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요약

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

초록

형질 수지상 세포 (올라가고은) 내가 감염 또는 염증 반응 동안 응답 활성화 (IFN-1) 생산 세포를 인터페론 강력한 유형입니다. 불행하게도, PDC 기능의 연구는 림프 기관에 낮은 주파수에 의해 방해하고, 체외 DC 생성을위한 기존의 방법은 주로 올라가고 이상 CDCS의 생산을 선호. 여기에 우리가 효율적으로 체외에서 일반적인 림프 전구 세포 (CLP를)에서 올라가고을 생성하는 독특한 접근 방식을 제시한다. 특히, 프로토콜은 골수로부터 CLP를 정화 및 FLT3 리간드의 존재하에 γ 조사 된 AC-6 피더 세포와 공동 배양함으로써 PDCS를 생성하는 방법을 자세히 설명했다. 이 문화 시스템의 고유 한 특징은 CLP를가 AC-6 세포 아래 마이그레이션 및 조약돌 영역 형성 세포, PDC의 확장을위한 중요한 단계가 될 것입니다. 형태 학적으로 별개의 수지상, 즉 올라가고 및 CDCS는 7 조성 후 약 2 주 생성 된최적 조건 하에서 0-90%의 PDCS. 일반적으로이 방법에 의해 생성 PDCS의 수는 대략 CLP를 시딩 수의 100 배이다. 따라서, 이것은 견고 이들 세포의 발달 및 기능에 추가 연구를 용이하게하기 위해 필요한 PDCS의 다수를 생성되는 신규 한 시스템이다.

서문

수지상 세포 (DCS)는 면역 반응 1을 제어하는데 중요한 역할을 전문 항원 제시 세포이다. DC가 이종 있지만, 그들이 대체로 두 집단으로 분류 될 수 있고, 종래의 DC (CDCS) 및 형질 수지상 (PDCS) 2,3-. 림프 기관 외에 CDCS 및 PDCS 또한 폐, 소장, 피부 (2)를 포함한 조직에서 발견된다. CDCS 및 올라가고의 형태는 수상 돌기 모양의 돌기보다 형질 세포가 같은 것을 올라가고의 모양을 나타내는 CDCS으로 다르​​다. 또한, 일반적인 마우스 DC 마커, CD11c 양성은 더 높게 올라가고보다 CDCS에 표현된다. 올라가고 2보다 MHC 클래스 II의 높은 수준과 보조 자극 분자를 표현 둘 CD24 + CDCS, - CDCS와 CD11b를 - 또한, CDCS는 더는 CD11b + CD24로 나눌 수 있습니다. 성숙한 PDCS는 반면에, 선택적 Siglec-H 및 BST2 4를 발현하는 것으로 나타났다. 에프unctionally, CDCS는 올라가고보다 제시 세포보다 항원은; 그러나 올라가고 내가 바이러스 감염이나 염증 자극 5시 인터페론 유형의 광대 한 양을 생성 할 수 있습니다.

모두 CDCS 및 올라가고는 짧은 수명이며, 따라서 지속적으로 골수 (BM) 6,7 내 조상에서 보충해야합니다. 치명적-조사 된 마우스에 공통 골수 전구 세포 (CMP들) 및 일반 림프 조상 (CLP를)의 입양 전송 CDCS과 올라가고 양쪽 계통 8-10에서 생성 될 수 있음을 보여줍니다. 그러나, RAG1 / 2를 표현하고 고등학교의 궤적 (11, 12)에서 재 배열 DJ 세그먼트를 가지고 올라가고의 부분 집합이있다. 이 세포는 B220 마커의 발현, 핵산 감지 수용체 (TLR7 / TLR9) 및 전사 인자 (Spib 및 Bcl11a) (13)를 포함하는 B 림프구와 분자 유사성을 공유하고, 림프 혈통의 서명 될 것으로 모두가 있습니다. 따라서, CLPS 때문에 계보 유사성 올라가고의 체외 발생에 대한 좋은 선택 일 수있다.

인간 및 마우스 모두 CDCS 및 PDCS의 빈도가 매우 낮은 반면 6, 수지상 세포, 특히 CDCS는, (예를 GM-CSF 11,14 또는 FLT3 리간드와 같은 사이토 카인의 존재 BM 또는 전구 세포로부터 in vitro에서 생성 될 수있는 FL ) 공급 장치가없는 시스템 11,15,16를 사용하여. 불행하게도, 그러나, FL 11,15,16을 사용하여 시험 관내에서 PDC의 다수를 생성하는 것은 불가능하다. 이전에, 우리는 PDCS 효율적 AC-6 급전 시스템 (17)을 사용하여 시험 관내에서 CLP를 생성 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 배양 시스템에서 AC-6 간질 세포주를 사용하는 장점은 세포 - 세포 접촉 CLP를 PDCS로부터 많은 수의 생성을 지원하는 사이토 카인의 분비를 제공한다는 것이다. 이 시스템으로 생산이 매우 강력하지만, 아래에 설명 된 절차에주의 복제 내가 필요합니다N 순서는 올라가고의 효율적 생성을 보장합니다.

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프로토콜

C57BL / 6 야생형 마우스 국립 실험 동물 센터 (NLAC), 대만에서 구입 하였다. 모든 마우스는 사육 및 특정 병원균이없는 상태에서 유지되었다. 프로토콜 및 동물 사용 절차를 검토하고 의학의 국립 대만 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (허가 번호 : 20120075)에 의해 승인되었다. 또한, 연구진은 실험을 수행하는 동안 동물에 고통, 고통, 또는 고통의 가능성을 줄이기 위해 모든 노력을했다. 장갑을 착용하는 동안 설명하는 모든 절차는 실온에서 수행되었다.

AC-6 피더 세포의 제조 (1)

주 : AC-6.21 (AC-6 짧은) (I. 와이즈맨, 스탠포드 대학에서 제공) 기질 세포 라인 (18)하는 것은 RPMI에서 유지되어야는 15 % 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. 피더 세포의 역할을하기 위해, AC-6 세포-γ 조사 3,000 방사선 (30Gy) 자신의 확산을 방지하기 위해 공동 문화 전에 일일와 있습니다. 참고 일그들의 통로 번호가 20 인 경우에 AC-6 세포는 유지 보수시 혼잡 방치하면 자신의 분화 지원 능력을 상실하는 경향이있다, 또는.

  1. 워시 AC-6 세포는 한 번에 1 ml의 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)와 열망에 의해 DPBS를 제거합니다. AC-6 37 O C 3-5 분 동안 0.8 ml의 트립신 용액 (0.05 % 트립신 및 DPBS 0.5 mM의 EDTA), 그 다음 5 % CO 2와 함께 세포 배양 배지의 10 볼륨으로 희석하여 반응을 정지 치료 단일 세포 현탁액을합니다.
  2. 5.9x10에서 종자 AC-6 세포는 4 세포 / 웰로 12 웰 플레이트와 5 %, 37 ℃로 배양 CO 2 O / N.
    주 : AC-106 세포의 밀도가 CDC 생성을 선호한다 저밀도 매우 중요하다. 5.9x10의 밀도로 시드 아니라 AC-6 CLP를에서 올라가고의 유도를위한 최적 다음날에 의해 포화 상태에 도달 할 수 / 4 셀.
  3. γ-조사 장치를 이용하여 3000 RAD (30 Gy의)에서 AC-6 세포를 조사.
    노트: AC-6을 조사하는 데 사용되는 투여 량에서 세포 증식을 방지하고, 또 CLP를 행 수지상 분화에 필요한 사이토 카인과 세포 - 세포 접촉을 제공하기에 충분히 오래 생존 그들을 유지하기 위해 최적화된다.
  4. 대기음 매체 (10 % 열 - 불 활성화 FBS, 50 μg의 / ㎖ 겐타 마이신과 50 μM의 β-머 캅토 에탄올로 RPMI) 완전한 RPMI 1 ㎖로 대체합니다.

마우스 2. 격리 BM 세포

  1. CO 2 질식 자궁 전위에 의해 쥐를 희생. 해부 트레이에 마우스를 놓고 70 % 에탄올로 소독. 중반 복부에 절개를하고 하반신을 덮고있는 피부를 포함하여 마우스의 말단 부분에서 피부를 제거합니다.
  2. 반 멸균 후드에서 쥐를 해부하다. 대퇴골과 경골을 해제하려면, 무릎 관절 아래 위의 대퇴골과 경골 클립. 가위를 사용하여 뼈에서 근육을 분리하고 RPMI을 완료 5 ㎖를 포함하는 6cm 페트리 접시에 뼈를 배치합니다.
  3. 멸균 문화 후드로 이동합니다. 완전한 RPMI와 27G 바늘에 연결된 3 ML의 주사기를 채우십시오. 가위를 사용하여 뼈의 양쪽 끝을 잘라, 부드럽게 각각의 끝에서 완료되면 RPMI를 주입하여 뼈에서 골수를 플러시 27G 바늘을 삽입합니다.
  4. 세포 상하 3-5 배 바늘없는 주사기를 사용하여 배양 접시에서 부드러운 피펫 팅에 의해 단일 ​​세포 현탁액을 제조.
  5. 500 XG에서 5 분 동안 세포를 원심 분리기와 뜨는을 가만히 따르다.
  6. 1 mL의 ACK 완충액 (150 mM의 CL NH 4, 10 mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA) 1 분 동안 배양하고 완전 RPMI 10 부피로 희석하여 반응을 정지와를 Lyse 적혈구. 세포가 중력에 의해 죽은 세포 덩어리 및 조직 파편을 펠렛하기 위해 5 분간 방치한다.
    참고 :이 때문에 가능한 세포의 정착에 세포가 손실 될 수로 이상 5 분을 서 있지 마십시오.
  7. 새로운 튜브 떠나 파편에 천천히 캔트 세포 함유 뜨는원래 튜브 뒤에.
  8. 다음, 세포 펠렛 제거하고 상층 액을 버린다 500 XG에서 5 분 동안 원심 분리기.
  9. 총 BM 세포를 재현 탁 FACS 완충액 (1X PBS + 2 % FBS +를 1mM EDTA) 100 μL (전형적으로 4-6 X 107 BM 세포 한 마우스로부터 획득된다).

3. FACS 분석 및 CLP를의 정렬

  1. 된 Fc 수용체를 차단하기 위해 1 ~ 2 분 동안 항 CD16 / 32 (하이 브리 도마 상층 액 10 클론 2.4G2, 50 μL / 반응 또는 1-2 μg의 / 반응) FACS 버퍼에 세포에 (단계 2.9)를 추가합니다.
    주 : 안티 CD16 / 32 또한 과립구, 단핵구, 및 B 림프구를 비롯한 된 Fc 수용체를 발현하는 세포에 대한 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 첨가 된 Fc 블록이라고 부른다.
  2. 동시에 주변 광을 피하고, 얼음에 15 분 동안 (4 × 7 셀) 다음과 같은 형광 염료 표지 항체와 세포를 얼룩. 항체 : PE - 복합 혈통 마커 항 CD3 포함 (0.2 μg의 각) (17A2) 항 CD8 (53에서 6.7 사이), 항 B220 (RA3-6B2), 항 CD19 (eBio1D3), 항 -CD11b (M1 / 70), 안티 GR-1 (RB6-8C5), 안티 Thy1.1 (HIS51), 안티 NK1.1 (PK136), 안티 TER119 (TER-119), 및 안티 MHC-II (NIMR-4), 0.2 μg의 항 - C-KIT-를 PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 μg의 안티 무서-1-FITC (D7), 0.4 μg의 안티 - M-CSFR-APC (AFS98), 0.2 μg의 항 IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
  3. 500 X g에서 5 분 동안 3 ML의 외과 버퍼와 세포 및 원심 분리기를 씻으십시오.
  4. 300 ㎕의 FACS에 세포가 40 μM 셀 스트레이너 버퍼 및 필터를 통해 세포를 재현 탁.
  5. 남아있는 세포를 복구하고 동일한 셀 스트레이너를 사용하여 튜브를 정렬 멸균 외과로 필터링 추가 100 μL FACS 완충액으로 튜브를 씻으십시오.
  6. 신호 검출에 대해 적절한 필터 및 전압을 사용하여 염색 후 즉시 유세포 분석을 수행한다. PE- 및 PE-Cy7-labelded 항체 및 633 nm의 라스를 검출하기 위해 561 nm의 레이저, FITC-, Cy5.5를 PerCP - 표지 된 항체를 검출하기 위해 488 nm의 레이저를 사용하여ER은 APC 표지 항체를 검출한다.
  7. 씨 - 킷트 INT 무서 INT-1의 M-CSFR - - + IL-7Rα (단계 3.2에서 염색 등) 셀 소터를 사용하여 정렬 밖으로는 CLP를 다음 마커에 따른 LIN. 쿠션 완전 RPMI 8ml의 함유 15ml를 튜브에 세포를 수집 정렬.
  8. 런의 ​​끝에서 셀 소터와 같이 분류 세포의 절대 수를 기록한다. 통상적으로, 5 × 4 CLP를 한 마우스로부터 BM을 얻을 수있다.

4. 공동 배양 CLP를 및 AC-6

  1. 500 XG에서 10 분 동안 단계 3.7에서 분류 세포를 원심 분리하고 상층 액을 5 × 104 세포 / ㎖의 주위 세포 밀도를 얻기 위해 충분히 완전한 RPMI과 세포 펠렛을 재현 탁. 씨앗 500 세포 / 웰로 단계 1.4에서 준비 피더 세포를 포함하는 12 웰 플레이트.
  2. 추가 100 NG FL 19 ㎖ / (후-Flt3L-IG는 M. 만츠, Universi 의해 제공 발현 시스템을 이용하여 내부에서 생성 된타이 병원 취리히, 스위스), 37 O C, 현미경 DC 개발의주기적인 영상 감시와 5 % CO 2에서 품어.
    참고 : 시판되는 재조합 인간 또는 마우스 FL FL은 DC의 개발을 지원하기 위해 후 - Flt3L-IG 대용으로 사용될 수있다.
  3. 12 일에 뜨는에서 세포를 수집하고 결과 상층 액을 결합 RPMI 배지를 완료 ㎖로 0.5 회 우물을 씻는다. 셀 스크레이퍼로 부착 세포를 0.5 ml의에게 신선한 매체를 추가하고 스크랩.
  4. 500 x g에서 5 분 동안 세포 함유 배지에서 두 부분을 결합하고 원심.
  5. 50 μL FACS 버퍼에 가만히 따르다 뜨는에 resuspend 세포. 50 μL 항 CD16 / 32 하이 브리 도마 뜨는 추가 된 Fc 수용체를 차단하는 1-2 분 동안 품어.
  6. 열거하고 다음 항체 (0.05 μg의 각) 항 중 CD11c-APC (N418), 항 -CD11b-FITC 및 항 B220-PE 모든 세포를 염색.
  7. 설명으로 세척하고 원심 분리기 세포단계 3.3에서 D.
  8. 중 CD11c의 + 100 μL FACS 버퍼 게이트에서 세포를 재현 탁하고 CDCS (중 CD11c + CD11b를 + B220 -)에 대해 분석하고 올라가고 (중 CD11c + CD11b를 - B220의 +) (17).

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결과

4-6x10 7 BM 세포의 총 일반적으로 대퇴골 한 6 ~ 8 주령, 야생형 C57BL / 6 마우스의 경골에서 격리됩니다. CLP를 밖으로 정렬하려면, 총 BM 세포는 혈통 마커 (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b를, GR-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 및 MHC-II), 안티에 대한 PE - 복합 항체로 염색 -c-KIT-를 PerCP / Cy5.5, 안티 무서-1-FITC, 안티 - M-CSFR-APC 및 항 IL-7Rα-PE / Cy7는 분석하고 세포 분류기로 분류. CLP에 대한 선별 전략은 그림 1에...

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토론

여기에서 우리는 CLP를 소수의에서, 특히 체외 배양 수지상의 강력한 생성을위한 시스템 및 올라가고을 설명합니다. 이 배양 시스템의 고유성은 피더로서 AC-106 세포, 간질 세포주의 이용에 기인한다. 이 방법은 예컨대 IL-7, SCF, M-CSF 및 FL 20뿐만 아니라 사이토 카인을 제공하기 위해 도시 한 내용뿐만 아니라, 필요한 세포 간 접촉 (21)은 DC 개발을 지원한다. AC-106 세포는 여러 ?...

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공개

Authors have nothing to disclose.

감사의 말

우리는 박사에 감사드립니다. 시약을 제공 마르쿠스 만츠와 어빙 와이즈맨. 우리는 또한 각각 의학 및 NTU 병원의 국립 대만 대학에서 유세포 분석 및 우선의 셀 정렬 핵심 시설과 두 번째 핵심 연구소가 제공하는 서비스를 인정합니다. 이 작품은 과학 기술, 대만의 교육부에 의해 지원되었다 (가장 102-2320-B-002-030-MY3)과 국민 건강 연구소, 대만 (NHRI-EX102-10256SI과 NHRI-EX103-10256SI).

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5Biolegend108408linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136Biolegend108708linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70Biolegend101208linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3Biolegend115508linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2Biolegend103208linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2Biolegend100308linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7Biolegend100707linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4Biolegend107608linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119Biolegend116208linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51eBioscience12-0900-83linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98Biolegend135510FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8Biolegend105824FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7Biolegend108106FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34Biolegend135014FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418Biolegend117328FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70Biolegend101206FACS
FACSAria IIIBD BiosciencesCell sorter
FACS sorting tube BD Biosciences352054
FlowJoFlowJo LLCFlow analysis sofrware

참고문헌

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