Generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo

Riepilogo

Descriviamo una procedura sperimentale semplice e rapido per la generazione di fibroblasti primari dalle orecchie e le code di topi. La procedura non richiede addestramento speciale animali e può essere utilizzato per la generazione di colture di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni.

Abstract

Cellule primarie derivano direttamente dal tessuto e si pensa di essere più rappresentativo dello stato fisiologico delle cellule in vivo di linee cellulari stabilizzate. Tuttavia, colture cellulari primarie di solito hanno una durata di vita limitata e devono essere frequentemente ristabilita. I fibroblasti sono una fonte facilmente accessibile di cellule primarie. Qui, si discute una procedura semplice e rapida sperimentale di stabilire colture di fibroblasti primari da orecchie e le code di topi. Il protocollo può essere utilizzato per stabilire colture primarie di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni. Quando il protocollo è attentamente seguita, contaminazioni sono improbabili nonostante l'uso di tessuti non sterile immagazzinato per tempo prolungato in alcuni casi. I fibroblasti proliferano rapidamente in coltura e possono essere espanse per un numero considerevole prima di subire la senescenza replicativa.

Introduzione

Cellule primarie sono derivati ​​da tessuti e coltivate che vivono in condizioni in vitro. Si ritiene generalmente che le cellule primarie avvicinano maggiormente lo stato fisiologico e background genetico del tessuto da cui sono derivati ​​di linee cellulari immortalizzate o tumorali ^1. Per questo motivo, cellule primarie rappresentano un modello utile per studiare le domande biologica ^2,3. Tuttavia, a differenza di linee cellulari stabilizzate che crescono indefinitamente, pile infine subiscono senescenza nella cultura e devono essere frequentemente ristabilita.

Pile comunemente usati includono fibroblasti, cellule epiteliali, cellule endoteliali, cellule T, cellule B, i macrofagi del midollo osseo (BMDM) e le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BMDC). I fibroblasti sono spesso utilizzati come cellula primaria modello di coltura. Essi offrono vantaggi chiave rispetto ad altre cellule primarie. Le colture cellulari sono facilmente stabiliti, prontamente mantenuto e non richiedono purificazione di cellule precedenti alla cultura. Hanno rapida proliferazione iniziale e nessun requisito per i protocolli di media o di attivazione specializzate. I fibroblasti possono essere efficacemente trasfettate utilizzando protocolli fisici ^4,5 biologici, chimici, e. C'è la possibilità di memorizzare le orecchie fino a 10 giorni a temperatura ambiente, prima di stabilire colture cellulari. Colture di fibroblasti sono favorevoli alla visualizzazione dei processi citoplasmatici e adatto per la riprogrammazione in staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule ^6.

I fibroblasti sono importanti cellule del tessuto connettivo che secernono proteine ​​collagene e della matrice extracellulare ^7. Essi costituiscono il quadro strutturale in molti tessuti ⁸ e svolgono un ruolo fondamentale nella guarigione delle ferite e la riparazione dei tessuti ^9,10.

Qui, descriviamo un protocollo (4 ore <) semplice e veloce per creare colture di fibroblasti da orecchie e le code di topo ^11. Il protocollo richiede una minima del mouseesperienza per raccogliere i tessuti (a differenza di altri protocolli ^12,13) ​​e può essere utilizzato per stabilire culture di orecchie memorizzati nel mezzo a temperatura ambiente per 10 giorni.

Protocollo

I topi sono stati alloggiati in condizioni di assenza di patogeni in conformità con le linee guida istituzionali fino euthanization (La cura istituzionale degli animali e del Comitato uso (IACUC) le linee guida presso l'Università Nazionale di Singapore e del Comitato consultivo nazionale per Research Laboratory Animal (NACLAR) le linee guida).

1. Topi

1. Ordinare un mouse del background genetico appropriato. Questo protocollo è basato sul tessuto derivato da uno C57BL / 6 del mouse.

2. Preparazione del terreno completo

1. Preparare terreno completo aggiungendo le seguenti componenti al Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640: siero fetale bovino al 10% (FCS), 50 mM 2-mercaptoetanolo, 100 micron asparagina, glutammina 2 mM, soluzione di penicillina-streptomicina 1%.

3. Preparazione di enzima Solutions

1. Preparare la soluzione collagenasi D in un tubo da 15 ml fondo conico.
   1. Pesare 10 mg di collagenasi D. Dissolve collagenasi D in 4 ml di terreno completo.
2. Preparare la soluzione pronasi in una provetta 1,7 ml microcentrifuga.
   1. Pesare 10 mg di Pronasi.
   2. Aggiungere 5 ml di 1 M tampone Tris (pH 8,0). Aggiungere 1 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0).
   3. Rabboccare con 494 ml di acqua sterile.
   4. Incubare la soluzione pronase a 37 ° C a bagnomaria per 30 minuti.

4. Preparazione di Collagenasi D-pronasi Mix (≤2 Tails)

Nota: Eseguire le fasi successive in una cappa sterile coltura cellulare.

1. Aggiungere 250 microlitri di soluzione pronase a 4 ml di soluzione di collagenasi D.
2. Passare il composto collagenasi D-pronasi attraverso un filtro siringa da 0,2 micron in una sterile 15 ml tubo fondo conico.

5. Estrazione di fibroblasti da tessuti dell'orecchio e coda

1. Euthanize topi secondo le linee guida istituzionali appropriate.
2. Mettere in autoclave chirurgici strumenti (forbici e pinze) nel cofano coltura cellulare.
3. Aggiungere 10 ml di terreno completo in due 10 cm piatti di coltura di cellule ciascuno.
4. Tagliare orecchie (~ 1 cm raggio) e 5 cm di coda (dalla punta della coda) di un topo con le forbici e incubare per 5 minuti in 40 ml di etanolo 70% in una provetta sterile da 50 ml a fondo conico.
5. Orecchie con aria secca e la coda di collocarli in un 10 centimetri piatto di coltura cellulare aperta nel cappuccio per 5 min. Una volta essiccati, trasferimento orecchio e pezzi di coda a due piatti della cultura etichettati "orecchie" e "coda" che contiene 10 ml di terreno completo come descritto al punto 5.3.
6. Eliminare i peli dalle orecchie e forbici coda utilizzando.
7. Tagliare orecchie e la coda in pezzi più piccoli di 3 mm di dimensioni con le forbici.
8. Trasferire i tessuti tagliati in 1,8 ml fiale cryotube etichettate "orecchie" e "coda" e aggiungere collagenasi sufficiente soluzione D-pronasi per il volume di raggiungere i 1,8 ml sul flacone.
9. Pallacciare le fiale cryotube orizzontalmente su un ed agitare i campioni a 200 rpm per 90 min a 37 ° C.
10. Dopo 90 minuti di incubazione, rimuovere le fiale cryotube dal shaker e posizionare le fiale nella cappa.
11. Aggiungere 10 ml di terreno completo in due 10 cm di colture cellulari piatti, con l'etichetta "orecchie" e "coda" ciascuno, e mettere un filtro 70 micron cella in ogni piatto.
12. Posizionare le orecchie e coda tessuti digeriti nel colino 70 micron cella nei piatti di conseguenza etichettati previste al punto 5.11 e con forza macinare i tessuti con una siringa da 10 ml stantuffo per> 5 min. Agitare il filtro cellule occasionalmente nel mezzo per lavare le cellule fuori del filtro cella.
13. Pipetta la sospensione cellulare da ogni piatto in provette fondo due 15 ml coniche etichettati "orecchie" e "coda". Lavare il piatto e il filtro con l'aggiunta di 10 ml di terreno completo e aggiungere il supporto per le appropriate da 15 ml provette fondo conico.
14. Spin giù la cellasospensione per 7 minuti a 580 xg ~ e 4 ° C utilizzando una centrifuga cella frigorifera.
15. Rimuovere il surnatante, aggiungere 10 ml di mezzo completo per il pellet cellulare in 15 ml tubo fondo conico e risospendere le cellule.
16. Ripetere il passaggio 5.14 e 5.15.

6. Coltura di miscela cellulare

1. Rimuovere il surnatante. Assicurarsi che il pellet di cellule rimane indisturbato.
2. Risospendere le cellule in 10 ml di terreno completo e aggiungere il relativo composto per due 10 cm piatti di coltura di cellule etichettate "orecchie" e "coda".
3. Aggiungere 10 ml soluzione amfotericina B (soluzione madre: 250 mg / ml) per la cultura.
4. Incubare le cellule a 37 ° C in un umidificata al 5% CO ₂ incubatore.
5. Al terzo giorno, sostituire il mezzo con terreno completo contenente 10 ml fresco 10 ml di amfotericina B per rimuovere detriti (figure 1 e 2).

7. Sotto-cultura della fibroblasti

1. Whecultura n raggiunge circa il 70% di confluenza (giorno 3-4 della cultura) rimuovere il supporto e lavare le cellule con 5 ml sterile 1x tampone fosfato salino (PBS).
2. Rimuovere PBS e aggiungere 2 ml di soluzione sterile 1x tripsina-EDTA per le cellule.
3. Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C in un umidificata al 5% CO ₂ incubatore.
4. Dopo 5 minuti, delicatamente toccare il piatto cultura e aggiungere 6 ml di terreno completo alle cellule.
5. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml conica fondo e girare il tubo per 5 minuti a 450 xg ~ e 4 ° C utilizzando una centrifuga cella frigorifera.
6. Rimuovere il surnatante, e delicatamente risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzo completo.
7. Seed 2 x 10 ⁵ cellule in un piatto di coltura cellulare 10 cm e incubare le cellule a 37 ° C in un umidificata al 5% CO _{2 incubatore} per 3-4 giorni prima di ripetere passaggi da 7.1 a 7.6.

8. Preparazione di orecchie per la spedizione

Nota: eseguire tegli fasi successive in una cappa sterile coltura cellulare.

1. Euthanize topi secondo le linee guida istituzionali appropriate.
2. Posizionare forbici e pinze in autoclave nel cofano coltura cellulare.
3. Aggiungere 50 ml di terreno completo in un tubo da 50 ml fondo conico.
4. Tagliare le orecchie (~ 1 cm di raggio) di un mouse con le forbici.
5. Trasferire le orecchie nel tubo da 50 ml a fondo conico (come preparato al punto 3) con pinze.
6. Sigillare il tubo da 50 ml fondo conico con parafilm prima della spedizione a temperatura ambiente in una scatola appropriata.

Risultati

Estrazione di fibroblasti da risultati tessuto in una notevole quantità di frammenti di tessuto (Figura 1). In contrasto con i residui di tessuto, fibroblasti aderire a superfici di plastica coltura dei tessuti tra il giorno 1 e 3 della cultura. Il mezzo di colture di fibroblasti può essere modificato in modo sicuro il giorno 3 di coltura, che dovrebbe ridurre significativamente i livelli di detriti presenti nella cultura (Figura 2). I fibroblasti mostrano una morfologia allungata e u...

Discussione

Qui forniamo una procedura semplice, economico e veloce sperimentale di stabilire colture di fibroblasti primari da orecchie e le code di topi. L'estrazione dovrebbe risultare in fibroblasti divisorie aderenti e rapidamente entro 3 giorni post-isolamento del tessuto. Un importante limite di pile è senescenza, una crescita arresto permanente ^15. Utilizzando il protocollo, colture di fibroblasti possono essere diversi passaggi da 5 a 6 volte prima fibroblasti diventano senescente, indicato dalla appiattime...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG