Culturas Generación de fibroblastos primarios de mouse de oreja y rabo tejidos

Resumen

Se describe un procedimiento experimental sencillo y rápido para la generación de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. El procedimiento no requiere una formación especial de los animales y se puede utilizar para la generación de cultivos de fibroblastos de los oídos almacenados a temperatura ambiente durante hasta 10 días.

Resumen

Las células primarias se derivan directamente de tejidos y se cree que son más representativa del estado fisiológico de las células in vivo que las líneas celulares establecidas. Sin embargo, cultivos de células primarias por lo general tienen una vida finita y deben ser restablecido con frecuencia. Los fibroblastos son una fuente fácilmente accesible de células primarias. En este caso, hablamos de un procedimiento experimental simple y rápida para establecer cultivos de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. El protocolo puede ser utilizado para establecer cultivos de fibroblastos primarios de los oídos almacenados a temperatura ambiente durante hasta 10 días. Cuando el protocolo se sigue cuidadosamente, las contaminaciones son poco probable que ocurra a pesar de la utilización de tejido no estéril almacenada por un tiempo prolongado en algunos casos. Los fibroblastos proliferan rápidamente en la cultura y se puede ampliar a un número considerable antes de someterse a la senescencia replicativa.

Introducción

Las células primarias se derivan de tejido y se cultivaron viven bajo condiciones in vitro. Se asume generalmente que las células primarias se asemejan más el estado fisiológico y el fondo genético del tejido del que se derivan de líneas celulares inmortalizadas o tumorales ^1. Por esa razón, las células primarias representan un modelo útil para el estudio de cuestiones biológicas ^2,3. Sin embargo, a diferencia de las líneas celulares establecidas que crecen indefinidamente, células primarias, finalmente, se someten a la senescencia en la cultura y necesitan ser restablecido con frecuencia.

Células primarias comúnmente usados ​​incluyen fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, células T, células B, macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) y células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC). Los fibroblastos se utilizan a menudo como modelo de cultivo celular primario. Ofrecen ventajas clave sobre otras células primarias. Los cultivos celulares son fáciles de establecer, fácilmente mantenido y no requieren Purificación de las células antes de la cultura. Tienen rápida proliferación inicial y sin necesidad de protocolos de medio o de activación especializados. Los fibroblastos se pueden transfectar eficientemente usando biológicos, químicos, físicos y protocolos de ^4,5. Hay una posibilidad de almacenar oídos por hasta 10 días a temperatura ambiente antes de establecer cultivos celulares. Cultivos de fibroblastos son propicias para la visualización de los procesos citoplásmicos y adecuado para la reprogramación en células madre pluripotentes inducidas (iPS) ^6.

Los fibroblastos son células importantes del tejido conectivo que secretan las proteínas de colágeno y matriz extracelular ^7. Ellos proporcionan el marco estructural en muchos tejidos ⁸ y juegan un papel esencial en la curación de heridas y reparación de tejidos ^9,10.

A continuación, describimos una (<4 h) Protocolo simple y rápida para establecer cultivos de fibroblastos de las orejas y la cola de los ratones ^11. El protocolo requiere un mínimo de ratónexperiencia para la cosecha de los tejidos (en contraste con otros protocolos ^12,13) ​​y se puede utilizar para establecer cultivos de oídos almacenados en un medio a temperatura ambiente durante hasta 10 días.

Protocolo

Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos en el cumplimiento de las directrices institucionales hasta la eutanasia (El Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) directrices de la Universidad Nacional de Singapur y el Comité Nacional Asesor para el Laboratorio de Investigación Animal (NACLAR) directrices).

1. Los ratones

1. Ordene un ratón del fondo genético apropiado. Este protocolo se basa en el tejido derivado de un ratón C57BL / 6.

2. Preparación de medio completo

1. Preparar medio completo mediante la adición de los siguientes componentes a Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640: 10% de suero de ternera fetal (FCS), 50 mM 2-mercaptoetanol, 100 mM de asparagina, glutamina 2 mM, solución de penicilina-estreptomicina al 1%.

3. Preparación de soluciones de enzima

1. Prepare la solución de colagenasa D en un tubo de fondo cónico de 15 ml.
   1. Pesar 10 mg de colagenasa D. Dissolve colagenasa D en 4 ml de medio completo.
2. Prepare la solución de pronasa en un tubo de 1,7 ml de microcentrífuga.
   1. Pesar 10 mg de pronasa.
   2. Añadir 5 l de tampón Tris 1 M (pH 8,0). Añadir 1 l de 0,5 M EDTA (pH 8,0).
   3. Rellene con 494 l de agua estéril.
   4. Incubar la solución de pronasa a 37 ° C en un baño de agua durante 30 minutos.

4. Preparación de colagenasa D-pronasa Mix (≤2 colas)

Nota: Realice los pasos siguientes en una campana de cultivo celular estéril.

1. Añadir 250 l de solución de pronasa a 4 ml de solución de colagenasa D.
2. Pasar la colagenasa-D pronasa mezcla a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras en un tubo de fondo cónico de 15 ml estéril.

5. Extracción de fibroblastos de oreja y rabo tejidos

1. La eutanasia a los ratones de acuerdo con las directrices institucionales apropiados.
2. Coloque autoclave instrumentos quirúrgicos (tijeras y pinzas) en la campana de cultivo celular.
3. Añadir 10 ml de medio completo en dos platos de 10 cm de cultivo de células cada uno.
4. Cortar las orejas (~ 1 cm de radio) y 5 cm de la cola (de la punta de la cola) de un ratón con tijeras y se incuba durante 5 min en etanol 40 ml 70% en un tubo de fondo cónico de 50 ml estéril.
5. Oídos Aire seco y cola colocándolos en una abierta 10 cm placa de cultivo celular en la campana durante 5 min. Una vez secas, oído transferencia y piezas de la cola a dos placas de cultivo etiquetados "orejas" y "cola" que contiene 10 ml de medio completo como se describe en el paso 5.3.
6. Quitar el pelo de las orejas y la cola con unas tijeras.
7. Cortar orejas y rabo en trozos más pequeños de 3 mm de tamaño con unas tijeras.
8. Transferir los tejidos cortados en 1,8 ml viales criotubo etiquetados "orejas" y "cola" y añadir la solución D-pronasa suficiente de colagenasa para el volumen para alcanzar la marca de 1,8 ml en el frasco.
9. Pata los viales criotubo horizontalmente en una coctelera y agitar las muestras a 200 rpm durante 90 minutos a 37 ° C.
10. Después de 90 minutos de incubación, retire los viales criotubo de la coctelera y colocar los viales en el capó.
11. Añadir 10 ml de medio completo en dos 10 cm placas de cultivo de células, etiquetados "oídos" y "cola" cada uno, y poner un filtro de 70 micras de células en cada plato.
12. Coloca los tejidos del oído y de la cola digeridos en el colador de 70 micras de células en los platos en consecuencia etiquetados preparados en el paso 5.11 y con fuerza moler los tejidos utilizando una jeringa de émbolo 10 ml durante> 5 min. Agite el filtro de células de vez en cuando en el medio para lavar las células del filtro de células.
13. Pipetear la suspensión de células de cada plato en tubos de fondo dos 15 ml cónicos etiquetados "orejas" y "cola". Lave el plato y el colador con otros 10 ml de medio completo y añadir el medio a los tubos de fondo cónico de 15 ml apropiadas.
14. Centrifugar la célulasuspensión durante 7 min a 580 xg y ~ 4 ° C utilizando una centrífuga refrigerada celular.
15. Aspirar el sobrenadante, añadir 10 ml de medio completo al sedimento celular en los 15 ml de tubo de fondo cónico y resuspender las células.
16. Repita el paso 5.14 y 5.15.

6. Cultivo de mezcla de células

1. Eliminar el sobrenadante. Asegúrese de que el sedimento celular se mantiene inalterado.
2. Vuelva a suspender las células en 10 ml de medio completo y añadir la mezcla correspondiente a dos placas de cultivo celular de 10 cm etiquetados "orejas" y "cola".
3. Añadir 10 l solución de anfotericina B (solución madre: 250 mg / ml) a la cultura.
4. Se incuban las células a 37 ° C en un humidificado 5% de CO ₂ incubadora.
5. En el tercer día, sustituir el medio con medio completo fresco que contiene 10 ml 10 l de anfotericina B para eliminar los residuos (Figuras 1 y 2).

7. Sub-cultivo de fibroblastos

1. When cultivo alcanza alrededor de 70% de confluencia (día 3-4 de la cultura) se elimina el medio y se lavan las células con solución salina estéril fosfato 5 ml 1x tamponada (PBS).
2. Retirar PBS y añadir 2 ml de solución de tripsina-EDTA 1x estéril a las células.
3. Se incuban las células durante 5 min a 37 ° C en un humidificado 5% de CO ₂ incubadora.
4. Después de 5 minutos, toque suavemente la placa de cultivo y añadir 6 ml de medio completo a las células.
5. Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml de fondo cónico y girar el tubo durante 5 min a 450 xg y ~ 4 ° C utilizando una centrífuga refrigerada celular.
6. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento de células en 5 ml de medio completo.
7. Semilla 2 x 10 ⁵ células en una placa de 10 cm de cultivo celular y se incuban las células a 37 ° C en un humidificado 5% de CO ₂ incubadora durante 3-4 días antes de repetir los pasos 7.1 a 7.6.

8. Preparación de Orejas para Embarque

Nota: Realice tque los pasos subsiguientes en una campana de cultivo celular estéril.

1. La eutanasia a los ratones de acuerdo con las directrices institucionales apropiados.
2. Coloque las tijeras y fórceps autoclave a la campana de cultivo celular.
3. Añadir 50 ml de medio completo en un tubo de fondo cónico de 50 ml.
4. Cortar orejas (~ 1 cm de radio) de un ratón con tijeras.
5. La transferencia de los oídos en el tubo de fondo cónico de 50 ml (como se ha preparado en el paso 3) el uso de fórceps.
6. Sellar el tubo inferior 50 ml cónico con parafina antes de enviar a temperatura ambiente en una caja apropiada.

Resultados

Extracción de fibroblastos de resultados de tejidos en una cantidad significativa de restos de tejido (Figura 1). En contraste con restos de tejido, los fibroblastos se adhieren a las superficies de plástico de cultivo de tejido entre el día 1 y 3 de la cultura. El medio de cultivos de fibroblastos se puede cambiar de forma segura en el día 3 de la cultura, lo que debería reducir significativamente los niveles de residuos presentes en la cultura (Figura 2). Los fibroblastos muestra...

Discusión

Aquí le ofrecemos un procedimiento experimental simple, barato y rápido para establecer cultivos de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. La extracción debe resultar en fibroblastos en división adherentes y rápidamente dentro de 3 días post-aislamiento del tejido. Una limitación importante de células primarias es la senescencia, una detención del crecimiento permanente ^15. Utilizando el protocolo, cultivos de fibroblastos se pueden pasaron durante 5 a 6 veces antes de fibrobl...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG