从鼠耳和尾组织生成主成纤维细胞培养

摘要

我们描述用于产生从耳朵和小鼠的尾部的成纤维细胞初级一个简单而快速的实验程序。该过程不需要特殊的动物训练和可用于成纤维细胞培养的产生从存储在RT至10天耳朵。

摘要

原代细胞是直接从组织来源和被认为是更具有代表性的细胞在体内比建立的细胞系的生理状态。然而，原代细胞培养，通常具有有限的寿命，需要频繁重新建立。成纤维细胞是原代细胞的一个方便的来源。在这里，我们讨论一个简单而快速的实验程序，以建立从耳朵和老鼠尾巴初级成纤维细胞培养。该协议可以用于建立初级成纤维细胞培养从存储在RT至10天耳朵。当协议是经过精心接着，污染物是不太可能发生尽管使用储存延长的时间在某些情况下，非无菌的组织。成纤维细胞增殖迅速在培养和接受复制衰老之前可扩展到相当数量。

引言

主细胞来源于体外条件下活组织进行培养。它通常假设原代细胞更接近生理状态和其原始比永生化或肿瘤细胞系¹的组织的遗传背景。出于这个原因，原代细胞代表用于研究生物学问题^2,3的有用模型。然而，不同于无限增长建立的细胞系，原代细胞最终经历衰老中培养并需要经常重新建立。

常用的原代细胞包括成纤维细胞，上皮细胞，内皮细胞，T细胞，B细胞，骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）和骨髓来源的树突细胞（BMDC）。成纤维细胞通常用作原代细胞培养模型。它们提供超过其他初级细胞关键优势。细胞培养物容易建立，容易地维持和不需要purifica用前，培养细胞。他们有快速的初始扩散和专门的媒体或活化协议没有要求。成纤维细胞可以使用的生物，化学和物理协议^4,5-有效地转染。有一种可能性，以存储耳朵之前建立的细胞培养物达10天室温。成纤维细胞培养有利于胞质突起的可视化和适于重新编程成诱导多能干细胞^{（iPS）6。}

成纤维细胞是结缔组织的重要细胞分泌胶原蛋白和细胞外基质^7。它们所提供的结构框架在许多组织⁸和播放在伤口愈合和组织修复^9,10-必不可少的作用。

在这里，我们描述了一个简单而快速（<4小时）协议来建立从耳朵成纤维细胞培养和小鼠¹¹尾。该协议需要最少的鼠标经验收获组织（相对于其它协议^12,13），并且可以用于建立从存储在介质在RT至10天耳朵培养物。

研究方案

小鼠饲养在无病原体条件符合机构的指导方针，直到安乐死（机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针，在新加坡国立大学和国家咨询委员会的实验动物研究（NACLAR）的指导方针）。

1.鼠标

1. 订购一个鼠标适当的遗传背景。这个协议是基于组织从一个C57BL / 6小鼠衍生的。

2.准备完全培养基

1. 10％胎牛血清（FCS），50μM2-巯基乙醇，100微米的天冬酰胺，2mM谷氨酰胺，1％青霉素，链霉素溶液:通过添加以下组件来罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基准备完全培养基。

3.准备酶溶液

1. 准备在一个15毫升的锥形底部管胶原酶D溶液。
   1. 称取10毫克胶原酶D.迪在4毫升ssolve胶原酶d完成网上平台。
2. 准备在1.7 ml离心管链霉蛋白酶的解决方案。
   1. 称取10毫克链霉的。
   2. 加入5微升的1M Tris缓冲液（pH 8.0）。加入1微升的0.5M EDTA（pH 8.0）中。
   3. 加满494微升无菌水。
   4. 孵育在37℃的水浴中的链霉蛋白酶溶液30分钟。

4.准备胶原酶D-链霉混合（≤2反面）

注意:请在无菌细胞培养罩随后的步骤。

1. 加入250微升链霉蛋白酶溶液至4毫升胶原酶D溶液。
2. 通过0.2微米的针筒式过滤器的胶原酶D-链霉蛋白酶混合物到无菌的15毫升锥形底部管。

5.提取成纤维细胞，从耳朵和尾巴组织

1. 根据相应的制度指引安乐死小鼠。
2. 放置在细胞培养罩蒸压手术器械（剪刀和镊子）。
3. 加入10 mL完全培养基分为两10厘米细胞培养每个菜肴。
4. 切耳（〜1厘米半径）和5厘米的尾巴（从尾部的尖端）的小鼠用剪刀和在无菌50ml锥形底部管孵育5分钟在40毫升70％的乙醇。
5. 风干耳朵和尾巴通过将它们放置在一个开放的10个厘米细胞培养皿在引擎盖5分钟。一旦干燥，如在步骤5.3中所述转印耳和尾件两个培养皿贴上"耳朵"和含有10ml完全培养基"尾巴"。
6. 从耳朵和尾巴用剪刀取下头发。
7. 切耳朵和尾巴成片超过3毫米大小用剪刀小。
8. 转移切割组织进入标有"耳朵"和"尾"1.8毫升冻存管小瓶和补充足够的胶原D-链霉蛋白酶溶液的体积达到1.8 ml刻度的小瓶。
9. P水平花边冻存管瓶在振荡器上，在37℃下摇晃样品以200rpm进行90分钟。
10. 经过90分钟孵化，请从摇床冻存管小瓶，并将小瓶在通风橱中。
11. 加入10 mL完全培养基分为两10厘米细胞培养皿，标有"耳朵"和"尾"每一个，并把一个70微米的细胞过滤的每一道菜。
12. 将被消化的耳朵和尾巴组织在70微米的细胞过滤在步骤5.11编制的相应标记菜肴和强制使用10毫升注射器推杆> 5分钟研磨组织。偶尔摇动细胞过滤培养基中洗细胞出细胞滤网。
13. 移液器从每道菜的细胞悬液到标有"耳朵"和"尾"两个15毫升锥形底管。洗净的菜，过滤与另外10 ml完全介质和介质添加到相应的15毫升锥形底管。
14. 降速细胞悬浮液在580〜xg离心7分钟，并使用冷冻细胞离心机4℃。
15. 除去上清液，加入10 ml完全培养基将细胞沉淀在15毫升的锥形底部管和悬浮细胞。
16. 重复步骤5.14和5.15。

6.培养细胞混合物的

1. 除去上清液。确保细胞沉淀未受干扰。
2. 重悬的细胞在10ml完全培养基和相应混合物添加到标记的"耳朵"和"尾"两个10厘米细胞培养皿。
3. 加10微升两性霉素B溶液（原液:250微克/毫升）的培养。
4. 孵育在湿润的_5％CO 2培养箱细胞在37℃。
5. 在第三天，用含有10微升两性霉素B以除去碎片10 ml的新鲜完全培养基（ 图1和2）替代培养基。

成纤维细胞7次文化

1. WHEN培养达到约70％汇合（3-4培养天）取出介质，并用5毫升无菌1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗细胞。
2. 除去PBS中并加入2毫升无菌1×胰蛋白酶-EDTA溶液到细胞中。
3. 在湿润的_5％CO 2培养箱孵育细胞5分钟，在37℃。
4. 5分钟后，轻轻拍打培养皿，并添加6 ml完全培养基的细胞中。
5. 细胞悬液转移到15毫升锥形底部管和使用冷冻细胞离心机旋转离心管5分钟，在450〜XG和4℃。
6. 除去上清液，并轻轻重新悬浮在5ml完全培养基将细胞沉淀。
7. 种子^2×10 5个细胞中有10厘米细胞培养皿并重复步骤7.1至7.6之前孵育细胞，在37℃在湿润的_5％CO 2培养箱3-4天。

8.准备耳朵装运

注:执行牛逼他在无菌细胞培养罩后续步骤。

1. 根据相应的制度指引安乐死小鼠。
2. 放置蒸压剪刀和镊子进入细胞培养罩。
3. 加入50 ml完全培养基到50毫升锥形底部管。
4. 切割的小鼠用剪刀耳（〜1厘米半径）。
5. 转移耳朵入50ml锥形底部管（如制备步骤3）使用镊子。
6. 在适当的箱海运在室温之前密封50毫升锥形筒底部用封口膜。

结果

来自组织的结果的成纤维细胞的一个显著量组织碎片的提取（ 图1）。在对比组织碎片，纤维母细胞附着到1天，3培养的间组织培养塑料表面。成纤维细胞培养物的培养基可以安全地变更上培养，其中应显著减少在培养（图2）的碎片本水平的3天。的成纤维细胞显示的细长形态和一个清晰可见的细胞质（图1和2）。有丝分裂的细胞应该从培养的第3?...

讨论

在这里，我们提供了一种简单，廉价且快速的实验步骤建立从耳朵和小鼠的尾巴初级成纤维细胞培养物。提取应导致粘附和迅速分裂成纤维细胞内后3天的隔离组织。原代细胞的一个重要的限制是衰老，一个永久生长停滞^15。使用的协议，成纤维细胞培养可传代5-6次之前的成纤维细胞变得衰老，通过细胞的扁平化表示，尺寸增加（2-3倍增加）和故障扩大。

当执行的成纤...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG