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摘要

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

摘要

随着组学的出现接近我们的慢性疾病，如癌症和代谢综合征的认识有所提高。但是，这是由基因表达微阵列，深度测序实验或代谢分析获得大规模数据集的信息的有效开采是必不可少的发现，然后有效的病变靶细胞表型的关键调节因子。雌激素受体α（ERα）​​是调节这对于雌激素反应乳腺癌重要的基因程序的主转录因子中的一个。为了理解到的ERα在乳腺癌代谢信令作用我们从雌二醇处理的MCF-7细胞利用转录，cistromic和代谢数据。在这份报告中，我们描述了一代样品进行RNA测序，芯片起和代谢组学实验和获得的数据综合计算分析。这种方法是在描绘小说摩尔有用丘拉尔机制和基因调节电路是由一个特定的转录因子调节的正常或患病细胞的这影响代谢。

引言

雌激素是两个女性和男性包括生殖组织，组织代谢，脑和骨1许多生理过程的重要调节。除了在这些组织中的有益作用，雌激素也驱动，从乳腺和生殖组织出现的癌症。雌激素主要是合作，通过减排额来诱导细胞类型特异性作用。通过使用芯片起RNA测序和全基因组ERαDNA结合位点分析ERα调节成绩单深度测序被证明是有用的了解ERα是如何工作的，从他们的出现的不同的组织和癌症。我们和其他人发表不同的受体（ERαVSERβ）相关基因表达谱2,3，不同的配体3-5和不同的共调节因子-2,4,6,7-。

RNA测序的主要方法检测转录，提供更高的精度和效率相比，芯片巴SED基因表达分析8。从细胞系2-4,7，组织或肿瘤样品获得的RNA进行测序，映射到可用的基因组组件和差异调节的基因被鉴定出来。染色质免疫沉淀（ChIP）被用来解剖转录因子和coregulator染色质结合已知调节结合位点。芯片起（芯片后跟高通量测序）提供全球性的结合位点的检测偏见。代谢组学是另一个越来越多地采用系统生物学的方法，它定量措施，生命系统的各种刺激，包括化学和遗传扰动的动态响应多参数。

通过进行全局代谢轮廓，功能性读出可以从细胞，组织和血液中获得。此外，从转录实验信息并不总是反映在有助于生化途径的酶的水平的实际变化。综合转录和代谢分析数据，使我们能够识别并关联与实际代谢物的改变的基因表达的变化。利用从所有这些大型数据集提供的机械细节的信息，了解调控复杂生物系统，特别是那些涉及到人类发展和疾病，如癌症和糖尿病的转录因子的作用。

哺乳动物基因组的复杂性使得它具有挑战性的整合并充分解释从转录，顺反组和代谢组实验中获得的数据。识别功能的结合事件，这将导致的变化，因为一旦功能性结合位点识别的目标基因的表达是重要的;随后的分析，包括转录结合（TF）的基序分析，可以以更高的精度来执行。这导致生物学上有意义的TF级联和机制的鉴定。也可直接comparis上的RNA测序和芯片起实验并不总是可能的，因为从每个实验的数据具有不同的尺度和噪音，在某些情况下，有意义的信号是由人口噪声掩盖。我们不知道，集成这三个独立而又相关的方法信息，了解乳腺癌ERα由直接代谢调控任何研究的。因此，我们在本文的总体目标是生产关系的结合事件的基因表达和代谢物的变化。为了实现这一目标，我们从RNA测序，芯片起和代谢实验的综合数据，并确定那些诱导的ERα的雌激素结合，这将导致在代谢途径基因表达的变化的事件。这是第一次，我们提供了一套完整的生成芯片起，RNA测序和代谢组学分析和数据进行综合分析方案（ 图1）来发现新的基因调节电路乳房的新陈代谢癌细胞系。

研究方案

1. RNA测序样品的制备

  1. 细胞培养和治疗
    1. 培养的MCF7细胞中改进的MEM（IMEM）加了10％热非活性的FBS，1％青霉素/在湿润的5％CO 2的气氛链霉素，在37℃的酚红培养基。
      注意:相同的细胞系和细胞培养条件在整个研究中使用。
    2. 种子100000 MCF7细胞每孔在6孔板中。对每个治疗一式三份。在第3天，除去培养基，加2ml含或不含10 -8 M的E2向每个孔新鲜培养基中。孵育所述板在湿润的5％CO 2的气氛中在37℃24小时。
    3. 收获细胞，加入1ml RNA分离试剂（酸性硫氰酸胍 - 苯酚 - 氯仿）到每个孔中，并孵育在室温（RT）下5分钟。然后收集吹打并沉积在细胞裂解液试剂进入1.5毫升管
  2. RNA分离
    1. 加入200μlchlorofoRM到1ml细胞溶解物试剂（1.1.3），涡旋10秒。在室温下孵育5分钟。离心样品以16,000 xg离心在4℃下15分钟。离心后，将水相（上部）转移到新的管中，而不会干扰其它相。
    2. 将500μl100％异丙醇添加到与所传送的水相的新管中，并通过颠倒混合。孵育在-20℃过夜。离心样品以16,000 xg离心在4℃下10分钟。在管的底部观察的颗粒。弃去上清液并通过简短涡旋洗净用750微升不含RNA酶的70％的乙醇沉淀。
    3. 离心样品在4℃6000×g离心5分钟。除去上清液，并在4℃下以16,000 xg离心离心样品1分钟以收集所有剩余的乙醇。通过移液用凝胶装载尖除去剩余的乙醇，并设置在管上侧向下风干10分钟。溶解在依赖新生20-50微升DEPC处理水沉淀丁对丸粒的大小。
  3. 使用RNA清理试剂盒按照协议4纯化的RNA。使用基于荧光检测试剂盒按照协议9测量RNA浓度。
    注意:OD 260nm处取来确定在260nm的OD的RNA浓度和比率和280nm被用来确定样品的纯度。建议检查使用Bio-分析器测定RNA的质量。
  4. 取用于测序约0.5至1微克纯化的RNA。
    注:生物技术中心准备测序文库，并执行使用以前2详细方法配对末端测序读。

2.芯片起样品的制备

  1. 细胞培养和治疗
    1. 种子每10cm盘500000 MCF7细胞在生长培养基中。
      注意:对于每个拉下使用了16片。在第3天，除去培养基并加入5毫升或不含10 -8 M的E2到每个新鲜培养基盘子。处理细胞45分钟（37℃，在潮湿的5％CO 2的气氛中）。
  2. 交联和细胞收获
    1. 加入250微升37％甲醛入5ml培养基交联染色质，在室温下孵育15分钟。停止洗涤细胞用5ml冰冷的1×MEM交联。
    2. 收获在每板250μl的细胞裂解缓冲液（10mM EDTA，50mM的三盐酸，1％SDS，0.5％N，N-二dimethyldodecan -1-胺氧化物）的细胞。
  3. 染色质的碎片
    1. 超声处理的细胞30秒×8以30放大器来达到所需的染色质的大小。 30秒的超声处理后在冰上冷却各样品。
    2. 离心机在16，000×g离心在4℃下10分钟，并小心地吸取上清液，而不在底部干扰颗粒。
    3. 取上清的5微升等分试样，并通过1.5％琼脂糖凝胶检查如先前10描述的电泳的DNA大小。理想的大小的DNA应当是200-500碱基对之间。
  4. 染色质免疫沉淀
    1. 保存25微升细胞裂解液作为输入。在50ml管中，将4- ml细胞裂解液用20毫升的IP缓冲液（2mM EDTA的，100毫摩尔NaCl，20毫摩尔Tris-HCl和0.5％的Triton X），ERα抗体（500微升F10和500μl的HC- 20），和500微升PROTA和ProtG蛋白涂覆的磁珠。孵育通过旋转该混合物在4℃下过夜，使染色质 - 抗体复合物的形成。
  5. 清洗和反向交联
    1. 用磁力架收集关于磁化侧磁珠去除洗涤缓冲液。
    2. 洗磁珠在25ml洗涤缓冲液I（2毫摩尔EDTA，20毫摩尔Tris盐酸，01％SDS，1％的Triton X，和150毫摩尔NaCl）。彻底清洗磁珠不干扰DNA的蛋白质复合物，加入25 1ml洗涤慢慢缓冲到沿着侧的管然后反转管，直到所有的磁珠混合以及无线TH洗涤缓冲液没有出现一个小球。作为替代，使用旋转器以反转管。不要涡旋样品。用同样的方法在下面的步骤洗涤磁珠。
    3. 在25ml洗涤缓冲液II（2毫摩尔EDTA，20毫摩尔Tris盐酸，01％SDS，1％的Triton X，和500mM的氯化钠）洗涤磁珠。
    4. 洗磁珠在25ml洗涤缓冲液III（1.6毫摩尔EDTA，10毫摩尔Tris盐酸，1％NP-40，1％Dexycholate和250mM的氯化锂）。
    5. 在25ml 1×TE缓冲液（1mM EDTA和10毫摩尔Tris HCl）的两次洗涤磁珠。
    6. 洗脱的DNA于500μl洗脱缓冲液（1％SDS，和10mM的NaHCO 3），然后分配500微升的DNA洗脱到4个试管。从投入的DNA，洗脱125微升洗脱缓冲液的DNA。
    7. 在65℃孵育管过夜加热块上。用铝箔覆盖在加热块上的管，以保持热甚至在所有的管子。将一个砝码放在管，以防止他们打开。
  6. DNA提取
    1. 冷却在RT管5分钟。隔离使用DNA芯片分离试剂盒下拉样本的DNA。请遵循制造商的指示。
      1. 预热在65℃的洗脱缓冲液。添加625微升结合缓冲液至每个管。如果形成沉淀，再添加入250μl结合缓冲液，直至溶液澄清。
      2. 加载样品上柱和离心机以16,000×g离心30秒。洗净用250微升洗涤液样品。记得要加乙醇洗涤缓冲液，当第一次使用它。重复洗。
      3. 洗脱在15微升洗脱缓冲液将DNA。联合收割机一样的DNA，从4管拔下来，实现约55微升的DNA。
    2. 隔离输入DNA用DNA纯化试剂盒。
      1. 预热在65℃的洗脱缓冲液。添加625微升结合缓冲液中的每个管中并孵育10分钟。加载样品到柱上在2 ml collecti上管。
      2. 洗用750微升洗涤缓冲液，离心样品以16,000 xg离心1分钟。重复离心以除去任何剩余的缓冲区。洗脱DNA插入EB的30微升。
    3. 测量DNA浓度使用荧光染料的商业与试验修改11。
      1. 稀释20倍TE缓冲到1倍的TE，作为稀释试剂和DNA样品的测定缓冲液。取5微升提取的DNA，并将其稀释成50微升的TE 1X。
      2. 从2微克/毫升DNA原液进行DNA标准从毛坯到1，10，100，1000微克/毫升。在一个96孔板，分配每个标准的25微升以及在重复DNA稀释。 （推荐标准一式三份）。
      3. 通过在塑料制管，从双链DNA试剂的200倍稀释于1×TE缓冲液制备工作试剂。用铝箔覆盖工作试剂溶液，以避免光。加入200μl工作试剂到每个样本。在cubate在室温下5分钟。用铝箔覆盖该板，以避免光。
      4. 测量使用荧光板读数器（激发在480nm，发射520纳米）的样品的荧光。生成花期与DNA浓度的DNA标准曲线。确定基于所产生的DNA的标准曲线对样品的浓度。
  7. 沉淀实验验证使用qPCR
    1. 取2微升提取的DNA和稀释成20微升水。通过混合2.5微升DNA稀释液，5微升绿我PCR预混，1微升底漆和1.5微升无核酸酶水设置一式三份的qPCR实验。
    2. 使用以下程序的快速实时PCR系统上运行的qPCR:步骤1:95℃60秒，第2步:95℃，10秒，60℃60秒，重复执行步骤2 39次。
  8. 送10纳克DNA样本，以生物技术中心进行测序。
    注:生物技术H中央根据指令准备DNA芯片进入图书馆，并执行使用以前2详细方法单读测序。

3.代谢组学分析样品制备

  1. 细胞培养和治疗
    1. 种子每10cm平板400000 MCF7细胞在生长培养基中。每个处理制备三个样品。使用每个样品中两个板块获得足够的细胞用于检测。在第3天，除去培养基并加入5毫升或不含10 -8 M的E2到细胞的新鲜培养基。处理细胞24小时（37℃下在湿润的5％CO 2的气氛中）。
  2. 样品采集
    1. 加入5毫升冰水预冷的1×PBS的板块，经过几次短暂倾斜板吸出PBS。重复两次，在最后一次洗涤后除去尽可能多的PBS越好。
    2. 添加750微升预冷的丙酮至各板和刮细胞。结合细胞的丙酮从两个板在冰上2ml的管中。
    3. 正常化细胞计数
      1. 对于每个处理，使用细胞量化两个额外板。从板到解附着细胞，加入2毫升，HE缓冲液（1×HBSS，10mM的HEPES，0.075％ 碳酸氢钠，和1mM EDTA）插入每个板并孵育5分钟。
      2. 收集并通过在HE缓冲吹打细胞拌匀细胞。使用总共20微升细胞溶液到计数使用血球细胞数。
  3. 发送到代谢中心来识别和使用气相色谱质谱（GC-MS）分析量化代谢物之前储存于-80℃的样品。

4.综合分析

  1. RNA测序数据分析:
    1. 执行使用FastQC FASTQ文件质量检查:读QC（http://galaxy.illinois.edu）
      1. 选择FastQC:NGS的工具下阅读:QC和操纵。载从当前histor原始数据文件年。
        注:建议给一个标题为输出文件提醒你什么工作了，因为对于可能有多个输出。
    2. 执行和输出文件将历史记录下。重复相同的步骤，对每个序列文件。修剪适配器使用NGS下剪辑:FASTX工具包。
    3. 对齐读取使用Tophat2与RefSeq的基因组参考注释12（默认值）hg19。
      1. 根据NGS的工具选择Tophat2:RNA分析。指示库配对类型（单端VS末端配对）。
      2. 上传从目前的历史上输入FASTQ文件。选择参考基因组。选择默认设置。或使用完整的参数表进行修改。
      3. 执行和它会产生两个输出文件:一个是路口UCSC床轨道;另一种是在BAM格式读出比对的列表。
    4. 上传BAM文件测序数据分析工具。计算使用定量表达值ification工具。
    5. 确定使用默认值使用表达分析工具差异上调的基因和倍数变化> 2且p值 <0.05。同样地，确定使用默认值使用表达分析工具差异下调的基因和倍数变化<0.5和p值<0.05。
  2. 芯片起数据分析:
    1. 对齐FASTQ读取到银河系中的使用Bowtie2 13（默认值）hg19。
      1. NSC的工具下选择Bowtie2:映射。验证该库是队友配对（单端VS末端配对）。上传从目前的历史FASTQ文件。
      2. 选择参考基因组。使用默认的参数设置。执行和它会产生输出文件，映射顺序读为BAM文件。重复该过程的每个序列文件。
    2. 识别使用MACS 14 6.0E-7的p值截止和0.01 FDR峰，如前所述2。
  3. 代谢组学数据分析:
    1. 转换代谢产物的化学名称KEGG_IDs。
    2. 通过比较在车辆检测VS。E2水平鉴定差异调节的代谢物处理的样品（2倍截止在本研究中使用）。
  4. 综合分析:
    1. 识别已经使用的测序数据分析工具ERα结合位点的基因。翻译地区使用20 KB作为距离截止基因的功能。
    2. 使用倍数变化> 2确定从RNA测序数据分析差异上调和下调的基因和倍数变化<0.5，分别与p值 <0.05为切断。比较使用维恩图比较ERα结合位点含有基因的列表中。
    3. 使用此列表中使用的Cytoscape的Metscape 15模块识别E2调制的代谢途径。
      1. 通过从应用Metscape模块中，选择建立网络，然后途径-BAS编辑选项。
      2. 选择生物体（人类）。 E2无管制化合物列表中选择的数据文件（KEGG ID），以及E2上调基因列表。
      3. 选择化合物-Reaction - 酶 - 基因作为网络类型。选择化合物/基因作为查询。
      4. 构建网络。重复使用E2下调化合物和基因。

结果

转录
分析差异表达的基因由E2治疗，我们选择了要执行的RNA测序实验。除了提供关于mRNA水平的信息，RNA测序数据也可被用来监测在非编码RNA（长的非编码RNA，微小RNA）和选择性剪接事件的变化。我们没有提供的非编码RNA或备选转录基因的分析信息，因为我们的研究范围是确定蛋白质编码基因是对于代谢调节很重要的。然而，RNA-Seq中获得的差异表达基因事件的信息的一...

讨论

在本文中，我们描述了从与E2处理MCF-7细胞生成和RNA测序，芯片起和代谢组学数据的综合分析。我们制定了一套运筹帷幄，利用最有效的方法和用户友好的软商品即产生生物相关的发现协议。据我们所知，我们是从三个不同的分析和ERα在乳腺癌细胞直接调节确定的新的代谢途径整合组学数据的第一项研究。

转录
关键是要开始与高品质的RNA的转录成功分析。好的做法将消除...

披露声明

伊利诺伊大学从辉瑞公司ZME收到调查发起的赠款和YCZ从这笔款项收到薪水的支持。

致谢

这项工作是由粮食和农业研究所，美国农业部，屡获ILLU-698-909（ZME）和辉瑞公司（ZME）资助。其内容完全是作者的责任，并不一定代表美国农业部的官方意见。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Triglyceride MixSigma17810-1AMP-S
Oleic acid SigmaO1257-10MGOleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol ReagentLife technologies 15596-026
Dynabeads Protein ALife technologies 10006D
Dynabeads Protein GLife technologies 10007D
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28106DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit Zymo Research D5205ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay KitInvitrogen P7589DNA Quantitation
RNase-Free DNase SetQIAGEN79254RNA purification
DEPC Treated Water LIFE TECH462224Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic DismembratorFisher Scientific FB120110With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound EnclosureFisher Scientific FB-432-AFor sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 mlEppendorf 0030 119.401200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix NEBS1330S
DNTP MIXNEBN0447S
M-MuLV Reverse TranscriptaseNEBM0253S
FastStart SYBR Green MasterROCHE4673484001
AgaroseFisher BP1601001.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay KitLife technologies Q32852RNA quantification (100 assays) 
FormaldehydeSigmaF8775
Protease Inhibitor tablets Roche 4693116001Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail TabletsRoche 4906845001Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay KitsLife technologies Q32850For 100 assays
Automated cell counterORFLOMXZ000
tube Rotator VWR10136-084
Victor X5 Multilple plate reader PerkinElmer2030-0050
Microcentrifuge 5417REppendorf22621807
Magnetic StandDiagenodeB04000001 
Fast Real-time PCR systemApplied Science 4351405

参考文献

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