Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos

Resumo

Nós descrevemos um procedimento experimental simples e rápida para a geração de fibroblastos primários dos ouvidos e caudas de camundongos. O processo não requer a formação especial animal e pode ser utilizado para a geração de culturas de fibroblastos de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias.

Resumo

As células primárias são derivadas directamente a partir de tecidos e pensa-se ser mais representativo do estado fisiológico das células in vivo do que as linhas de células estabelecidas. No entanto, as culturas de células primárias geralmente têm um tempo de vida finito e precisa de ser frequentemente restabelecida. Os fibroblastos são uma fonte facilmente acessível de células primárias. Aqui, discutimos um procedimento experimental simples e rápida para estabelecer culturas de fibroblastos primários de orelhas e rabos de ratos. O protocolo pode ser utilizado para estabelecer culturas de fibroblastos primários de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias. Quando o protocolo seguido é cuidadosamente, as contaminações não são susceptíveis de ocorrer, apesar da utilização de tecido não-estéril armazenada por tempo prolongado, em alguns casos. Os fibroblastos proliferam rapidamente em cultura e pode ser expandido para um número substancial antes de se submeter a senescência replicativa.

Introdução

As células primárias são derivadas a partir de tecido vivo e cultivadas sob condições in vitro. Geralmente assume-se que as células primárias mais se assemelham ao estado fisiológico e o fundo genético do tecido a partir do qual foram produzidos de linhas de células imortalizadas ou de tumor ^1. Por essa razão, as células primárias representam um modelo útil para o estudo biológico perguntas ^2,3. No entanto, ao contrário de linhas celulares estabelecidas que crescem indefinidamente, células primárias, eventualmente, submetidos a senescência em cultura e têm de ser frequentemente restabelecida.

Células primárias vulgarmente utilizados incluem fibroblastos, células epiteliais, células endoteliais, células T, células B, macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) e células dendríticas derivadas de medula óssea (BMDC). Os fibroblastos são muitas vezes utilizadas como modelo de cultura celular primária. Eles oferecem vantagens sobre outras células primárias. As culturas celulares são facilmente estabelecida, facilmente mantido e não necessitam de purificação de células antes da cultura. Eles têm proliferação inicial rápida e sem exigência de protocolos de médio ou de activação especializados. Os fibroblastos podem ser eficientemente transfectadas utilizando protocolos físicos ^4,5 biológicas, químicas, e. Existe uma possibilidade de armazenar as orelhas para até 10 dias à TA antes de estabelecer culturas de células. Culturas de fibroblastos são propícias para visualização de processos citoplasmáticos e adequado para reprogramação em tronco pluripotentes induzidas (iPS) células ^6.

Os fibroblastos são importantes células do tecido conjuntivo que segregam proteínas de colagénio e na matriz extracelular ^7. Eles fornecem o quadro estrutural em muitos tecidos e ⁸ desempenham um papel essencial na cicatrização de feridas e reparação de tecidos ^9,10.

Aqui, descrevemos um (<4 h) protocolo simples e rápida para estabelecer culturas de fibroblastos de orelhas e rabos de ratos ^11. O protocolo exige rato mínimaexperiência para colher os tecidos (em contraste com outros protocolos ^12,13) ​​e pode ser utilizado para estabelecer culturas de orelhas armazenados em meio à temperatura ambiente durante até 10 dias.

Protocolo

Os ratos foram alojados em condições livres de patógenos em conformidade com as diretrizes institucionais, até a eutanásia (The Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) orientações na Universidade Nacional de Cingapura e do Comité Consultivo Nacional para a Research Laboratory Animal (NACLAR) orientações).

1. Ratos

1. Peça um rato do fundo genético apropriado. Este protocolo baseia-se em tecido derivado de uma C57BL / 6 mouse.

2. Preparação de Meio Completo

1. Prepare meio completo, adicionando as seguintes componentes a Roswell Instituto Memorial Park (RPMI) 1640: 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 50 uM de 2-mercaptoetanol, 100 uM asparagina, glutamina 2 mM, solução de penicilina-estreptomicina a 1%.

3. Preparação de soluções enzimáticas

1. Prepare solução de colagenase D em um tubo de fundo cónico de 15 ml.
   1. Pesar 10 mg de colagenase D. Dissolve colagenase D em 4 ml de meio completo.
2. Preparar a solução de pronase num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
   1. Pesar 10 mg de pronase.
   2. Adiciona-se 5 mL de tampão Tris 1 M (pH 8,0). Adicionar 1 ml de 0,5 M de EDTA (pH 8,0).
   3. Complete com 494 mL de água estéril.
   4. Incubar a solução de pronase a 37 ° C num banho de água durante 30 min.

4. Preparação de colagenase D-Mix pronase (≤2 Tails)

Nota: Execute as etapas subsequentes em uma capa de cultura de células estéril.

1. Adicionar 250 ul de solução de pronase a 4 ml de solução de colagenase D.
2. Passe a mistura de colagenase D-pronase através de um filtro de seringa de 0,2 mm em um tubo de 15 ml fundo cônico estéril.

5. Extração de fibroblastos de orelha e da cauda Tecidos

1. Euthanize ratos de acordo com as diretrizes institucionais adequadas.
2. Coloque autoclavados instrumentos cirúrgicos (tesouras e pinças) na capa de cultura de célula.
3. Adicionar 10 ml de meio completo em dois 10 cm cultura de células pratos cada.
4. Cortar orelhas (~ 1 cm de raio) e 5 cm de cauda (a partir da ponta da cauda) de um ratinho com tesouras e incubar durante 5 min em etanol a 40% em 70 ml de um tubo de 50 ml de fundo cónico estéril.
5. Orelhas Ar seco e cauda, ​​colocando-os em um aberto 10 centímetros de cultura de células prato na capa por 5 min. Depois secou-se, orelha de transferência e os pedaços de cauda, ​​com duas placas de cultura marcado "orelhas" e "cauda" contendo 10 ml de meio completo, como descrito na etapa 5.3.
6. Remover pêlos das orelhas e da cauda com uma tesoura.
7. Cortar orelhas e cauda em pedaços menores que 3 mm de tamanho, usando uma tesoura.
8. Transfira os tecidos cortados em 1,8 ml frascos criotubo rotulados "orelhas" e "cauda" e adicionar solução D-pronase colagenase suficientes para o volume a atingir a marca de 1,8 ml do frasco para injectáveis.
9. Pate os frascos criotubo horizontalmente num agitador e agitar as amostras a 200 rpm durante 90 min a 37 ° C.
10. Após 90 minutos de incubação, retire os frascos criotubo do agitador e coloque os frascos na capa.
11. Adicionar 10 ml de meio completo em duas de 10 cm de cultura de células pratos, identificado como "orelhas" e "cauda" cada, e colocar um filtro de 70 um celular em cada prato.
12. Coloque os tecidos orelha e da cauda digerido no coador 70 um celular nos pratos preparados em conformidade marcados na etapa 5.11 e com força moer os tecidos usando a 10 ml êmbolo da seringa para> 5 min. Agite o filtro de células ocasionalmente a médio e lavar as células fora do filtro de células.
13. Pipetar a suspensão de células de cada prato em tubos de 15 ml de fundo dois cônicos rotulados "orelhas" e "cauda". Lave o prato e filtro com mais 10 ml de meio completo e adicionar a médio e os apropriados tubos de 15 ml de fundo cónico.
14. Girar a célulasuspensão durante 7 minutos a 580 xg ~ e 4 ° C utilizando uma célula de centrífuga refrigerada.
15. Remover o sobrenadante, adicionar 10 ml de meio completo para a pelete de células em 15 ml de tubos de fundo cónico e ressuspender as células.
16. Repita o passo 5.14 e 5.15.

6. Cultura de mistura de células

1. Remover o sobrenadante. Assegure-se que o agregado de células permanece intacta.
2. Re-suspender as células em 10 ml de meio completo e adicione a respectiva mistura de dois pratos de cultura de 10 cm de células rotuladas "orelhas" e "cauda".
3. Adicionar 10 ul de solução de anfotericina B (solução de estoque: 250 ug / ml) à cultura.
4. Incubar as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com _5% de CO2.
5. No terceiro dia, substituir o meio por meio completo fresco contendo 10 ml de 10 ml de anfotericina B para remover os resíduos (Figuras 1 e 2).

7. Sub-cultura de fibroblastos

1. WheN cultura atinge cerca de 70% de confluência (3-4 dias de cultura) remover o meio e lava-se as células com 5 ml de fosfato estéril 1x solução salina tamponada (PBS).
2. Remover PBS e adicionar 2 ml de solução tripsina-EDTA 1x estéril para as células.
3. Incubam-se as células durante 5 min a 37 ° C numa atmosfera humidificada com _5% de CO2.
4. Após 5 min, toque suave da placa de cultura e adicionar 6 mL de meio completo para as células.
5. Transferir a suspensão de células para um tubo de fundo cónico de 15 ml e girar o tubo durante 5 minutos a ~ 450 x g e 4 ° C utilizando uma célula de centrífuga refrigerada.
6. Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento celular em 5 ml de meio completo.
7. Semente 2 x 10 ⁵ células em uma cultura de células de 10 cm de prato e incubar as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com _5% de CO2 durante 3-4 dias antes de repetir os passos 7.1 a 7,6.

8. Preparação de orelhas para o embarque

Nota: Execute tele etapas subseqüentes em uma capa de cultura de células estéril.

1. Euthanize ratos de acordo com as diretrizes institucionais adequadas.
2. Coloque tesouras e pinças autoclavado na capa de cultura de célula.
3. Adicionar 50 ml de meio completo em um tubo de fundo cónico de 50 ml.
4. Corte ouvidos (~ 1 cm de raio) de um rato com uma tesoura.
5. Transferir as orelhas para o tubo de 50 ml de fundo cónico (como preparado no passo 3) utilizando fórceps.
6. Selar o tubo inferior 50 ml cônico com parafilm antes do envio à temperatura ambiente em uma caixa apropriada.

Resultados

Extracção de fibroblastos a partir de resultados de tecidos em uma quantidade significativa de restos de tecido (Figura 1). Em contraste com os restos de tecido, fibroblastos de tecidos aderir às superfícies de cultura de plástico entre o dia 1 e 3 de cultura. O meio de cultura de fibroblastos pode ser alterado de forma segura no dia 3 de cultura, o qual deve diminuir significativamente os níveis de detritos presentes na cultura (Figura 2). Fibroblastos exibir uma morfologia along...

Discussão

Aqui nós fornecemos um procedimento experimental simples, barato e rápido para estabelecer culturas de fibroblastos primários de orelhas e rabos de ratos. A extracção deve resultar em fibroblastos aderentes dividem rapidamente e dentro de 3 dias após o isolamento do tecido. Uma importante limitação de pilhas é senescência, uma parada do crescimento permanente ^15. Usando o protocolo, culturas de fibroblastos podem ser passadas durante 5 a 6 vezes antes de se tornar fibroblastos senescentes, indicado ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG