generation überwiegend zugunsten der Produktion von cDCs über pDCs. Hier präsentieren wir einen einzigartigen Ansatz, um effizient zu erzeugen pDCs von gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen (CLP) in vitro. Speziell beschriebene Protokolldetails, wie CLPs aus dem Knochenmark zu reinigen und zu erzeugen pDCs kokultiviert mit γ-bestrahlten AC-6-Feeder-Zellen in Gegenwart von Flt3-Liganden. Ein einzigartiges Merkmal dieses Kultursystems ist, dass die CLPs wandern unter den AC-6-Zellen und werden gepflasterten Fläche bildenden Zellen, ein kritischer Schritt zur Erweiterung pDCs. Morphologisch DCs, nämlich pDCs und cDCs wurden mit einer Zusammensetzung aus 7 erzeugte nach ca. 2 Wochen0-90% pDCs unter optimalen Bedingungen. Typischerweise ist die Anzahl der pDCs durch dieses Verfahren erzeugte etwa 100-fachen der Anzahl der CLPs ausgesät. Daher ist dies ein neuartiges System, das eine robuste erzeugen die eine große Zahl von pDCs erforderlich, weitere Untersuchungen über die Entwicklung und Funktion der Zellen zu erleichtern.

Einleitung

Dendritische Zellen (DCs) sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die bei der Kontrolle der Immunantwort ¹ eine wichtige Rolle spielen. Während DCs sind heterogen, sie können grob in zwei Populationen klassifiziert werden, herkömmliche DCs (cDCs) und plasmazytoiden DCs (pDCs) ^2,3. Zusätzlich zu lymphoiden Organen, sind cDCs und pDCs auch in Geweben, einschließlich Lunge, Darm, Haut und ² gefunden. Die Morphologie cDCs und pDCs unterscheidet, mit cDCs aufweist Dendriten artigen Vorsprünge und die Form pDCs wobei mehrere Plasmazellenartigen. Darüber hinaus wird der gemeinsame Maus DC Marker, CD11c, stärker auf als auf pDCs cDCs ausgedrückt. CDCs und CD11b ^{- -} CD24 ⁺ cDCs, die beide exprimieren höhere Niveaus von MHC-Klasse II und kostimulatorische Moleküle als dies pDCs ² kann darüber hinaus weiter in cDCs CD11b ⁺ CD24 teilen. Reife pDCs, andererseits hat sich gezeigt, selektiv auszudrücken Siglec-H und BST2 ^4. Functionally sind cDCs besser Antigen-präsentierenden Zellen sind als pDCs; jedoch können pDCs eine große Menge an Typ I Interferon bei der Virusinfektion oder entzündlichen Stimulation ⁵ zu produzieren.

Beide cDCs und pDCs sind kurzlebig und müssen deshalb ständig von Vorläufern im Knochenmark ^(BM) 6,7 nachgefüllt werden. Adoptiven Transfer von gemeinsamen myeloischer Stammzellen (CMPs) und gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen (CLP) in letal bestrahlten Mäusen zeigt, dass cDCs und pDCs kann von beiden Abstammungslinien ^8-10 erzeugt werden. Jedoch gibt es eine Untergruppe von pDCs die RAG1 / 2 ausdrücken und besitzen umge DJ Abschnitte der IgH-Locus ^11,12. Diese Zellen teilen auch molekulare Ähnlichkeit mit B-Lymphozyten, einschließlich Ausdruck der B220 Marker, Nukleinsäure-Sensing-Rezeptoren (TLR7 / TLR9) und Transkriptionsfaktoren (SPIB und BCL11A) ^13, verfügt über alle geglaubt, um Unterschriften der lymphoiden Linie zu sein. Daher CLPs kann eine gute Wahl für in-vitro-Erzeugung von pDCs wegen der Abstammung Ähnlichkeit zu sein.

Während die Frequenz der beiden cDCs und pDCs bei Mäusen und Menschen ist sehr gering ⁶ DCs, insbesondere cDCs kann in vitro aus BM oder Vorläuferzellen in der Gegenwart von Cytokinen, wie GM-CSF ^11,14 oder Flt3-Liganden erzeugt werden (FL ) unter Verwendung von Feederfreie Systeme ^11,15,16. Leider ist es jedoch nicht möglich, eine große Anzahl von pDCs in vitro unter Verwendung von FL ^11,15,16 herzustellen. Bisher haben wir gezeigt, dass pDCs effizient in vitro aus CLP mit der AC-6 Speisesystem ¹⁷ erzeugt werden. Der Vorteil der Verwendung der AC-6 Stromazelllinie im Kultursystem ist, dass er Zell-Zell-Kontakt und die Sekretion von Cytokinen, die die Erzeugung einer großen Zahl von pDCs von CLPs Unterstützung bietet. Obwohl die Produktion mit diesem System ist sehr robust, ist eine sorgfältige Replikation der Verfahren unten beschrieben erforderlich in, um eine effiziente Erzeugung von pDCs gewährleisten.

Protokoll

C57BL / 6-Wildtyp-Mäuse wurden von der National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan gekauft. Alle Mäuse wurden gezüchtet und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Protokolle und Tiernutzung Verfahren wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der National Taiwan University College of Medicine (Permit-Nummer: 20120075) zugelassen. Darüber hinaus machte die Forscher alles tun, um das Potenzial für die Schmerzen, Leiden oder Angst bei den Tieren zu reduzieren, während die Durchführung von Experimenten. Alle beschriebenen Verfahren wurden bei RT mit Handschuhen.

1. Herstellung von AC-6 Feeder-Zellen

Hinweis: Die AC-6.21 (AC-6 in kurzen) Stromazelllinie ¹⁸ (von I. Weissman, der Stanford University zur Verfügung gestellt) sollten in RPMI aufrechterhalten werden, ergänzt mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS). Als Feeder-Zellen dienen, sind AC-6-Zellen γ-bestrahlt mit 3000 rad (30Gy) einen Tag vor der Co-Kultur, um ihre Verbreitung zu verhindern. Hinweis thbei AC-6 Zellen neigen dazu, ihre Differenzierung unterstützende Fähigkeit zu verlieren, wenn bei der Wartung überfüllten verlassen, oder wenn ihre Durchgang Nummer ist über 20.

1. Wasch AC-6 Zellen einmal mit 1 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) gewaschen und durch Absaugen zu entfernen DPBS. Behandlung von AC-6-Zellen mit 0,8 ml Trypsinlösung (0,05% Trypsin und 0,5 mM EDTA in DPBS) für 3-5 Minuten bei ³⁷ ° C, 5% CO _{2 und} stoppt dann die Reaktion durch mit 10 Volumina Kulturmedium zu verdünnen machen Einzelzellsuspension.
2. Samen AC-6-Zellen bei 5.9x10 ⁴ Zellen / Well in 12-Well-Platten und Inkubieren bei ³⁷ ° C, 5% CO _{& sub2; O} / N.
   Anmerkung: Die Dichte des AC-6-Zellen ist sehr wichtig, da eine geringere Dichte wird cDC- Erzeugung begünstigen. Aussaat mit einer Dichte von 5.9x10 ^{4 Zellen} / Vertiefung ermöglicht AC-6 bis zur Konfluenz am nächsten Tag, die optimal für die Ableitung pDCs von CLPs ist zu erreichen.
3. Bestrahlen AC-6-Zellen mit 3000 rad (30 Gy) unter Verwendung von γ-Bestrahlungsvorrichtung.
   Notiz: Das zur AC-6 bestrahlen Dosis ist optimiert, um die Zellen aus proliferierenden zu verhindern und dennoch tragfähig zu halten sie lange genug, um die für die Differenzierung der DCs von CLPs erforderlich Zytokine und Zell-Zell-Kontakt.
4. Saugen Sie Medium und ersetzen mit 1 ml komplettem RPMI (RPMI mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, 50 ug / ml Gentamycin und 50 uM β-Mercaptoethanol).

2. Isolieren BM Zellen von Mäusen

1. Opfern Mäuse durch _CO 2 Ersticken und Genickbruch. Platzieren Sie die Maus auf eine Dissektion Tablett und sterilisieren mit 70% Ethanol. Einen Einschnitt in der Mitte der Unterleib und entfernen Sie die Haut von dem distalen Teil der Maus, einschließlich der Haut, die die unteren Extremitäten.
2. Sezieren Mäuse in einem semi-sterile Haube. Um den Oberschenkel und Schienbein zu lösen, Clip den Oberschenkelknochen und Schienbeine oben unterhalb des Kniegelenks. Lösen Sie die Muskeln von den Knochen mit einer Schere und legen Sie die Knochen in einer 6 cm Petrischale mit 5 ml RPMI abzuschließen.
3. Gehen Sie zu einem sterilen Kultur Kapuze. Füllen Sie ein 3-ml-Spritze mit einer 27G Nadel mit komplettem RPMI verbunden. Schneiden Sie die beiden Enden der Knochen mit einer Schere, und legen Sie die 27G Nadel, um das Mark aus den Knochen durch leichtes Einspritzen von komplettem RPMI einmal von jedem Ende zu spülen.
4. Vorbereitung einer Einzelzellsuspension durch vorsichtiges Pipettieren die Zellen auf und ab 3-5 mal in der Kulturschale mit der Spritze ohne Nadel.
5. Zentrifugieren die Zellen 5 min bei 500 xg und dekantiert den Überstand.
6. Lyse der roten Blutzellen, die mit 1 ml ACK-Puffer (150 mM _NH 4 Cl, 10 mM KHCO _3, 0,1 mM EDTA) Inkubation für 1 min und Abstoppen der Reaktion durch Verdünnen mit 10 Volumina komplettem RPMI. Lassen Sie Zellen für 5 Minuten, um durch die Schwerkraft zu pelletieren tot Zellklumpen und Gewebereste stehen.
   Hinweis: Stellen Sie sich nicht mehr als 5 Minuten, da dies in der Zellverlust durch Absetzen der lebensfähigen Zellen führen.
7. Langsam decant zellhaltige Überstand in ein neues Röhrchen verlassen Trümmerhinter der original tube.
8. Zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 500 xg, um die Zellen zu pelletieren, dann entfernen und den Überstand verwerfen.
9. Resuspendieren Gesamt BM-Zellen in 100 & mgr; l FACS-Puffer (1 × PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA) (typischerweise 4-6 ^× 10 7 Zellen werden aus BM eine Maus erhalten wurde).

3. FACS Analyse und Sortierung der CLP

1. Fügen Sie anti-CD16 / 32 (Hybridom-Überstand Clone 2.4G2, 50 ul / Reaktion oder 1-2 ug / Reaktion) in Zellen in FACS-Puffer (Schritt 2.9) für 1-2 min, um Fc-Rezeptoren zu blockieren.
   Hinweis: Anti-CD16 / 32 ist auch Fc-Block, der zugegeben wird, um nicht-spezifische Bindung von Antikörpern an Zellen, die Fc-Rezeptoren, einschließlich Granulozyten, Monozyten und B-Lymphozyten zu verhindern bezeichnet.
2. Gleichzeitig gefärbt werden Zellen mit den folgenden Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörpern (für 4x10 ⁷ Zellen) für 15 Minuten auf Eis unter Vermeidung Umgebungslicht. Antikörper: PE-konjugierten Lineage Marker (jeweils 0,2 ug), das anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6.7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), Anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119) und anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 & mgr; g anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 & mgr; g anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 & mgr; g anti-M-CSFR-APC (AFS98) und 0,2 & mgr; g anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
3. Wasche die Zellen mit 3 ml FACS-Puffer und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g.
4. Die Zellen in 300 ul FACS Puffer und Filterzellen durch ein 40 & mgr; M Zellsieb.
5. Waschen Sie die Röhrchen mit einem zusätzlichen 100 ul FACS-Puffer, um alle verbleibenden Zellen zu gewinnen und die Filter in eine sterile FACS-Sortierung Rohr mit der gleichen Zellsieb.
6. Führen Durchflusszytometrieanalyse unmittelbar nach der Färbung mit entsprechenden Filtern und Spannungen zur Signalerfassung. Verwenden 488 nm-Laser, um die FITC-PerCP-Cy5.5-markierten Antikörpern, 561 nm-Laser, um die PE- und PE-Cy7-labelded Antikörper und 633 nm erfassen laser, um die APC-markierten Antikörper zu erkennen.
7. Sortieren Sie CLP nach folgenden Marker lin ^- c-kit ^int Sca-1 ^int M-CSFR ^- IL-7Rα ⁺ (wie in Schritt 3.2 gefärbt) mit einem Zellsortierer. Sammeln der sortierten Zellen in ein 15 ml Röhrchen, enthaltend 8 ml komplettem RPMI als Polster.
8. Erfassen die absolute Anzahl der sortierten Zellen durch den Zellsortierer am Ende des Durchlaufs angezeigt. Typischerweise kann 5x10 ⁴ CLP vom BM einer Maus gewonnen werden.

4. Cokultur CLP und AC-6

1. Zentrifugieren Sie die sortierten Zellen aus Schritt 3.7 für 10 Minuten bei 500 xg, entfernen Sie den Überstand und Zellpellet mit genügend komplettem RPMI um eine Zelldichte in der Umgebung von 5x10 ⁴ Zellen / ml zu erhalten. Seed 500 Zellen / Well in 12-Well-Platte mit Feeder-Zellen in Schritt 1.4 vorbereitet.
2. In 100 ng / ml FL ¹⁹ (hu-Flt3L-Ig in-house mit einem Expressionssystem von M. Manz, Universi unsere Anbieterty Spital Zürich, Schweiz) und bei 37 ^{° C,} _5% CO 2 mit periodischen visuelle Überwachung der DC Entwicklung unter dem Mikroskop.
   Anmerkung: Im Handel erhältliche rekombinante menschliche FL oder Maus FL kann als Ersatz für hu-Flt3L-Ig DC Entwicklung bereitgestellt werden können.
3. Sammeln der Zellen im Überstand am Tag 12 und Waschen der Wells einmal mit 0,5 ml RPMI-Medium Kombinieren der resultierenden Überstände zu vervollständigen. 0,5 ml frisches Medium und Schrott, die haftenden Zellen mit einem Zellschaber.
4. Verbinden die Zellen enthaltenden Mediums aus beiden Teilen und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g.
5. Dekantieren und resuspendieren Zellen in 50 ul FACS-Puffer. In 50 ul anti-CD16 / 32 Hybridomüberstand und Inkubation für 1-2 Minuten an Fc-Rezeptoren zu blockieren.
6. Aufzuzählen und färben alle Zellen mit den folgenden Antikörpern (jeweils 0,05 ug) Anti-CD11c-APC (N418), Anti-CD11b-FITC und anti-B220-PE.
7. Waschen und Zentrifuge die Zellen wie beschriebend in Schritt 3.3.
8. Die Zellen in 100 ul FACS-Puffer, Tor auf CD11c ⁺ und zu analysieren, für cDCs (CD11c ⁺ CD11b ⁺ B220 ^-) und pDCs (CD11c ⁺ CD11b ^- B220 ^{+) 17.}

Ergebnisse

Insgesamt 4-6x10 ⁷ BM-Zellen werden typischerweise aus Oberschenkelknochen und Schienbein einer 6-8 Wochen alten Wildtyp C57BL / 6-Maus isoliert. Zu sortieren, CLP, sind insgesamt BM-Zellen mit PE-konjugierten Antikörpern gegen Linie Marker (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 und MHC-II), anti gebeizt c-kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC und Anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analysiert und sortiert werden mit einem Zellsortierer. Die Sortierstrategie für CLP ist in Abbild...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein in-vitro-Kultursystem für die robuste Erzeugung von DCs und pDCs insbesondere aus einer kleinen Anzahl von CLPs. Die Einzigartigkeit dieses Kultursystem ist auf die Verwendung von AC-6-Zellen, eine Stromazelllinie, Speiser. Diese Vorgehensweise hat sich gezeigt, dass nicht nur die Cytokine, wie IL-7, SCF, M-CSF und FL ^{20 vorzusehen,} sondern auch die ^{Zell-Zell-Kontakt} 21 notwendig DC Entwicklung zu unterstützen. AC-6 Zellen wurden zuvor verwendet, um die Untersuch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5	Biolegend	108408	linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136	Biolegend	108708	linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70	Biolegend	101208	linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3	Biolegend	115508	linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2	Biolegend	103208	linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2	Biolegend	100308	linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7	Biolegend	100707	linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4	Biolegend	107608	linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119	Biolegend	116208	linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51	eBioscience	12-0900-83	linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98	Biolegend	135510	FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8	Biolegend	105824	FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7	Biolegend	108106	FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34	Biolegend	135014	FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418	Biolegend	117328	FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70	Biolegend	101206	FACS
FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
FACS sorting tube	BD Biosciences	352054
FlowJo	FlowJo LLC		Flow analysis sofrware