Создание первичного фибробластов Культуры с уха мыши и хвост тканей

Резюме

Опишем простой и быстрый экспериментальную процедуру для генерации первичных фибробластов из ушей и хвостов мышей. Процедура не требует специальной подготовки животных и может быть использован для генерации фибробластов культур от ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней.

Аннотация

Первичные клетки получают непосредственно из тканей и, как считается, более представительным физиологического состояния клеток в естественных условиях, чем установленные клеточных линий. Тем не менее, первичных клеточных культур, как правило, имеют конечный срок службы, и их необходимо часто восстановлена. Фибробласты легко доступным источником первичных клеток. Здесь мы обсудим простой и быстрый экспериментальную процедуру, чтобы установить первичные культуры фибробластов из ушей и хвостов мышей. Протокол может быть использован для установления первичных культур фибробластов из ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней. Когда протокол внимательно следил, загрязнения, вряд ли произойдет, несмотря на использование нестерильных ткани хранится в течение длительного времени в некоторых случаях. Фибробласты быстро размножаются в культуре и может быть расширена до значительного числа перед прохождением репликативной старение.

Введение

Первичные клетки получают из живой ткани, и культивируют при условиях в пробирке. Это, как правило, предполагается, что первичные клетки больше напоминают физиологическое состояние и генетический фон ткани, из которой они возникли, чем иммортализованных или опухолевых клеточных линий ^1. По этой причине, первичные клетки представляют собой полезную модель для изучения биологического вопросы ^2,3. Однако, в отличие установленных клеточных линий, которые растут на неопределенный срок, в конце концов, первичные клетки претерпевают старение в культуре, и необходимо часто восстановлена.

Обычно используемые первичные клетки включают фибробласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, Т-клетки, В-клетки, костный мозг, полученный макрофаги кости (BMDM) и костного мозга дендритные клетки кости (BMDC). Фибробласты часто используют в качестве модели первичной культуре клеток. Они предлагают основные преимущества по сравнению с другими первичными клетками. Клеточные культуры легко устанавливаются, легко поддерживается и не требуют purificaние клеток, предшествующих культуры. Они имеют быструю первоначальную пролиферацию и не требование для специализированных протоколов среднего или активации. Фибробласты могут быть эффективно трансфецировали использованием биологического, химического и физического протоколы ^4,5. Существует возможность сохранять уши до 10 дней при комнатной температуре до установления клеточных культур. Фибробластов культур способствуют визуализации цитоплазматических процессов и подходит для перепрограммирования в индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток ^6.

Фибробласты являются важными клетками соединительной ткани, которые секретируют коллаген протеины и внеклеточный матрикс ^7. Они обеспечивают структурную основу во многих тканях ^{8 и} играют важную роль в заживлении ран и восстановления тканей ^9,10.

Здесь мы опишем простой и быстрый (<4 ч) протокол о создании фибробластов культур из ушей и хвостов мышей ^11. Протокол требует минимального мышьопыт урожай тканей (в отличие от других протоколов ^12,13) ​​и может быть использован для установления культур из ушей, хранящихся в среде при комнатной температуре в течение до 10 дней.

протокол

Мышей содержали в свободных от патогенов условиях в соответствии с институциональными принципов вплоть до euthanization (институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) руководящих принципов в Национальном университете Сингапура и Национального консультативного комитета лабораторных животных исследований (NACLAR) руководящих принципов).

1. Мыши

1. Заказать одну мышь соответствующего генетического фона. Этот протокол основан на ткани, полученной от одного C57BL / 6 мыши.

2. Подготовка полной среде

1. Подготовка полной среды путем добавления следующих компонентов для Roswell Park Memorial института (RPMI 1640): 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкМ аспарагин, глутамин 2 мМ, 1% пенициллина-стрептомицина раствора.

3. Подготовка растворов фермента

1. Подготовьте коллагеназы D раствора в 15 мл коническую пробирку нижней.
   1. Взвесьте 10 мг коллагеназы Д. Диssolve коллагеназы D в 4 мл полной среды.
2. Подготовка проназой решение в 1,7 мл микроцентрифужных трубки.
   1. Взвесьте 10 мг проназой.
   2. Добавьте 5 мкл 1 М Трис-буфера (рН 8,0). Добавить 1 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).
   3. Долить 494 мкл стерильной воды.
   4. Инкубируйте проназы раствора при 37 ° С на водяной бане в течение 30 мин.

4. Подготовка Коллагеназа Д-проназой Mix (≤2 хвосты)

Примечание: Выполните последующие шаги в стерильных капот культуре клеток.

1. Добавить 250 мкл раствора проназой 4 мл коллагеназы D раствора.
2. Пропускают коллагеназы D-проназы смесь через шприц 0,2 мкм фильтр в стерильный 15 мл коническую пробирку нижней.

5. Добыча фибробластов от уха и хвост тканей

1. Эвтаназии мышей в соответствии с соответствующими институциональными руководящих принципов.
2. Поместите автоклавного хирургические инструменты (ножницы и пинцет) в капот культуре клеток.
3. Добавить 10 мл полной среды в двух чашки для культивирования клеток 10 см каждый.
4. Сокращение уши (~ 1 см) радиуса и 5 см хвост (от кончика хвоста) мыши с ножницами и инкубировать в течение 5 мин в 40 мл 70% этанола в 50 мл стерильной коническим днищем трубки.
5. Воздушно-сухой уши и хвост, помещая их в открытом 10 см клеточной культуры блюдо в капюшоне в течение 5 мин. После сушки передачи уха и хвост штук в двух культуральных чашках помечены "уши" и "хвост", содержащий 10 мл полной среды, как описано в шаге 5.3.
6. Удалить волосы из ушей и хвоста с помощью ножниц.
7. Вырезать уши и хвост на куски меньше, чем 3 мм в размере, используя ножницы.
8. Перевести нарезанные ткани в 1,8 мл флаконах криоскопической меченых "уши" и "хвост" и добавить достаточно коллагеназы решение D-проназой по объему, чтобы достичь 1,8 мл знак на флаконе.
9. пшнурок криоскопической флаконы по горизонтали на шейкере и встряхивают образцов при 200 оборотов в минуту в течение 90 мин при 37 ° С.
10. Через 90 мин инкубации, удалить криоскопической флаконы из шейкера и поместите флаконы в капюшоне.
11. Добавить 10 мл полной среды в двух 10 см чашки для культивирования клеток, меченных "уши" и "хвост" друг, и положить 70 мкм ячейки фильтра в каждом блюде.
12. Поместите усваивается уха и хвост ткани в 70 мкм ячейки фильтра в соответственно меченных блюд, приготовленных на стадии 5.11 и сильно растереть тканей с использованием 10 мл шприца для> 5 мин. Встряхнуть клеток фильтр иногда в среде мыть клетки из ячейки фильтра.
13. Внесите суспензии клеток с каждого блюда в два 15 мл конических нижних труб помеченных "уши" и "хвост". Вымойте блюдо и фильтр с дополнительными 10 мл полной среды и добавить среду в соответствующие 15 мл конических нижних труб.
14. Спин вниз ячейкуСуспензию в течение 7 минут при температуре ~ 580 мкг и 4 ° С с использованием охлажденного клеток центрифуги.
15. Удалить супернатант, добавить 10 мл полной среды к осадку клеток в 15 мл коническую нижнюю трубки и клетки вновь суспендируют.
16. Повторите шаг 5.14 и 5.15.

6. Культивирование клеточной смеси

1. Удалить супернатант. Убедитесь, что клеточный осадок остается нетронутой.
2. Повторное приостановить клеток в 10 мл полной среды и добавить соответствующую смесь двух 10 см чашки для культивирования клеток, меченных "уши" и "хвост".
3. Добавьте 10 мкл раствора амфотерицина В (исходный раствор: 250 мкг / мл) в культуру.
4. Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной _5% CO 2 инкубаторе.
5. На третий день, заменить жидкость с 10 мл свежей полной среды, содержащей 10 мкл амфотерицина для удаления мусора (фиг.1 и 2).

7. Суб-культуры фибробластов

1. Wheп культура достигает около 70% слияния (3-4 культуры день) удаления носителя и промыть клетки с 5 мл стерильного 1x фосфатным буферным раствором (PBS).
2. Удалить PBS и добавить 2 мл стерильной 1x решение трипсина-EDTA к клеткам.
3. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 ° С в увлажненной _5% CO 2 инкубаторе.
4. Через 5 мин, осторожно нажмите культуры блюдо и добавить 6 мл полной среды к клеткам.
5. Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую пробирку и нижней спина трубки в течение 5 мин при температуре ~ 450 мкг и 4 ° С с использованием охлажденного клеток центрифуги.
6. Удалить супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок клеток в 5 мл полной среды.
7. Семенной 2 х 10 ⁵ клеток в клеточной культуральной чашке 10 см и инкубируют клетки при 37 ° С в увлажненной _5% CO 2 инкубаторе в течение 3-4 дней до повторяя шаги 7.1 до 7,6.

8. Подготовка к отгрузке уши

Примечание: Выполнение тон последующие шаги в стерильных капот культуре клеток.

1. Эвтаназии мышей в соответствии с соответствующими институциональными руководящих принципов.
2. Поместите автоклавного ножницы и пинцет в капот культуре клеток.
3. Добавить 50 мл полной среды в 50 мл коническую пробирку нижней.
4. Вырезать уши (~ радиус 1 см) мыши с ножницами.
5. Перевести уши в 50 мл коническую трубку нижней (как полученного на стадии 3) с помощью щипцов.
6. Уплотнение 50 мл коническую трубку с нижней парафильмом перед отправкой в ​​РТ в соответствующем поле.

Результаты

Добыча фибробластов ткани приводит к значительному количеству ткани мусора (Рисунок 1). В отличие от ткани мусора, фибробласты придерживаться тканевой культуре пластиковых поверхностей между день 1 и 3 культуры. Среда фибробластов культур может быть безопасно изменены в день 3...

Обсуждение

Здесь мы предлагаем простой, недорогой и быстрый экспериментальную процедуру, чтобы установить первичные культуры фибробластов из ушей и хвостов мышей. Извлечение должно привести к адгезивных и быстро делящихся фибробластах в течение 3 дней после выделения ткани. Важным ограничением...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG