마우스 귀와 꼬리 조직에서 생성 차 섬유 아세포 배양

요약

우리는 귀 및 쥐의 꼬리에서 일차 섬유 아세포를 생성하기위한 간단하고 신속한 실험 절차를 설명한다. 절차는 특별한 동물 훈련을 필요로하지 않고, 최대 10 일 동안 실온에서 저장 귀에서 배양 섬유 아세포의 생성을 위해 사용될 수있다.

초록

차 세포는 조직에서 직접 파생 된 설립 세포주에 비해 생체 내에서 세포의 생리 학적 상태를보다 잘 나타내는 것으로 생각된다. 그러나, 일차 세포 배양 물은 일반적으로 제한된 수명을 가지며 빈번하게 재 확립 될 필요가있다. 섬유 아세포는 일차 전지의 쉽게 접근 할 수있는 소스입니다. 여기, 우리가 귀 마우스의 꼬리에서 차 섬유 아세포 문화를 확립하기 간단하고 빠른 실험 절차에 대해 설명합니다. 프로토콜은 최대 10 일 동안 실온에서 저장 귀에서 일차 섬유 아세포 배양을 확립하는데 사용될 수있다. 프로토콜에 따라 신중하게되면 오염은 일부 경우에 장시간 저장된 비 멸균 조직의 사용에도 불구하고 발생하기 어렵다. 섬유 아세포 문화에 빠르​​게 증식과 복제 성 노화가 진행되기 전에 상당한 숫자로 확장 할 수 있습니다.

서문

차 세포는 시험관 조건에서 조직 배양 생활에서 파생됩니다. 그것은 일반적으로 일차 전지가 더 밀접하게 생리 학적 상태와 그들이 불멸 또는 종양 세포 라인 ^1보다 시작된 조직의 유전 적 배경을 닮은 것으로 가정한다. 그 때문에, 일차 세포는 생물학적 질문 ^2,3-을 연구하는데 유용한 모델을 나타낸다. 그러나 무한정 성장 설립 세포 라인과는 달리, 일차 전지는 결국 문화의 노화를 받아야 자주 다시 설정해야합니다.

일반적으로 사용되는 세포는 일차 섬유 아세포, 상피 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 골수 유래 대 식세포 (BMDM) 골수 유래의 수상 세포 (BMDC)를 포함한다. 섬유 아세포는 종종 일차 세포 배양 모델로서 이용된다. 그들은 다른 일차 전지를 통해 주요 장점을 제공합니다. 세포 배양은 쉽게 쉽게 유지, 설립 및 더의 purifica을 필요로하지 않습니다문화 이전에 세포의 기. 그들은 빠른 초기 확산 및 전문 매체 또는 정품 인증 프로토콜에 대한 요구 사항이 있습니다. 섬유 아세포를 효율적으로 생물학적, 화학적, 물리적 ^{프로토콜을} 사용하여 형질 ^4,5- 수있다. 세포 배양을 확립하기 전에 실온에서 최대 10 일 동안 귀를 저장하는 가능성이있다. 섬유 아세포 문화는 세포질 프로세스의 시각화에 도움과 유도 만능 줄기 (IPS) 세포를 ^6으로 재 프로그래밍에 적합하다.

섬유 아세포는 콜라겐 단백질과 세포 외 기질 ^(7)을 분비 결합 조직의 중요한 세포이다. 그들은 여러 조직 ⁸ 구조적 틀을 제공하고 상처 치유 및 조직 수선에 ^9,10- 필수적인 역할을한다.

여기, 우리는 섬유 아세포 귀에서 문화와 마우스 ^(11)의 꼬리를 확립하기 간단하고 빠른 (<4 시간) 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 최소한의 마우스가 필요합니다경험 ^(12,13 다른 프로토콜과 대조적으로) 조직을 수확하는 최대 10 일 동안 실온에서 저장 매체에 귀에서 배양을 확립하는데 사용될 수있다.

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프로토콜

마우스는 euthanization까지 제도적 지침 (기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인 싱가포르 국립 대학과 실험 동물 연구를위한 국가 자문위원회 (NACLAR) 지침)을 준수 무균 상태에서 보관 하였다.

1. 마우스

1. 해당 유전 적 배경 중 하나 마우스를 주문하십시오. 이 프로토콜은 하나의 C57BL / 6 마​​우스 유래의 조직에 기초한다.

완전 배지 2. 준비

1. 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 50 μM 2- 머 캅토 에탄올, 100 μM 아스파라긴, 2 mM의 글루타민, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 로즈웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 배지에하기 성분을 첨가함으로써 완전 배지를 준비한다.

효소 솔루션 3. 준비

1. 15 ML 원뿔 바닥 튜브 콜라게나 D 솔루션을 준비합니다.
   1. 콜라게나 디 디의 10 mg의 무게4 용액에 ssolve 콜라게나 D 완전한 매체.
2. 1.7 ml의 microcentrifuge 관에서 프로 나아 솔루션을 준비합니다.
   1. 프로 나제​​ 10 mg의 무게.
   2. 1 M 트리스 완충액 (pH 8.0)의 5 μl를 추가합니다. 의 0.5 M EDTA (pH 8.0) 1 μl를 추가합니다.
   3. 멸균 물 494 μL와 최고.
   4. 30 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 프로 나제​​ 용액을 부화.

콜라게나 D-프로 나제​​ 믹스 (≤2 꼬리) 4. 준비

참고 : 무균 세포 배양 후드에서 다음 단계를 수행합니다.

1. 콜라게나 D 솔루션의 4 ml의 프로 나제​​ 솔루션의 250 μl를 추가합니다.
2. 멸균 15ml의 원뿔형 바닥 튜브에 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 콜라게나 D-프로 나제​​ 혼합물을 전달한다.

귀와 꼬리 조직에서 섬유 아세포의 5 추출

1. 해당 기관의 지침에 따라 쥐를 안락사.
2. 세포 배양 후드에서 멸균 수술기구 (가위와 집게를) 놓습니다.
3. 두 10cm 세포 배양 접시에 각각 10 ml의에게 완전한 매체를 추가합니다.
4. 귀 (~ 1cm 반경)와 가위와 마우스 (꼬리의 끝에서) 꼬리 5cm를 잘라 멸균 50 ML 원뿔 바닥 튜브에 40 ml의 70 % 에탄올에 5 분 동안 품어.
5. 5 분 동안 후드에서 개방 10cm 세포 배양 접시에 배치하여 공기 건조 귀와 꼬리. 일단 단계 5.3에 설명 된대로 전송 귀 두 개의 배양 접시에 꼬리 조각은 "귀"를 10 ml의에게 완전한 매체를 포함하는 "꼬리"를 표시, 건조.
6. 귀와 꼬리 사용하여 가위로 머리를 제거합니다.
7. 가위를 사용하여 크기가 3mm보다 작은 조각으로 귀와 꼬리를 잘라.
8. "귀"와 "꼬리"라고 표시된 1.8 ml의 cryotube 튜브로 절단 된 조직을 전송하고 유리 병에 1.8 ml의 마크에 도달하기 위해 볼륨에 대한 충분한 콜라게나 D-프로 나제​​ 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
9. 피쉐이커에 수평으로 cryotube 튜브를 레이스와 37 ℃에서 90 분 동안 200 rpm으로 샘플을 흔들.
10. 90 분 부화 후, 진탕 기에서 cryotube 튜브를 제거하고 후드에 튜브를 배치합니다.
11. 두 10cm 세포 배양 접시, 표시 "귀"와 "꼬리"각에 10 ml의에게 완전한 매체를 추가하고 각 접시에 70 μm의 셀 스트레이너를 넣어.
12. > 5 분 10 ML의 주사기 플런저를 사용하여 조직을 분쇄 강제 단계 5.11에서 제조 된 따라 표시된 요리에 70 μm의 셀 스트레이너의 소화 귀와 꼬리 조직을 놓고. 셀 스트레이너에서 세포를 씻어 매체에 가끔 셀 스트레이너를 흔들어.
13. "귀"와 "꼬리"라는 레이블이 붙은 두 개의 15 ML 원뿔 바닥 튜브에 각각의 접시에서 세포 현탁액을 피펫. 추가로 10 ml의 완전한 매체와 요리와 스트레이너를 세척하고 해당 15 ML 원뿔 바닥 튜브에 매체를 추가 할 수 있습니다.
14. 세포를 스핀 다운~ 580 XG에 7 분 및 냉장 세포 원심 분리기를 사용하여 4 ° C의 서스펜션.
15. 상등액을 제거 15ml의 원뿔형 바닥 튜브에 세포 펠렛을 10 ㎖를 완전 배지를 추가하고 세포를 재현 탁.
16. 단계를 반복 5.14 및 5.15.

세포 혼합물 6. 배양

1. 상층 액을 제거합니다. 세포 펠렛은 그대로 남아 있는지 확인합니다.
2. 10ml에 세포 전체 매체를 다시 일시 중지하고 "귀"와 "꼬리"라는 레이블이 10cm 세포 배양 접시에 각각의 혼합물을 추가합니다.
3. 문화 : 10 μL 암포 테리 신 B 용액 (250 μg의 / ㎖ 원액)를 추가합니다.
4. 가습 5 % CO2 _{인큐베이터에서} 37 ℃에서 세포를 배양한다.
5. 셋째 날, 10 ml의 신선한 완전한 파편 제거 암포 테리 신 B의 10 μl를 포함하는 매체 (그림 1, 2)와 매체를 교체합니다.

섬유 아세포의 7 하위 문화

1. 갔지N 문화는 약 70 % 컨 플루 (일 문화의 3 ~ 4) 매체를 제거하고 5 ml의 멸균 1X 인산 완충 식염수 (PBS)로 세포를 씻어 도달한다.
2. PBS를 제거하고 세포에 2 ㎖의 멸균 1X 트립신 EDTA 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
3. 가습 5 % CO2 _{인큐베이터에서} 37 ℃에서 5 분 동안 세포를 배양한다.
4. 5 분 후, 부드럽게 배양 접시를 누르고 세포에 6 ml의에게 완전한 매체를 추가합니다.
5. 15ml의 원뿔형 바닥 튜브에 세포 현탁액을 옮기고 냉장 세포 원심 분리기를 사용하여 450 ~ XG, 4 ° C에서 5 분 동안 튜브를 스핀.
6. 상층 액을 제거하고 부드럽게 5 ml의 완전 배지에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
7. 10cm 세포 배양 접시에 시드 2 × ¹⁰⁵ 세포 및 7.6 단계 7.1을 반복하기 전의 3-4일위한 가습 5 % CO2 _{인큐베이터에서} 37 ℃에서 세포를 배양한다.

출하를위한 귀 8. 준비

참고 : T를 수행그는 무균 세포 배양 후드에서 다음 단계.

1. 해당 기관의 지침에 따라 쥐를 안락사.
2. 세포 배양 후드로 멸균 가위와 집게를 놓습니다.
3. 50 ML 원뿔 바닥 튜브에 50 ㎖를 완전 배지를 추가합니다.
4. 가위와 마우스의 귀 (~ 1 센티미터 반경)를 잘라.
5. 사용 집게 (3 단계에서 제조 된) 50 ML 원뿔 바닥 튜브에 귀를 전송합니다.
6. 해당 상자에 실온에서 출하하기 전에 파라 필름으로 50 ML 원뿔 바닥 튜브를 밀봉합니다.

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결과

조직 파편의 상당한 양의 조직 결과에서 섬유 아세포의 추출 (도 1). 조직 파편과는 대조적으로, 섬유 아세포는 1 일, 문화의 3 사이의 조직 배양 플라스틱 표면에 부착. 섬유 아세포 배양 매체는 안전하게 크게 문화 (그림 2)에서 파편 현재의 수준을 감소해야 문화의 3 일에 변경 될 수 있습니다. 섬유 아세포는 가늘고 긴 형태와 명확하게 볼 세포질 (그림 1과 2)를

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토론

여기에서 우리는 귀를 쥐의 꼬리에서 차 섬유 아세포 문화를 확립하기, 간단한 저렴하고 빠른 실험 절차를 제공합니다. 추출은 조직 3 일 후 격리 내에 부착하고 신속하게 분할하는 섬유 아 세포에서 발생한다. 일차 전지의 중요한 한계는 노화, 영구 성장 정지 ^15이다. 섬유 아세포는 노화되기 전에 프로토콜을 사용하여, 섬유 아세포 배양 크기 (2-3 배 증가) 및 확장 오류 증가, 세포의 평탄?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG