乳癌におけるエストロゲン受容体シグナル伝達によって代謝制御のシステムバイオロジー

要約

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

要約

-omicsの出現により、がんやメタボリックシンドロームなどの慢性疾患の我々の理解が向上した近づきます。しかし、遺伝子発現マイクロアレイから得られる大規模なデータセット、深いシーケンシング実験または代謝プロファイリングにおける情報の効果的な採掘が明らかにした後、効果的に病気の細胞の表現型の重要な調節因子を標的とすることが不可欠です。エストロゲン受容体α（ERα）​​は、エストロゲン応答性乳癌のために重要である遺伝子プログラムを制御するマスター転写因子の一つです。乳がん代謝におけるERαシグナル伝達の役割を理解するために、我々はトランスクリプトーム、エストラジオールで処理されたMCF-7細胞からcistromicとメタボロームデータを利用しました。この報告では、RNAのSeq、ChIPの-のSeqとメタボロミクス実験と得られたデータの統合的なコンピュータ分析のためのサンプルの生成を説明しました。このアプローチは、新規モルの輪郭を描くのに有用ですcularメカニズムおよび正常または疾患細胞の影響代謝特定の転写因子によって調節されている遺伝子調節回路。

概要

エストロゲンは生殖組織、代謝組織、脳や骨^1を含む。女性と男性の両方における多くの生理学的プロセスの重要な調節因子です。これらの組織において有益な効果に加えて、エストロゲンはまた、乳房および生殖組織から生じる癌を駆動します。エストロゲンは主に細胞型特異的な効果を誘導することのERを介して動作します。 ChIP-のSeqを用いてRNA-のSeqとゲノムワイドERαDNA結合部位の解析を使用してERαによって調節転写産物のディープシーケンシングは、ERαがそれらから生じる異なる組織および癌においてどのように動作するかを理解するのに有用であることが判明しました。我々と他の人は、異なる受容体（ERβ対^{ERα）2,3、}異なるリガンド^3-5と異なるコレギュレーター^2,4,6,7に関連した遺伝子発現プロファイルを公開しています。

RNA-のSeqは、マイクロアレイBAと比較して、より高い精度と効率を提供し、トランスクリプトームを検討するための主要な方法であり、sedの遺伝子発現解析^8。細胞株^2-4,7、組織または腫瘍試料から得られたRNAは、利用可能なゲノムアセンブリにマッピングされ、配列決定され、示差的に調節する遺伝子が同定されます。クロマチン免疫沈降（チップ）は、公知の調節結合部位に結合する転写因子および補調節因子、クロマチンを分析するために使用されます。 ChIP-のSeq（ハイスループットシークエンシングに続いてのChIP）は、グローバル結合部位の公正な検出を提供します。メタボロミクスは別ますます使用されるシステム生物学のアプローチ、定量的に測定し、化学物質や遺伝的摂動を含む様々な刺激に対する生体系の動的マルチパラメトリック応答です。

グローバル代謝プロファイリングを行うことにより、機能的な読み出しは、細胞、組織、及び血液から得ることができます。また、トランスクリプトーム実験からの情報は常に生化学的経路に貢献する酵素のレベルの実際の変化を反映するものではありません。合わせましたトランスクリプトームとメタボロームデータの分析は、実際の代謝物の変化と遺伝子発現の変化を識別し、相関させることを可能にしています。すべてのこれらの大規模なデータセットからの情報を活用することは、複雑な生物学的システムを調節する転写因子、人間開発とがんや糖尿病などの疾患に関連し、特にものの役割を理解するために機械的な詳細を提供します。

哺乳動物ゲノムの複雑な性質は、それが困難な統合と完全にトランスクリプトーム、cistromeとメタボローム実験から得られたデータを解釈することができます。一旦機能的結合部位が同定されているため、標的遺伝子の発現の変化をもたらす機能的結合事象を同定することが重要です。転写結合（TF）モチーフの分析を含む分析し、その後、より高精度に行うことができます。これは、生物学的に意味のあるTFカスケードおよびメカニズムの同定をもたらします。また、直接comparis各実験からのデータは、異なるスケールとノイズを持っており、いくつかのケースでは意味のある信号が人口ノイズによって覆い隠されているので、RNAのSeqとチップのSeq実験の上で常に可能ではありません。我々は、乳癌におけるERαによる直接の代謝調節を理解するために、これらの三つの独立が関連のアプローチからの情報を統合し、任意の研究を認識していません。そこで、本論文では、当社の全体的な目標は、遺伝子発現および代謝物の変化に生産的な結合事象を関連付けることです。この目標を達成するために、我々は、RNAのSeqチップ-のSeqおよびメタボロミクスの実験からのデータを統合し、代謝経路における遺伝子発現の変化をもたらすイベントを結合ERα誘導されるエストロゲンを同定しました。初めて、我々は乳房の代謝を調節する新規遺伝子回路を明らかにしたChIP-のSeq、RNA-のSeqとメタボロミクスのプロファイリングを生成し、データの統合的な分析を行うためのプロトコル（ 図1）の完全なセットを提供します癌細胞株。

プロトコル

RNA-のSeqサンプルの調製

1. 細胞培養および治療
   1. 改良MEM（IMEM）+ 10％熱不活性FBS、加湿5％CO ₂雰囲気中で37℃で1％のペニシリン/ストレプトマイシンを有するフェノールレッド培地で培養MCF7細胞。
      注：同じ細胞株および細胞培養条件は、試験全体を通して使用されます。
   2. 6ウェルプレートにウェル100,000 MCF7細胞を播種。各治療のための三連を持っています。 3日目に、培地を除去し、または各ウェルに10 ^-8 M E2ずに2ミリリットルに新鮮な培地を追加します。加湿5％CO ₂雰囲気中、37℃で24時間プレートをインキュベート。
   3. 細胞を収穫各ウェルに1mLのRNA単離試薬（酸グアニジニウムチオシアネート - フェノール - クロロホルム）を添加し、室温（RT）で5分間インキュベートします。その後、1.5ミリリットルチューブにピペッティングし、預金による細胞ライセート試薬を集めます
2. RNAの単離
   1. 200μlのchlorofoを追加10秒間、1ミリリットルの細胞ライセート試薬（1.1.3）と渦へのrm。 5分間、室温でインキュベートします。 4℃で15分間、16,000×gで遠心分離サンプル。遠心分離後、他の相を乱すことなく、新しいチューブに水相（上部）を転送。
   2. 転送-水相と新しいチューブに500μlの100％イソプロパノールを追加し、転倒混和。 -20℃で一晩インキュベートします。 4℃で10分間、16,000×gで試料を遠心。チューブの底にペレットを観察します。上清を捨て、短時間のボルテックスによって750μlのRNaseフリーの70％エタノールでペレットを洗浄。
   3. 4℃で5分間、6000×gで遠心分離サンプル。上清を除去し、残りのすべてのエタノールを収集するために4℃で1分間、16,000×gでサンプルを遠心します。ゲルローディングチップでピペッティングすることにより、残りのエタノールを除去し、10分間ダウン空気乾燥まで側チューブを設定します。 depen 20-50μlのDEPC処理水にペレットを溶解しペレットのサイズに鼎。
3. プロトコール⁴次RNAクリーンアップキットを用いてRNAを精製します。プロトコル⁹次蛍光光度ベースのアッセイキットを用いてRNA濃度を測定します。
   注：260 nmでのODを260nmでODのRNA濃度及び比率を決定するために採取し、280 nmでのサンプルの純度を決定するために使用されます。これは、バイオアナライザーアッセイを用いてRNAの品質をチェックすることをお勧めします。
4. 配列決定のために約0.5〜1μgの精製RNAを取ります。
   注：バイオテクノロジーセンターは、シークエンシングライブラリを作成し、ペアエンドは、以前に²詳述した方法を用いてシーケンシングを読んで実行します。

ChIP-のSeqサンプルの調製

1. 細胞培養および治療
   1. 種子増殖培地中で10cmプレート500,000 MCF7細胞。
      注：各プルダウンについて16のプレートを使用しました。 3日目に、培地を除去し、またはそれぞれに10 ^-8 M E2ずに5ミリリットルに新鮮な培地を追加プレート。 45分（37℃、加湿5％CO ₂雰囲気中で）のための細胞を扱います。
2. クロスリンクとセルハーベスト
   1. 、クロマチンを架橋15分間室温でインキュベートし5ミリリットル培地に250μlの37％ホルムアルデヒドを追加します。 5ミリリットルの氷冷1×MEMで細胞を洗浄することにより、架橋を停止します。
   2. プレートあたり250μlの細胞溶解緩衝液（10mM EDTA、50mMのトライのHCl、1％SDS、0.5％N、N-dimethyldodecan -1-アミンオキシド）で細胞を採取します。
3. クロマチン断片化
   1. 必要なクロマチンのサイズに到達するために30のアンペアで30秒×8のための細胞を超音波処理。 30秒の超音波処理した後、氷上で各サンプルを冷却します。
   2. 16で遠心分離し、4℃で10分間、000×gで、かつ慎重には、底にペレットを乱すことなく、上清をピペット。
   3. 上清の5μlアリコートを取り、そして以前に¹⁰記載されているように、1.5％アガロースゲルによる電気泳動によるDNAのサイズを確認してください。理想的なサイズDNAの200から500塩基対の間でなければなりません。
4. クロマチン免疫沈降
   1. 入力として、細胞溶解物の25μlのを保存します。 50mlのチューブに20mlのIP緩衝液（2mMのEDTA、100mMのNaCl、20mMのトリス-HCl、および0.5％のTriton X）、ERα抗体（500μlのF10と500μlの細胞溶解物を4mlを混合HC- 20）、および500μlのPROTAとProtGタンパク質磁気ビーズをコーティングします。 chromatin-抗体複合体の形成を可能にするために、4℃で一晩回転させることにより混合物をインキュベートします。
5. 洗浄およびリバース架橋
   1. 洗浄バッファーを除去するために、磁化の側に磁気ビーズを収集するために、磁気スタンドを使用してください。
   2. 25 mlの洗浄緩衝液中で磁気ビーズを洗浄I（2mMのEDTA、20mMのトリスHCl、0.01％SDS、1％トリトンX、および150mMのNaCl）。徹底的にすべての磁気ビーズを混合ウェルのWiあるまで、チューブを反転側に沿ってチューブにゆっくりと25ミリリットルの洗浄緩衝液を追加し、DNA-タンパク質複合体を乱すことなく、磁気ビーズを洗浄するために、ペレットとして現れることなく、洗浄バッファー番目。別の方法として、チューブを反転する回転子を使用しています。サンプルをボルテックスしないでください。以下の手順で同じ方法を用いた磁気ビーズを洗浄します。
   3. 25ミリリットル洗浄緩衝液II（2 mMのEDTA、20mMのトリスHCl、01パーセントSDS、1％トリトンX、および500mMのNaCl）に磁気ビーズを洗ってください。
   4. 25ミリリットル洗浄緩衝液IIIに磁気ビーズを洗浄（1.6 mMのEDTA、10mMのトリスHCl、1％NP-40、1％Dexycholateおよび250mMのLiClを）。
   5. 二回25ミリリットル1×TEバッファー（1mMのEDTA、および10mMのトリスHCl）に磁気ビーズを洗ってください。
   6. 500μlの溶出緩衝液でDNAを溶出（1％SDS、および10mMのNaHCO _3）、その後、4チューブに500μlのDNAの溶出を割り当てます。入力からのDNAは、125μlの溶出緩衝液でDNAを溶出します。
   7. 加熱ブロック上で65℃で一晩チューブをインキュベートします。でも、全てのチューブを介して熱を保つためにアルミホイルで加熱ブロック上でチューブをカバーしています。開口部からそれらを保つために、チューブに重みを置きます。
6. DNA単離
   1. 室温で5分間チューブを冷却します。 ChIPのDNA単離キットを使用して、プルダウンサンプルからDNAを分離します。メーカーからの指示に従ってください。
      1. 65℃での溶出バッファーをウォームアップ。各チューブに結合緩衝液625μLを加えます。溶液が透明になるまで沈殿物が形成される場合は、別の250μlの結合緩衝液を追加します。
      2. 30秒間16,000×gで列遠心上にサンプルをロードします。 250μlの洗浄緩衝液でサンプルを洗ってください。初めてそれを使用する際に、洗浄緩衝液にエタノールを追加することを忘れないでください。洗浄を繰り返します。
      3. 15μlの溶出緩衝液でDNAを溶出させます。同じのDNAは約55μlのDNAを達成するために、4管からプルダウン組み合わせます。
   2. DNA精製キットを使用した入力DNAを単離します。
      1. 65℃での溶出バッファーをウォームアップ。各チューブに625μlの結合緩衝液を加え、10分間インキュベートします。コレクションVol 2ミリリットルでカラムにサンプルをロードしますチューブ上。
      2. 、750μlの洗浄緩衝液で1分間、16,000×gで遠心分離したサンプルを洗ってください。残りの緩衝液を除去するために遠心分離を繰り返します。 EB30μlの中にDNAを溶出します。
   3. 修正¹¹で商業蛍光色素アッセイを用いてDNA濃度を測定します。
      1. 試薬とDNAサンプルを希釈するためのアッセイ緩​​衝液として1×TEに20倍のTE緩衝液を希釈します。 5μlのに単離されたDNAを取り、1×TEで50μlの中にそれを希釈します。
      2. 2から/ mlのDNAストック溶液を、ブランクから1までの範囲のDNA標準を作る10、1​​00、1000μgの/ mlの。 96ウェルプレートでは、二重に25の各標準μlのと同様にDNAの希釈を割り当てます。 （標準のための三連が推奨されます。）
      3. プラスチックチューブに1×TE緩衝液中のdsDNA試薬から200倍に希釈することによって作用試薬を準備します。光を避けるためにアルミホイルで作業試薬溶液をカバーしています。各サンプルに試薬を作業200μlのを追加します。に5分間、室温でcubate。光を避けるためにアルミホイルでプレートを覆います。
      4. （480nmで、発光520 nmで励起）蛍光プレートリーダーを使用して試料の蛍光を測定します。 DNA濃度に対する蛍光のDNA標準曲線を生成します。生成されたDNAの標準曲線に基づいて、試料の濃度を決定します。
7. 定量PCRを使用したChIP実験の検証
   1. DNAを単離し、水で20μlの中に希釈し2μLを取ります。 2.5μlのDNAの希釈、5μlのグリーンI PCRマスターミックス、1μlのプライマー、および1.5μlのヌクレアーゼフリー水を混合することにより、三連で定量PCR反応を設定します。
   2. ステップ2 39回繰り返し、60秒、10秒、60℃、95℃：60秒、95°C、ステップ2：ステップ1：以下のプログラムを使用して、FastリアルタイムPCRシステムを用いて定量PCRを実行します。
8. 配列決定のためのバイオテクノロジーセンターに10 ngのDNAサンプルを送信します。
   注：バイオテック時間センターは、指示に従ってライブラリにChIPのDNAを準備し、以前に^2を詳述した方法を用いて、単一の読み取りシーケンシングを行います。

3.メタボローム測定用試料調製

1. 細胞培養および治療
   1. 種子増殖培地中で10cmプレート40万MCF7細胞。各治療のための3つのサンプルを調製します。検出のために十分な細胞を受信するために、各サンプル中の2つのプレートを使用してください。 3日目に、培地を除去し、細胞へまたは10 ^-8 M E2ずに5ミリリットルに新鮮な培地を追加します。 24時間（37℃、加湿5％CO ₂雰囲気中で）のための細胞を扱います。
2. 試料捕集
   1. 簡単にプレートを数回傾けた後、PBSを吸引し、プレートにPBS 1X 5ミリリットルの氷冷を追加します。二回繰り返し、最後の洗浄後、できるだけ多くのPBSを削除します。
   2. 各プレートにプレ冷アセトンの750μlを添加して、細胞をこすり取ります。二つのプレートからアセトン中で細胞を組み合わせで氷上で2 mlチューブに。
   3. 正規化のための細胞数
      1. 各治療のために、細胞定量化のための2つの追加のプレートを使用します。 、プレートから細胞を添付脱HEの2ミリリットルを追加するには、各プレートに（1×HBSS、10mMのHEPES、0.075％のNaHCO _3、および1mM EDTA）バッファーと5分間インキュベートします。
      2. HE緩衝液中で細胞をピペッティングすることにより細胞を回収し、よく混ぜます。血球計数器を用いて細胞数をカウントするために20μlの細胞溶液の合計を使用します。
3. ガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）分析を用いて代謝産物を同定および定量するメタボロミクスセンターに送信する前に-80℃で試料を保存します。

4.統合的分析

1. RNA-のSeqデータ解析：
   1. FastQCを使用してFASTQファイルの品質チェックを実行します：読むQC（http://galaxy.illinois.edu）
      1. NGSのツールの下で読む：QCと操作FastQCを選択します。現在historからの生データファイルをアップロードY。
         注：ジョブが複数の出力がある場合がありますので、ために何であったかを思い出させるために、出力ファイルのタイトルを与えることをお勧めします。
   2. 実行し、出力ファイルには、歴史の下に表示されます。各シーケンスファイルに対して同じ手順を繰り返します。 NGSの下にクリップを使用してアダプターをトリム：FASTXツールキット。
   3. 整列はのRefSeqゲノム参照アノテーション^12（デフォルト値）でTophat2を使用してhg19に読み込みます。
      1. RNA分析：NGSのツールの下Tophat2選択します。ライブラリーペアのタイプ（ペアエンド対シングルエンド）を示しています。
      2. 現在の履歴から入力FASTQファイルをアップロードします。参照ゲノムを選択します。デフォルトの設定を選択します。または変更するには、完全なパラメータ・リストを使用します。
      3. 実行し、それは二つの出力ファイルが生成されます：1は、接合部のUCSCのBEDのトラックです。別の一つは、BAM形式で読み取りアライメントのリストです。
   4. シークエンスデータ解析ツールにBAMファイルをアップロードします。クワントを用いた発現値を計算しますificationツール。
   5. デフォルト値を使用して発現解析ツールを使用して差動でアップレギュレートされる遺伝子を同定し、変更> 2およびp値 <0.05倍。同様に、デフォルト値を使用して発現解析ツールを使用して差動でダウンレギュレートされる遺伝子を同定し、変更<0.5およびp値<0.05倍。
2. ChIP-のSeqデータ解析：
   1. 揃えFASTQはギャラクシーでBowtie2 ^13（デフォルト値）を使用してhg19に読み込みます。
      1. マッピング：N​​SCのツールの下Bowtie2を選択します。ライブラリがメイト対形成（ペアエンド対シングルエンド）であるかどうかを確認します。現在の履歴からFASTQファイルをアップロードします。
      2. 参照ゲノムを選択します。デフォルトのパラメータ設定を使用します。実行し、マッピングされたシーケンスは、BAMファイルとして読み込むと、それは出力ファイルを生成します。すべてのシーケンスファイルのための手順を繰り返します。
   2. 以前に^2を説明したように、MACS ¹⁴ 6.0e-7のp値カットオフおよび0.01のFDRを使用してピークを識別します。
   3. メタボロミクスデータ解析：
      1. KEGG_IDsに代謝物の化学名を変換します。
      2. 対車両で検出されたレベルを比較することにより示差的に調節代謝産物を同定する。E2は（2倍のカットオフは、この研究において使用した）サンプルを処理しました。
   4. 統合分析：
      1. 配列決定データ分析ツールを使用してERα結合部位を有する遺伝子を同定します。距離カットオフとして20キロバイトを使用して、遺伝子機能に領域を翻訳。
      2. カットオフとして、それぞれp値 <0.05で、倍数変化> 2を用いてRNA-のSeqデータ解析から、差動で、上下調節遺伝子を特定し、変更<0.5倍。ベン図の比較を用い​​て、遺伝子を含むERα結合部位のリストと比較してください。
      3. CytoscapeのMetscape ¹⁵モジュールを使用してE2変調代謝経路を特定するには、このリストを使用します。
         1. アプリからMetscapeモジュールを選択することにより、ネットワークを構築し、その後、経路-BAS選びますエドオプション。
         2. 生物（ヒト）を選択します。 E2規制されていない化合物リストの選択データファイル（KEGG ID）もE2は遺伝子リストをアップレギュレート。
         3. ネットワークの種類として化合物-Reaction -Enzyme-遺伝子を選択してください。クエリとして化合物/遺伝子を選択してください。
         4. ネットワークを構築します。 E2ダウンレギュレート化合物や遺伝子を使用して繰り返します。

結果

トランスクリプトミクス
E2処理によって示差的に発現する遺伝子を分析するために、我々は、RNAのSeq実験を行うことにしました。 mRNAレベルについての情報を提供することに加えて、RNA-、配列番号データは、非コードRNA（長い非コードRNA、マイクロRNA）、および選択的スプライシング事象の変化を監視するために使用することができます。我々の研究の範囲は、?...

ディスカッション

本稿では、生成およびE2で処理されたMCF-7細胞からのRNA-のSeq、ChIPの-のSeqとメタボロミクスデータの統合的な分析を説明しました。私たちは、生物学的に関連の発見を生み出す最も効率的な方法でユーザーフレンドリーなソフト用品を利用するために戦略的なプロトコルのセットを開発しました。我々の知る限り、我々は、3つの異なる分析から-omicsデータを統合し、ERα直接乳癌細胞において?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triglyceride Mix	Sigma	17810-1AMP-S
Oleic acid	Sigma	O1257-10MG	Oleic Acid-Water Soluble powder
TRIzol Reagent	Life technologies	15596-026
Dynabeads Protein A	Life technologies	10006D
Dynabeads Protein G	Life technologies	10007D
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28106	DNA isolation of input sample
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit	Zymo Research	D5205	ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit	Invitrogen	P7589	DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set	QIAGEN	79254	RNA purification
DEPC Treated Water	LIFE TECH	462224	Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB120110	With 1/8 probe
Fisher Scientific Sound Enclosure	Fisher Scientific	FB-432-A	For sound reduction
Eppendorf Tubes 5.0 ml	Eppendorf	0030 119.401	200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix	NEB	S1330S
DNTP MIX	NEB	N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase	NEB	M0253S
FastStart SYBR Green Master	ROCHE	4673484001
Agarose	Fisher	BP160100	1.5% agarose gel
Qubit RNA HS Assay Kit	Life technologies	Q32852	RNA quantification (100 assays)
Formaldehyde	Sigma	F8775
Protease Inhibitor tablets	Roche	4693116001	Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	4906845001	Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits	Life technologies	Q32850	For 100 assays
Automated cell counter	ORFLO	MXZ000
tube Rotator	VWR	10136-084
Victor X5 Multilple plate reader	PerkinElmer	2030-0050
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807
Magnetic Stand	Diagenode	B04000001
Fast Real-time PCR system	Applied Science	4351405