In Vitro geração de células dendríticas plasmocitóides Murino de comum Linfóide Progenitores usando o sistema de alimentação AC-6

Resumo

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

Resumo

Células dendríticas plasmocit�des (PDCs) são poderoso tipo I interferon (IFN-a) que produzem células que são activados em resposta a infecção ou durante as respostas inflamatórias. Infelizmente, estudo da função PDC é prejudicada pela sua baixa freqüência em órgãos linfóides, e os métodos existentes para a geração in vitro DC predominantemente favorecer a produção de CDCs sobre pDCs. Aqui nós apresentamos uma abordagem única para gerar de forma eficiente pDCs de progenitores linfóides comuns (CLPs) in vitro. Especificamente, o protocolo descrito detalhes como purificar os CLPs de medula óssea e geram pDCs por coculturing com AC-6 células alimentadoras irradiadas com y na presença de ligando Flt3. Uma característica única do presente sistema de cultura é que as CLPs migrar sob o AC-6 e as células tornam-se as células formadoras de área de paralelepípedo, um passo crítico para a expansão pDCs. DCs morfologicamente distintas, a saber pDCs e CDCs, foram gerados após cerca de 2 semanas com uma composição de 70-90% pDCs em condições óptimas. Tipicamente, o número de pDCs geradas por este método é cerca de 100 vezes do número de CLPs semeadas. Portanto, este é um novo sistema com o qual gerar robustamente o grande número de pDCs necessárias para facilitar estudos adicionais sobre o desenvolvimento e a função destas células.

Introdução

As células dendríticas (CDs) são células apresentadoras de antigénios profissionais, que desempenham um papel importante no controlo da resposta imunitária ^1. Enquanto as DCs são heterogéneos, eles podem ser classificados em duas populações, as DCs convencional (CDCs) e DCS plasmocitoides (PDCs) ^2,3. Além de órgãos linfóides, CDCs pDCs e também são encontradas em tecidos incluindo o pulmão, intestino, pele e ^2. A morfologia dos CDCs e pDCs difere, com CDCs expositoras projeções dendríticos-like e forma de pDCs ser como célula-mais de plasma. Além disso, o DC marcador rato comum, CD11c, é mais altamente expresso em CDCs que em pDCs. Além disso, os CDCs pode ainda ser dividido em CD11b ⁺ CD24 ^- CDCs e CD11b ^- CD24 ⁺ CDCs, sendo que ambos expressam níveis mais elevados de MHC classe II e de moléculas co-estimuladoras do que fazer pDCs ^2. PDCs maduros, por outro lado, têm sido mostrados para expressar selectivamente Siglec-H e BST2 ^4. Functionally, CDCs são melhores células apresentadoras de antígeno que são pDCs; No entanto, pDCs pode produzir uma grande quantidade de interferão de tipo I sobre a infecção do vírus ou estimulação inflamatória ^5.

Ambos os CDCs e pDCs são de curta duração e, portanto, deve ser constantemente reabastecidos de progenitores dentro da medula óssea ^(BM) 6,7. A transferência adoptiva de células progenitoras comuns mielóides (PGZC) e progenitores linfóides comuns (CLPs) em ratinhos letalmente irradiados demonstra que CDCs e pDCs pode ser gerada a partir de ambas as linhagens ^8-10. No entanto, há um subconjunto de pDCs que expressam RAG1 / 2 e possuem segmentos rearranjados DJ no locus de IgH ^11,12. Estas células também partilhar semelhanças moleculares com linfócitos B, incluindo a expressão do marcador B220, receptores de detecção de ácidos nucleicos (TLR7 / TLR9), e factores de transcrição (e SPIB BCL11A) ^13, dispõe de todos Acredita-se que as assinaturas de linhagem linfóide. Portanto, CLPs podem ser boas escolhas para in vitro geração de pDCs por causa da semelhança linhagem.

Enquanto a frequência dos dois CDCs pDCs e em humanos e em ratos é muito baixo ^6, DCs, particularmente CDC, podem ser geradas in vitro a partir de progenitores BM ou na presença de citocinas, tais como GM-CSF ^11,14 ou ligando Flt3 (FL ) usando sistemas de livre-feeder ^11,15,16. Infelizmente, no entanto, não é possível produzir um grande número de pDCs in vitro utilizando FL ^11,15,16. Anteriormente tínhamos demonstrado que pDCs pode ser gerada de forma eficiente in vitro a partir CLPs que utilizam o sistema de alimentação de CA ^6-17. A vantagem de utilizar a linha de células do estroma AC-6 no sistema de cultura é que ela proporciona um contacto célula-célula e a secreção de citoquinas que suportam a geração de grandes números de pDCs de CLPs. Embora a produção com este sistema é muito robusto, replicação cuidadosa dos procedimentos descritos a seguir é necessário iara garantir a geração eficiente de pDCs.

Protocolo

Murganhos C57BL / 6 de tipo selvagem foram adquiridos a partir do Centro Nacional de Animais de Laboratório (NLAC), Taiwan. Todos os ratinhos foram criados e mantidos sob condições isentas de agentes patogénicos específicos. Protocolos e procedimentos de uso dos animais foram revisadas e aprovadas pelo cuidado e uso de animais Comitê Institucional da National Taiwan University College of Medicine (Permit Number: 20120075). Além disso, os pesquisadores fizeram todos os esforços para reduzir o potencial de dor, sofrimento, angústia ou nos animais durante a realização de experimentos. Todos os procedimentos descritos foram realizados à temperatura ambiente usando luvas.

1. Preparação de 6-ac células alimentadoras

Nota: O AC-6,21 (AC-6 em curto) linha celular de estroma ¹⁸ (fornecida por I. Weissman, Universidade de Stanford) devem ser mantidas em RPMI suplementado com 15% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS). Para servir como células de alimentação, AC-6-γ células são irradiadas com 3000 rad (30Gy) um dia antes da co-cultura para evitar a sua proliferação. Th notano AC-6 células tendem a perder a sua capacidade de suporte de diferenciação se deixou estar lotados durante a manutenção, ou se o seu número passagem é superior a 20.

1. Lavar AC-6 células uma vez com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) e remover por aspiração DPBS. Tratar AC-6 células com 0,8 ml de solução de tripsina (tripsina a 0,05% e EDTA a 0,5 mM em DPBS) durante 3-5 min a 37 ^{° C,} 5% de CO ₂ e, em seguida, parar a reacção por diluição com 10 volumes de meio de cultura aos fazer a suspensão de célula única.
2. Semente AC-6 5.9x10 células em ⁴ células / poço em placas de 12 poços e incuba-se a 37 ^{° C,} 5% de CO ₂ O / N.
   Nota: A densidade da AC-6 células é muito importante, uma menor densidade favorecerá a geração CDC. Semear a uma densidade de ⁴ 5.9x10 células / poço permitirão AC-6 para atingir confluência no dia seguinte, o que é óptimo para a derivação das PDC de CLPs.
3. Irradiar AC-6 células a 3000 rad (30 Gy), utilizando-γ irradiador.
   Nota: A dose utilizada para irradiar AC-6 é otimizado para evitar que as células se proliferem e ainda mantê-los viável a longo o suficiente para fornecer as citocinas e contato célula-célula necessárias para a diferenciação de DCs de CLPs.
4. Aspirar o meio e substituir com 1 ml de meio RPMI completo (RPMI com 10% de FBS inactivado pelo calor, 50 ug / ml de gentamicina e 50 pM β-mercaptoetanol).

2. Isolar BM As células de ratinhos

1. Sacrifique ratos por _asfixia com CO2 e deslocamento cervical. Colocar os ratinhos num tabuleiro de dissecação e esterilizar com etanol a 70%. Realizar uma incisão no abdómen e meados de remover a pele a partir da parte distal do rato, incluindo a pele que cobre as extremidades inferiores.
2. Dissecar ratinhos em uma capa semi-estéril. Para liberar o fêmur ea tíbia, o fêmur clipe acima e tíbias abaixo da articulação do joelho. Separar os músculos dos ossos usando uma tesoura e colocar os ossos numa placa de Petri 6 cm contendo 5 ml de RPMI completo.
3. Mover-se para uma capa de cultura estéril. Encha uma seringa de 3 ml ligada a uma agulha 27G com meio RPMI completo. Cortar ambas as extremidades dos ossos usando uma tesoura, e inserir a agulha 27G para liberar a medula de ossos, injetando suavemente RPMI completo uma vez a partir de cada extremidade.
4. Prepara-se uma suspensão de células individuais por pipetagem suave das células cima e para baixo 3-5 vezes na placa de cultura usando a seringa sem agulha.
5. Centrifugar as células durante 5 min a 500 xg e decanta-se o sobrenadante.
6. Lisar células vermelhas do sangue com 1 ml de tampão ACK (150 mM de _NH4Cl, 10 mM KHCO _3, 0,1 mM de EDTA) a incubação durante 1 min e parar a reacção por diluição com 10 volumes de meio RPMI completo. Permitir que as células em repouso durante 5 min, de modo a sedimentar-se aglomerados de células mortas e detritos por gravidade tecido.
   Nota: Não fique mais de 5 min como isso irá resultar em perda de células devido à sedimentação de células viáveis.
7. Contendo células sobrenadante lentamente decante para um novo tubo deixando detritostrás no tubo inicial.
8. Centrifugar durante 5 minutos a 500 xg para sedimentar as células, em seguida, remover e descartar o sobrenadante.
9. Ressuspender as células totais BM (tipicamente 4-6 x 10 ⁷ BM células são obtidas a partir de um murganho) em 100 ul de tampão FACS (1x PBS + 2% FBS + EDTA 1 mM).

3. FACS análise e classificação de CLPs

1. Adicionar anti-CD16 / 32 (sobrenadante de hibridoma do clone 2.4G2, 50 ul / reacção ou 1-2 ug / reacção) em células em tampão de SCAF (passo 2.9), durante 1-2 minutos, a fim de bloquear os receptores de Fc.
   Nota: Anti-CD16 / 32 também é chamado bloco de Fc, que é adicionado para evitar ligação não específica dos anticorpos às células que expressam receptores de Fc, incluindo granulócitos, monócitos e linfócitos B.
2. Simultaneamente, as células são coradas com os seguintes anticorpos marcados com corantes fluorescentes (para 4x10 ⁷ células) durante 15 min em gelo, evitando a luz ambiente. Antibodies: marcadores de linhagem PE-conjugados (0,2 ug de cada) incluindo o anti-CD3 (17-2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-Ter119 (TER-119), e anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 ug de anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 ug de anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 ug de anti-M-CSFR-APC (AFS98), e 0,2 ug de anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
3. Lavar as células com 3 ml de tampão de FACS, e centrifuga-se durante 5 min a 500 x g.
4. Volte a suspender as células em 300 ul de tampão de FACS e células filtrar através de um filtro de células 40 mM.
5. Lavar o tubo com um buffer adicional FACS 100 ul para recuperar quaisquer células restantes e filtrar para um FACS estéreis triagem tubo utilizando o mesmo filtro de células.
6. Realizar a análise de citometria de fluxo imediatamente após a coloração, usando filtros e voltagens adequadas para a detecção de sinal. Use laser de 488 nm para a detecção dos anticorpos com FITC, PerCP-Cy5.5-rotulados, do laser 561 nm, para detectar o PE- e anticorpos PE-Cy7-labelded e 633 nm laser de detectar o anticorpo marcado com APC.
7. Resolver CLPs de acordo com os seguintes marcadores de ^Lin - c-kit ^{int int} Sca-1 M-CSFR ^- IL-7Rα ^{+ (como} coradas no passo 3.2), utilizando um classificador de células. Recolher as células separadas em um tubo de 15 ml contendo 8 ml de meio RPMI completo como uma almofada.
8. Grave o número absoluto de células classificadas como mostrado pelo classificador de células no final da corrida. Tipicamente, 5x10 ⁴ CLPs podem ser obtidos a partir de MO de um rato.

4. co-cultura CLPs e AC-6

1. Centrifugar as células escolhidas a partir da etapa 3.7, durante 10 min a 500 xg, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células com meio RPMI completo suficientemente para se obter uma densidade celular de 5x10 ⁴ em torno de células / ml. Semente 500 células / cavidade da placa de 12 poços contendo células alimentadoras, preparado no passo 1.4.
2. Adicionam-se 100 ng / ml FL ¹⁹ (Hu-Flt3L-Ig gerado internamente utilizando um sistema de expressão é fornecida por M. Manz, UniversiTy Hospital Zurique, Suíça) e incubar a 37 ^{° C,} 5% de CO ₂ com a monitorização visual periódica de desenvolvimento DC sob um microscópio.
   Nota: Comercialmente disponível FL recombinante humano ou rato FL pode ser utilizado como um substituto para a hu-Flt3L-Ig para suportar o desenvolvimento DC.
3. Recolher as células do sobrenadante ao dia 12 e lavar os poços uma vez com 0,5 ml de meio completo RPMI, combinando-se os sobrenadantes resultantes. Adicionar 0,5 ml de meio fresco e destruam as células aderentes com um raspador de células.
4. Combinar o meio contendo as células de ambas as partes e centrifugar durante 5 minutos a 500 x g.
5. Células sobrenadante e ressuspender em tampão FACS Decantar 50 ul. Adicionar 50 uL de anti-CD16 / 32 sobrenadante de hibridoma e incuba-se durante 1-2 minutos para bloquear os receptores Fc.
6. Enumerar e manchar todas as células com os seguintes anticorpos (0,05 ug) de cada anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC, e anti-B220-PE.
7. Lavagem e de centrifugação as células como descreverd no passo 3.3.
8. Volte a suspender as células em 100 ul de tampão FACS, portão CD11c ⁺ e analisar para CDCs (CD11c ⁺ CD11b ⁺ B220 ^{-) e} pDCs (CD11c ⁺ CD11b ^- B220 ^{+) 17.}

Resultados

Um total de ⁷ 4-6x10 células de MO são tipicamente isoladas a partir de fémures e tíbias de um 6-8 semanas de idade, de tipo selvagem C57BL / 6 mouse. Para resolver CLPs, células totais BM estão manchadas com anticorpos PE-conjugada contra marcadores de linhagem (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, GR-1, Thy1.1, NK1.1, Ter119, e MHC-II), anti -C-PerCP-Kit / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC e anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analisadas e classificadas com um classificador de células. A estratégia de triagem para...

Discussão

Aqui, descrevemos um sistema de cultura in vitro para a geração robusta de DCs, e pDCs em particular, a partir de um pequeno número de CLPs. A singularidade deste sistema de cultura é devido ao uso de AC-6, células de uma linha celular de estroma, como alimentadores. Esta abordagem tem sido mostrado para fornecer não só as citocinas, tais como IL-7, SCF, M-CSF e FL ^20, mas também o contacto célula-célula ^21, necessário para suportar o desenvolvimento DC. AC-6 células têm sido ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5	Biolegend	108408	linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136	Biolegend	108708	linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70	Biolegend	101208	linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3	Biolegend	115508	linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2	Biolegend	103208	linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2	Biolegend	100308	linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7	Biolegend	100707	linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4	Biolegend	107608	linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119	Biolegend	116208	linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51	eBioscience	12-0900-83	linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98	Biolegend	135510	FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8	Biolegend	105824	FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7	Biolegend	108106	FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34	Biolegend	135014	FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418	Biolegend	117328	FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70	Biolegend	101206	FACS
FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
FACS sorting tube	BD Biosciences	352054
FlowJo	FlowJo LLC		Flow analysis sofrware