Fare Kulak ve Kuyruk Dokular Yaratma İlköğretim Fibroblast Kültürleri

Özet

Bu kulak ve farelerin kuyrukları primer fibroblastlar üretilmesi için basit ve hızlı bir deney prosedürü tarif etmektedir. Prosedür özel hayvan eğitim gerektirmeyen ve 10 gün oda sıcaklığında saklanan kulaklardan fibroblast kültürlerin üretimi için de kullanılabilir.

Özet

Birincil hücreler doku şirketinden elde edilir yerleşmiş hücre hatlarında ve daha etkin in vivo hücre fizyolojik durumu daha iyi temsil olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, birincil hücre kültürleri, genellikle sınırlı bir ömre sahiptir ve sık sık yeniden tesis edilmesi gerekir. Fibroblastlar primer hücre kolay ulaşılabilir bir kaynağıdır. Burada, kulakları ve farelerin kuyrukları primer fibroblast kültürleri kurmak için basit ve hızlı bir deneysel prosedür tartışır. Protokolü için 10 gün süreyle oda sıcaklığında depolanan kulak birincil fibroblast kültürleri oluşturmak için de kullanılabilir. Protokol dikkatle takip edildiğinde, bulaşmalar bazı durumlarda uzun süre saklanan steril olmayan doku kullanımına rağmen ortaya çıkması olası değildir. Fibroblastlar kültürde hızla çoğalırlar ve replikatif yaşlanmayı geçmeden önce önemli sayıda genişletilebilir.

Giriş

Birincil hücreler, in vitro koşullarda doku ve kültüre canlı elde edilir. Genellikle birincil hücreler daha yakından fizyolojik durumu ve ölümsüzleştirilmiş veya tümör hücre çizgileri ¹ den kaynaklandığı doku genetik yapısının benzer olduğu varsayılır. Bu nedenle, birincil hücreler biyolojik sorular ^2,3 eğitimi için yararlı bir model oluşturmaktadır. Ancak, sonsuza kadar büyümesine kurulan hücre hatları aksine, birincil hücreler sonunda kültürdeki yaşlanmayı geçmesi ve sık sık yeniden oluşturulması gerekmektedir.

Yaygın olarak kullanılan birincil hücreler, fibroblastlar, epitel hücreleri, endoteliyel hücreler, T hücreleri, B hücreleri, kemik iliği türevli makrofajlar (BMDM) ve kemik iliği türevli dendritik hücreleri (BMDC) içerir. Fibroblastlar, genellikle birincil hücre kültürü modeli olarak kullanılır. Onlar diğer birincil hücreler üzerinde önemli avantajlar sunuyoruz. Hücre kültürleri kolayca kolayca muhafaza kurulmuş ve hiçbir purifica gerektirirkültür öncesi hücrelerin tion. Onlar, hızlı başlangıç ​​çoğalması ve uzman, orta veya aktivasyon protokolleri için hiçbir şartı var. Fibroblastlar verimli biyolojik, kimyasal ve fiziksel protokolleri ^4,5 ile transfekte edilebilir. Hücre kültürleri kurulmadan önce oda sıcaklığında en fazla 10 gün süreyle kulaklarını saklamak için bir olasılık var. Fibroblast kültürleri sitoplazmik süreçlerin görselleştirme için elverişli ve uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden ⁶ içine yeniden programlanması için uygundur.

Fibroblastlar kollajen proteinleri ve hücre dışı matriks ⁷ salgılayan bağ dokusunun önemli hücreleridir. Bunlar birçok dokuda ⁸ yapısal çerçeve sağlar ve yara iyileşmesi ve doku ^{onarımı, 9,10} önemli bir rol oynar.

Burada, biz fibroblast kulaklar kültür ve farelerin ¹¹ kuyrukları kurmak için basit ve hızlı bir (<4 saat) protokol açıklar. Protokol minimal fare gerektirirdeneyimi (diğer protokollere ^12,13 aksine) dokular hasat ve 10 gün oda sıcaklığında ortamında saklanır kulak kültürleri oluşturmak için de kullanılabilir.

Protokol

Fareler euthanization kadar kurumsal rehberlere (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) kılavuzların Singapur Ulusal Üniversitesi ve Laboratuar Hayvan Araştırmaları Ulusal Danışma Komitesi (NACLAR) kurallar) ile uyumlu patojen içermeyen koşullar yerleştirildiler.

1. Fare

1. Uygun genetik arka plan bir fare sipariş edin. Bu protokol, tek bir C57BL / 6 fareden alınmış dokuda dayanır.

Tam Orta 2. Hazırlık

1. % 10 fetal buzağı serumu (FCS), 50 uM 2-merkaptoetanol, 100 uM asparagin, 2 mM glutamin,% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamı aşağıdaki bileşenlerin eklenmesiyle tam orta hazırlayın.

Enzim Çözümleri 3. Hazırlık

1. 15 ml konik alt tüp içinde kollajenaz D çözeltisi hazırlayın.
   1. Kollajenaz D. Di 10 mg tartılır4 ml ssolve kolajenaz D komple ortam.
2. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde Pronaz çözelti hazırlayın.
   1. Pronaz 10 mg tartılır.
   2. 1 M Tris tamponu (pH 8.0) 5 ul ekleyin. 0.5 M EDTA (pH 8.0) 1 ul ekleyin.
   3. Steril su 494 ul ile doldurun.
   4. 30 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C 'de Pronaz çözelti inkübe edin.

Kollajenaz D-Pronase Mix (≤2 kuyrukları) 4. hazırlanması

Not: Steril bir hücre kültürü kaputu sonraki adımları gerçekleştirin.

1. Kolajenaz D solüsyonu 4 ml Pronaz çözeltisi 250 ul ekle.
2. Steril bir 15 ml'lik konik tabanlı tüp içine 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir kolajenaz D-Pronaz karışımı geçirin.

Kulak ve Kuyruk Dokular Fibroblast 5. Ekstraksiyon

1. Uygun kurumsal kurallarına göre fareler Euthanize.
2. Hücre kültürü kaputu otoklava cerrahi aletler (makas ve forseps) yerleştirin.
3. Iki adet 10 cm hücre kültür tabaklarında her birine 10 ml tam orta ekleyin.
4. Kulakları (yaklaşık 1 cm çapında) ve makasla bir fare (kuyruk ucundan) kuyruk 5 cm kesin ve steril bir 50 ml konik bir tüp içinde 40 taban 70 ml etanol içinde% 5 dakika boyunca inkübe edin.
5. 5 dakika boyunca kaputu açık 10 cm hücre kültürü çanak yerleştirerek hava kuru kulakları ve kuyruğu. Bir kez aşama 5,3 de tarif edildiği gibi aktarım kulak ve iki kültür tabaklarına kuyruk parçaları "kulaklar" ve 10 ml komple ortam içeren "kuyruk" etiketli, kurutulmuştur.
6. Kulakları ve kuyruğu kullanarak makas saç çıkarın.
7. Makas kullanılarak boyutu 3 mm'den küçük parçalar halinde kulakları ve kuyruğu kesti.
8. "Kulakları" ve "kuyruk" etiketli 1.8 ml cryotube viyallere kesilmiş dokuları aktarın ve flakon 1.8 ml işaretine ulaşmak için hacim için yeterli kollajenaz D-Pronase çözüm ekleyin.
9. Pbir çalkalayıcı üzerinde yatay olarak cryotube şişeleri dantel ve 37 ° C 'de 90 dakika boyunca 200 rpm'de örnekleri sallayın.
10. 90 dakika inkübasyondan sonra, çalkalayıcı gelen cryotube şişeleri kaldırmak ve kaputu şişeleri yerleştirin.
11. İki 10 cm hücre kültürü yemekleri, etiketli "kulaklar" ve "kuyruk" her birine 10 ml tam orta ekleyin ve her yemeğin içinde 70 mikron hücre süzgeç koyun.
12. > 5 dakika boyunca 10 ml şırınga pistonu kullanarak dokuları eziyet zorla aşama 5.11 hazırlanan buna göre etiketlenmiş yemekleri 70 mikron hücre süzgecinden sindirilmiş kulak ve kuyruk dokuları yerleştirin ve. Hücre süzgecinden dışına hücreleri yıkamak için orta bazen hücre süzgeç sallayın.
13. "Kulaklar" ve "kuyruk" etiketli iki 15 ml konik alt tüpleri içine her yemeğin hücre süspansiyonu pipetle. Ek 10 ml tam orta çanak ve süzgeci yıkayın ve uygun 15 ml konik alt tüplerine orta ekleyin.
14. Hücreyi Spin~ 580 xg 7 dakika ve bir buzdolabında hücre santrifüj kullanılarak 4 ° C süspansiyon.
15. Süpernatantı 15 ml konik alt tüp hücre pelet 10 ml tam orta ekleyin ve hücreleri tekrar süspansiyon.
16. Adımı yineleyin 5.14 ve 5.15.

Hücre Karışımı 6. Kültürleme

1. Süpernatantı. Hücre topağı kesintisiz olmasını sağlamak.
2. 10 ml hücreleri tam orta yeniden askıya ve "kulaklar" ve "kuyruk" etiketli iki 10 cm hücre kültürü yemekleri için ilgili karışımı ekleyin.
3. Kültür: 10 ul amfoterisin B çözeltisi (250 mg / ml stok çözelti) eklenir.
4. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
5. Üçüncü gün, 10 mi taze tamamlanmış artığın ayrılması için amfoterisin B için 10 ul ihtiva eden ortam (Şekil 1 ve 2) ile orta değiştirin.

Fibroblast 7. Alt kültür

1. When kültürü yaklaşık% 70 ortak akışkanlığa (günlük kültür 3-4) orta kaldırmak ve 5 ml steril 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkama hücreleri ulaşır.
2. PBS çıkarın ve hücreleri 2 ml steril 1 x tripsin-EDTA çözeltisi ilave edilir.
3. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe hücreleri.
4. 5 dakika sonra, yavaşça kültürü çanak dokunun ve hücrelere 6 ml tam orta ekleyin.
5. 15 ml konik bir alt tüp hücre süspansiyonu aktarın ve soğutulmuş bir hücre santrifüj kullanılarak ~ 450 xg ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca tüp spin.
6. Süpernatantı ve yavaşça 5 ml tam orta hücre pelet yeniden askıya.
7. 10 cm hücre kültür kaplarına Tohum 2 x 10 ⁵ hücre ve 7.6 arasındaki adımları 7.1 tekrarlamadan önce 3-4 gün boyunca nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe hücreleri.

Gönderi için Kulaklar 8. Hazırlık

Not: t gerçekleştirO steril hücre kültürü kaputu sonraki adım.

1. Uygun kurumsal kurallarına göre fareler Euthanize.
2. Hücre kültürü kaputu içine otoklava makas ve forseps yerleştirin.
3. 50 ml'lik konik tabanlı tüp içine 50 mL tam orta ekleyin.
4. Makasla bir fare kulakları (~ 1 cm çapında) kesin.
5. Forseps kullanarak (aşama 3'te hazırlanan gibi) 50 ml konik taban tüpü içine kulaklar aktarın.
6. Uygun bir kutuda oda sıcaklığında göndermeden önce parafilm 50 ml konik alt tüp Seal.

Sonuçlar

Doku çöküntüsü önemli bir miktarda doku sonuçlarından fibroblast ekstraksiyonu (Şekil 1). Doku çöküntüsü aksine, fibroblastlar gün 1 ve kültür 3 arasında doku kültürü plastik yüzeylere yapışır. Fibroblast kültürlerinde orta güvenle anlamlı kültür (Şekil 2) enkaz mevcut seviyelerini azaltmak gerektiğini kültür, günü 3 değiştirilebilir. Fibroblastlar bir ince uzun morfoloji ve net bir şekilde görülebilen sitoplazma (Şekil 1 ve

Tartışmalar

Burada kulakları ve farelerin kuyrukları primer fibroblast kültürleri kurmak için, basit, ucuz ve hızlı bir deneysel prosedür sağlar. Ekstraksiyon doku 3 gün sonra izole olan yapışık ve hızlı bölünen fibroblastlar ile sonuçlanmalıdır. Primer hücrelerin önemli bir sınırlama yaşlanması, kalıcı bir büyüme tutuklama ^15'dir. Fibroblastlar yaşlanmış hale gelmeden önce protokolü kullanarak, fibroblast kültürleri boyutu (3/2 katı artış) ve genişletmek için başarısızlı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG