JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

Аннотация

С появлением -omics подходов наше понимание хронических заболеваний, как рак и метаболического синдрома улучшилось. Тем не менее, эффективная добыча информации, содержащейся в крупномасштабных наборов данных, которые получаются из экспрессии генов микрочипов, глубоких экспериментов секвенирования или метаболического профилирования имеет важное значение для раскрытия и затем эффективно нацелены на критические регуляторы больных фенотипов клеток. Эстрогеновых рецепторов α (ERα) является одним из факторов транскрипции, регулирующих мастер программы генов, которые являются важными для эстрогеном рака молочной железы. Для того, чтобы понять, в роли сигнализации ERα в грудном метаболизма рака мы использовали транскриптомных, cistromic и метаболомики данные из клеток MCF-7, обработанных эстрадиола. В этом докладе мы описали поколение образцов для РНК-Seq, Обломок-Seq и экспериментов метаболомики и интегративной вычислительного анализа полученных данных. Этот подход полезен в разграничении новый мольмеханизмы и сосудистых генов регуляторных контуров, которые регулируются с помощью определенного фактора транскрипции, который влияет на метаболизм нормальных или патологических клетках.

Введение

Эстрогены являются важными регуляторами многих физиологических процессов в обеих женщин и мужчин в том числе репродуктивных тканей, нарушения обмена веществ, тканей головного мозга и костей 1. В дополнение к благотворное влияние в этих тканях, эстрогены также диск раковых заболеваний, которые возникают из молочной железы и репродуктивных тканей. Эстрогены в основном работают через ОЭ, чтобы вызвать специфические эффекты типа клеток. Глубокое секвенирование транскриптов регулируемых ERα использованием ERα ДНК анализа сайты связывания РНК-Seq и генома с использованием Обломок-Seq оказалось полезным, чтобы понять, как работает ERα в различных тканях и раковых заболеваний, которые возникают из них. Мы и другие опубликовали профили экспрессии генов , связанных с различными рецепторами (ERα против ERβ) 2,3, различных лигандов 3-5 и различных coregulators 2,4,6,7.

Секвенирование РНК является основным методом для изучения транскриптом, предлагая более высокую точность и эффективность по сравнению с микрочипов баАнализ экспрессии гена СЕПГ 8. РНК , полученной из клеточных линий 2-4,7, тканей или образцов опухолей упорядочиваются, сопоставляются с имеющимися геномных сборок и дифференциально регулируемых генов идентифицированы. Иммунопреципитации хроматина (ЧИП) используется для рассекают фактора транскрипции и coregulator хроматина связывания с известными сайтами связывания регуляторных. ЧИП-Seq (ЧИП следуют высокой пропускной последовательности) обеспечивает беспристрастную обнаружение глобальных сайтов связывания. Метаболомика является еще шире используется система биологии подход, который количественно измеряет, динамический многопараметрическая реакция живых систем на различные стимулы, включая химические вещества и генетических возмущений.

Выполнением глобального обмена веществ профилирование, функциональное считывание может быть получен из клеток, тканей и крови. Кроме того, информация из транскриптом экспериментов не всегда отражают реальные изменения в уровне ферментов, способствующих биохимических путей. комбинированныйанализ транскриптом и Метаболом данных позволяет идентифицировать и соотнести изменения в экспрессии генов с фактическими изменениями метаболита. Обуздывать информацию от всех этих крупномасштабных массивов данных обеспечивают механистические детали, чтобы понять роль транскрипционных факторов, регулирующих сложные биологические системы, особенно те, которые имеют отношение к развитию человека и таких заболеваний, как рак и диабет.

Сложный характер генома млекопитающих делает его сложно интегрировать и полностью интерпретировать данные, полученные из транскриптом, cistrome и Метаболом экспериментов. Определение функциональных связывания событий, которые приведут к изменениям в экспрессии генов-мишеней является важным, поскольку, как только функциональные сайты связывания идентифицированы; последующий анализ, в том числе транскрипции связывания (TF) анализа мотива, может быть выполнена с более высокой точностью. Это приводит к идентификации биологически значимых каскадами и механизмов TF. Также прямые comparisна РНК-Seq и ЧИП-Seq экспериментов не всегда возможно, так как данные из каждого эксперимента имеют различные масштабы и шумы, а в некоторых случаях значимые сигналы замутнено шумом населения. Мы не знаем каких-либо исследований, которые интегрированы информацию из этих трех независимых, но взаимосвязанных подходов, чтобы понять прямой регуляции метаболизма путем ERα при раке молочной железы. Таким образом, наша общая цель в этой статье, чтобы связать продуктивные связывания событий в экспрессии генов и изменения метаболита. Для достижения этой цели, мы интегрировали данные из РНК-Seq, чиповых ПОСЛ и метаболомики экспериментов и выявили те эстроген индуцированной ERα связывания событий, которые приведут к изменениям экспрессии генов в метаболических путях. Впервые, мы предоставляем полный набор протоколов (Рисунок 1) для генерации Обломок-Seq, РНК-Seq и метаболомика профилирование и проведение интегративный анализ данных для выявления новых схем генов , регулирующих метаболизм молочной железылиний раковых клеток.

протокол

1. Получение РНК-Seq Образцы

  1. Культура клеток и лечение
    1. Культуры клеток MCF7 в Improved MEM (ИМЭМ) плюс фенол-красный среде с добавлением 10% прогретой неактивной FBS, 1% пенициллина / стрептомицина при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 атмосферы.
      Примечание: Та же линия клеток и состояние культуры клеток используется на протяжении всего исследования.
    2. Семенной 100000 MCF7 клеток на лунку в 6-луночные планшеты. Есть трехкратном повторе для каждой обработки. На 3 -й день, извлеките носитель и добавьте 2 мл свежей среды с или без 10 -8 М E2 в каждую лунку. Инкубируйте пластин в течение 24 ч в 37 ° C в увлажненной 5% CO 2 атмосферы.
    3. Для сбора клеток, добавляют 1 мл выделения РНК реагента (кислота гуанидин тиоцианат-фенол-хлороформ) в каждую лунку и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Затем соберите клеточного лизата реагента с помощью пипетки и месторождения в 1,5 мл пробирки
  2. Выделение РНК
    1. Добавить 200 мкл chlorofoгт в 1 мл клеточного лизата реагента (1.1.3) и вихря в течение 10 сек. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Центрифуга образцов при 16000 х г в течение 15 мин при 4 ° С. После центрифугирования перенесите водной фазы (сверху) в новую пробирку, не нарушая других фаз.
    2. Добавить 500 мкл 100% изопропанола в новую пробирку с передаваемым-водную фазу, и взболтайте. Инкубируйте при -20 ° С в течение ночи. Центрифуга образцов при 16000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Отметим, гранулу в нижней части трубы. Удалите супернатант и промыть осадок с 750 мкл РНКазы 70% этанола путем кратковременного вихря.
    3. Центрифуга образцов при 6000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант, и центрифугирование образца при 16000 х г в течение 1 мин при температуре 4 ° С, чтобы собрать все оставшиеся этанола. Удалите остатки этанола с помощью пипетки с гель-наливного наконечника и установки трубы вверх-вниз стороне высохнуть на воздухе в течение 10 мин. Растворить осадок в 20-50 мкл DEPC обработанной воды висимостьDing от размера гранул.
  3. Очищают РНК с использованием РНК набора очистке согласно протоколу 4. Измерение концентрации РНК с использованием набора для анализа на основе флюометрия в соответствии с протоколом 9.
    Примечание: оптическую плотность при длине волны 260 нм берется для определения концентрации РНК и отношение оптической плотности при длине волны 260 нм и 280 нм, используют для определения чистоты образца. Рекомендуется проверять качество РНК с использованием био-анализатор анализа.
  4. Возьмите примерно от 0,5 до 1 мкг очищенной РНК для секвенирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Biotech центр готовит библиотеки секвенирования и выполняет парноконцевое чтения секвенирования с использованием методов , подробно описанных ранее 2.

2. Получение чиповых-Seq образца

  1. Культура клеток и лечение
    1. Семя 500000 MCF7 клеток на 10 см пластины в среде роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого тянуть вниз были использованы 16 пластин. На 3 -й день, удалите среду и добавляют 5 мл свежей среды с добавлением или без 10 -8 М E2 в каждойпластина. Treat клетки в течение 45 минут (37 & deg ; С в увлажненной атмосфере с 5% CO 2).
  2. Crosslink и Cell для уборки урожая
    1. Добавить 250 мкл 37% формальдегида в 5 мл среды сшивать хроматин, инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин. Прекратить сшивающий промыванием клеток с 5 мл охлажденного льдом 1х MEM.
    2. Сбора клеток в 250 мкл буфера для лизиса клеток (10 мМ ЭДТА, 50 мМ HCl, Tri 1% SDS, 0,5% N, N-оксида dimethyldodecan-1-амина) на одну пластину.
  3. Фрагментация хроматина
    1. Разрушать ультразвуком клетки в течение 30 сек х 8 на усилитель 30, чтобы достичь требуемых размеров хроматина. Охлаждают каждый образец на льду после обработки ультразвуком 30 сек.
    2. Центрифуга на 16, 000 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С, и осторожно пипеткой супернатант, не нарушая гранул в нижней части.
    3. Возьмем 5 мкл аликвоты надосадочной жидкости, и проверить размер ДНК с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле , как описано выше 10. Идеальный размерДНК должна быть в пределах 200-500 пар оснований.
  4. иммунопреципитации хроматина
    1. Сохранить 25 мкл клеточного лизата в качестве входных данных. В 50 мл пробирку, перемешивают 4 мл лизата клеток с 20 мл IP-буфера (2 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl и 0,5% Тритон Х), ERα антителом (500 мкл F10 и 500 мкл НС- 20), и 500 мкл Prota и ProtG белка покрытия магнитных шариков. Выдержите смесь путем вращения при 4 ° С в течение ночи, чтобы позволить образование chromatin- комплекса антител.
  5. Моет и обратного сшивание
    1. Используйте магнитную подставку для сбора магнитных шариков на намагниченной стороне, чтобы удалить промывочный буфер.
    2. Вымойте магнитных шариков в 25 мл промывочного буфера I (2 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис-HCl, 01% SDS, 1% Тритон Х и 150 мМ NaCl). Для того, чтобы тщательно промыть магнитные шарики, не нарушая ДНК-белковых комплексов, добавьте 25 мл моют медленно буфера к трубке вдоль стороны затем инвертировать трубки, пока все магнитные шарики не смешиваются хорошо Wiго промывочного буфера без появления в качестве гранул. В качестве альтернативы, использовать ротатор, чтобы инвертировать трубку. Не вихре образцы. Вымойте магнитных шариков, используя тот же метод в следующих шагах.
    3. Вымойте магнитных шариков в 25 мл промывочного буфера II (2 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис-HCl, 01% SDS, 1% Triton X и 500 мМ NaCl).
    4. Промыть магнитные гранулы в 25 мл промывочного буфера III (1,6 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-HCl, 1% NP-40, 1% Dexycholate и 250 мМ LiCl).
    5. Промыть магнитные гранулы в 25 мл 1х ТЕ-буфере (1 мМ ЭДТА и 10 мМ Трис-HCl) дважды.
    6. Элюции ДНК в 500 мкл буфера для элюции (1% SDS, и 10 мМ NaHCO 3) , а затем выделяют элюции 500 мкл ДНК в 4 пробирки. Для получения ДНК из входов, элюции ДНК в 125 мкл буфера для элюции.
    7. Инкубировать пробирки при 65 ° С в течение ночи на нагревательном блоке. Накройте трубы на нагревательном блоке с алюминиевой фольгой, чтобы сохранить тепло даже в течение всех труб. Поместите вес на трубы, чтобы удержать их от открытия.
  6. Выделение ДНК
    1. Охлаждают пробирки при комнатной температуре в течение 5 мин. Изолировать ДНК из ниспадающих образцов с использованием набора для выделения ДНК-чип. Следуйте инструкциям изготовителя.
      1. Разминка элюирующий буфер при 65 ° C. Добавить 625 мкл буфера для связывания в каждую пробирку. Если осадок формы, добавить еще 250 мкл буфера для связывания, пока раствор не станет прозрачным.
      2. Загрузить образец в колонку и центрифуге при 16000 х г в течение 30 сек. Вымойте образца с 250 мкл буфера для промывки. Не забудьте добавить этанол в промывной буфер, когда в первый раз, чтобы использовать его. Повторите мыть.
      3. Элюции ДНК в 15 мкл буфера для элюции. Объединить ДНК же тянуть вниз от 4-х труб, чтобы достичь около 55 мкл ДНК.
    2. Изолировать ДНК ввода с использованием очищающего ДНК Kit.
      1. Разминка элюирующий буфер при 65 ° C. Добавить 625 мкл буфера для связывания в каждую пробирку и инкубируют в течение 10 мин. Загрузите образец на колонку в collecti 2 млна трубке.
      2. Вымойте образца с 750 мкл промывочного буфера, центрифуге при 16000 мкг в течение 1 мин. Повторите центрифугирование для удаления остатков буфера. Элюции ДНК в 30 мкл EB.
    3. Мера концентрации ДНК с использованием коммерческого Флуорохром анализа с модификацией 11.
      1. Развести 20x TE буфера в 1x ТЕ в качестве буфера для анализа для разбавления образцов реагентов и ДНК. Возьмите 5 мкл выделенной ДНК и развести его в 50 мкл в 1x ТЕ.
      2. От 2 мкг / мл ДНК исходного раствора сделать стандартной ДНК в пределах от заготовки до 1, 10, 100, 1000 мкг / мл. В 96-луночный планшет, выделяют 25 мкл каждого стандарта, а также разбавление ДНК в двух экземплярах. (Рекомендуется Triplicate для стандарта.)
      3. Подготовить рабочий реагент, сделав 200-кратное разбавление от реагента дцДНК в буфере 1x ТЕ в пластиковой трубке. Накройте рабочего раствора реагента с алюминиевой фольгой, чтобы исключить воздействие света. Добавьте 200 мкл рабочего реагента в каждом образце. Вcubate при комнатной температуре в течение 5 мин. Закройте планшет с алюминиевой фольгой, чтобы исключить воздействие света.
      4. Измерьте цветение образцов с помощью ридера флуоресценции пластины (возбуждение при 480 нм, эмиссия 520 нм). Генерация стандартной кривой ДНК цветении в зависимости от концентрации ДНК. Определить концентрацию образцов на основании сгенерированной стандартной ДНК-кривой.
  7. Проверка чиповых эксперимент с использованием КПЦР
    1. Принимать по 2 мкл выделенной ДНК и разводили в 20 мкл в воде. Настройка реакции КПЦР в трех экземплярах путем смешивания 2,5 мкл разведения ДНК, 5 мкл Green I ПЦР основной смеси, 1 мкл праймера и 1,5 мкл нуклеазы свободной воды.
    2. Запуск КПЦР с быстрой системой ПЦР в реальном времени, используя следующую программу: Шаг 1: 95 ° C в течение 60 секунд, Шаг 2: 95 ° C в течение 10 сек, 60 ° C в течение 60 секунд, повторите шаг 2 39 раз.
  8. Отправить 10 нг образец ДНК в центре Biotech для секвенирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Biotecч Центр готовит ДНК стружку на библиотеки в соответствии с инструкцией, и выполняет ни одного чтения последовательности , используя методы , описанные ранее 2.

3. Метаболомика Анализ подготовки образцов

  1. Культура клеток и лечение
    1. Семя 400000 MCF7 клеток на 10 см пластины в среде роста. Для каждой обработки готовят три образца. С помощью двух пластин в каждом образце, чтобы получить достаточное количество клеток для обнаружения. На 3 -й день, удалите среду и добавляют 5 мл свежей среды с добавлением или без 10 -8 М E2 к клеткам. Treat клетки в течение 24 ч (37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2).
  2. Сбор образцов
    1. Добавьте 5 мл ледяной холод 1X PBS к плите, аспирация PBS после того, как на короткое время наклонить планшету несколько раз. Повторите два раза, и удалить как можно больше PBS, насколько это возможно после последней промывки.
    2. Добавить 750 мкл предварительно холодного ацетона в каждую чашку и царапать клетки. Объединяют клетки в ацетоне из двух пластин вв 2 мл пробирку на льду.
    3. Количество клеток для нормализации
      1. Для каждой обработки используют две дополнительные пластины для клеток количественной оценки. Для отмены прикрепления клеток из пластины, прибавляют 2 мл буферного (1x HBSS, 10 мМ HEPES, 0,075% NaHCO 3 и 1 мМ ЭДТА) в каждую тарелку и инкубировать в течение 5 мин.
      2. Сбор и хорошо перемешать клетки пипеткой клетки в буфере HE. Использование общей сложности 20 мкл раствора клеток для подсчета числа клеток с помощью гемоцитометра.
  3. Храните образцы при -80 ° С перед отправкой в ​​центр Metabolomics для идентификации и количественного определения метаболитов с помощью газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС) анализ.

4. интегративный анализ

  1. Секвенирование РНК Анализ данных:
    1. Выполните проверку качества FASTQ файлов с помощью FastQC: Чтение QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Выберите FastQC: Чтение под инструмент NGS: QC и манипуляцию. Загрузите файл исходных данных из текущего историу.
        Примечание: Рекомендуется, чтобы дать название для выходного файла, чтобы напомнить вам, что работа была для, так как там может быть несколько выходов.
    2. Выполнить и выходной файл появится в разделе истории. Повторите ту же процедуру для каждого файла последовательности. Обрезка адаптеры, использующие клип под NGS: FASTX Toolkit.
    3. Align читает hg19 с использованием Tophat2 с RefSeq генома эталонной аннотацию 12 (значения по умолчанию).
      1. Выберите Tophat2 под инструмент NGS: анализ РНК. Укажите библиотеку парного типа (одностороннего против парного).
      2. Загрузить файл ввода FASTQ из текущей истории. Выберите эталонный геном. Выберите настройки по умолчанию. Или использовать полный список параметров для изменения.
      3. Выполнить и он будет производить два выходных файла: один УСК BED трек перекрестков; еще один список чтения выравнивания в формате БАМ.
    4. Загрузить БАМ файлы для секвенирования инструмент анализа данных. Вычислить значения выражений с использованием Quantфикация Tool.
    5. Определение дифференцированно вверх-регулируемых генов с помощью Expression Analysis Tool , используя значения по умолчанию и сложите изменения> 2 и р-значение <0,05. Кроме того, определить дифференцированно понижающей регуляции генов с помощью Expression Analysis Tool, используя значения по умолчанию и сложите изменение <0,5 и р-значение <0,05.
  2. ЧИП-Seq Анализ данных:
    1. Совместите FASTQ Читает hg19 с использованием Bowtie2 13 (значения по умолчанию) в Галактике.
      1. Выберите Bowtie2 под инструмент НСК: Mapping. Проверьте, если библиотека мате непарных (один конец против парного). Загрузить файл FASTQ из текущей истории.
      2. Выберите эталонный геном. Используйте настройки параметров по умолчанию. Выполнить и он будет производить выходной файл с сопоставляется последовательность читает, как БАМ файла. Повторите эту процедуру для каждого файла последовательности.
    2. Определение пиков с использованием MACS 14 р-значение отсечки 6.0e-7 и FDR 0,01, как описано выше 2.
    3. Метаболомика Анализ данных:
      1. Преобразовать химические названия метаболитов KEGG_IDs.
      2. Выявление дифференциально регулируемых метаболитов путем сравнения уровней , обнаруженных в автомобиле против. E2 обработанных образцов (в 2 раза отсечка была использована в данном исследовании).
    4. Интегративный анализ:
      1. Выявление генов, которые имеют ERα сайты связывания с помощью инструмента анализа последовательности данных. Перевести Регионы к функции генов с помощью 20 кб как расстояние отсечкой.
      2. Идентифицировать дифференцированно вверх и вниз регулируемых генов из анализа данных РНК-Seq с использованием свёртки изменения> 2 и сложить изменение <0,5, соответственно , с р-значение <0,05 как отрезало. Сравнить в список ERα сайта связывания, содержащих гены с использованием Венна сравнения диаграмм.
      3. Используйте этот список , чтобы определить E2 модулированные пути метаболизма с использованием Metscape 15 модуля Cytoscape.
        1. Выбрав модуль Metscape из приложений, выберите Построить сеть, а затем путем распространения БАВОпция ред.
        2. Выберите Организм (человека). Выбрать файл данных E2 нерегулируемого списка соединения (KEGG ID), а Е2 повышающей регуляции список генов.
        3. Выберите Соединение -реакция -Enzyme-Gene в качестве типа сети. Выберите соединение / гены в качестве запроса.
        4. Построить сеть. Повторите с помощью Е2 вниз регулируемого соединения и генов.

Результаты

транскриптомика
Для анализа дифференциально выраженных генов путем обработки E2, мы решили выполнить РНК-Seq эксперимент. В дополнение к предоставлению информации об уровнях мРНК, РНК-Seq данные также могут быть использованы для мониторинга изменений в некодирующих...

Обсуждение

В этой статье мы описали поколение и интегративный анализ РНК-Seq, Обломок-Seq и данных метаболомики из клеток MCF-7, которые лечат с Е2. Мы разработали набор протоколов разработки стратегии использовать наиболее эффективные методы и удобный для пользователя мягкие изделия, которые произво?...

Раскрытие информации

Университет штата Иллинойс получил Investigator Начатое грант от компании Pfizer Inc. ZME и YCZ получил поддержку от зарплаты этого гранта.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами от Национального института продовольствия и сельского хозяйства, Министерства сельского хозяйства США, награду Illu-698-909 (ZME) и Pfizer, Inc (ZME). Его содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Министерства сельского хозяйства США.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Triglyceride MixSigma17810-1AMP-S
Oleic acid SigmaO1257-10MGOleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol ReagentLife technologies 15596-026
Dynabeads Protein ALife technologies 10006D
Dynabeads Protein GLife technologies 10007D
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28106DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit Zymo Research D5205ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay KitInvitrogen P7589DNA Quantitation
RNase-Free DNase SetQIAGEN79254RNA purification
DEPC Treated Water LIFE TECH462224Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic DismembratorFisher Scientific FB120110With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound EnclosureFisher Scientific FB-432-AFor sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 mlEppendorf 0030 119.401200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix NEBS1330S
DNTP MIXNEBN0447S
M-MuLV Reverse TranscriptaseNEBM0253S
FastStart SYBR Green MasterROCHE4673484001
AgaroseFisher BP1601001.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay KitLife technologies Q32852RNA quantification (100 assays) 
FormaldehydeSigmaF8775
Protease Inhibitor tablets Roche 4693116001Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail TabletsRoche 4906845001Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay KitsLife technologies Q32850For 100 assays
Automated cell counterORFLOMXZ000
tube Rotator VWR10136-084
Victor X5 Multilple plate reader PerkinElmer2030-0050
Microcentrifuge 5417REppendorf22621807
Magnetic StandDiagenodeB04000001 
Fast Real-time PCR systemApplied Science 4351405

Ссылки

  1. Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
  2. Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
  3. Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
  4. Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
  5. Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
  6. Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
  7. Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
  8. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  9. Invitrogen. . Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , (2008).
  10. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  11. . . Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , (2006).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  13. Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  15. Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
  16. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
  17. Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  20. Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

109SeqSeqcistrome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены