Biología de Sistemas de regulación metabólica por el estrógeno receptor de señalización en cáncer de mama

Resumen

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

Resumen

Con el advenimiento de los -ómicas aproxima a la comprensión de las enfermedades crónicas como el cáncer y el síndrome metabólico ha mejorado. Sin embargo, la minería eficaz de la información en los conjuntos de datos a gran escala que se obtienen de microarrays de expresión génica, los experimentos de secuenciación profundas o perfiles metabólicos es esencial para descubrir y luego efectivamente las reguladores críticos de fenotipos de células enfermas. Receptor de estrógeno α (ER) es uno de los factores de transcripción que regulan los programas maestro de genes que son importantes para los cánceres de mama estrógeno de respuesta. A fin de comprender el papel de ER de señalización en el metabolismo de cáncer de mama se utilizó transcriptomic datos, cistromic y metabolómicos a partir de células MCF-7 tratadas con estradiol. En este informe describimos la generación de muestras de ARN-Seq, chip-Sec y los experimentos de metabolómica y el análisis computacional de integración de los datos obtenidos. Este enfoque es útil para delinear novela molcular mecanismos y circuitos de regulación de genes que son regulados por un factor de transcripción particular que afecta el metabolismo de las células normales o enfermas.

Introducción

Los estrógenos son reguladores importantes de muchos procesos fisiológicos, tanto en hembras y machos, incluyendo los tejidos reproductivos, tejidos metabólicos, cerebro y hueso ^1. Además de los efectos beneficiosos en estos tejidos, los estrógenos también conducen los cánceres que surgen de mamaria y tejidos reproductores. Los estrógenos funcionan principalmente a través de las exigencias ambientales para inducir efectos específicos del tipo celular. secuenciación profunda de los transcritos regulados por ER ER usando ADN análisis de los sitios de unión de ARN-Sec y en todo el genoma utilizando el chip-Sec demostró ser útil para entender cómo funciona ER en diferentes tejidos y los cánceres que surgen de ellas. Nosotros y otros han publicado los perfiles de expresión de genes asociados con los receptores diferentes (ER) vs ^2,3 ERβ, diferentes ligandos ^3-5 y diferentes coregulators ^2,4,6,7.

RNA-Seq es el principal método para examinar el transcriptoma, que ofrece una mayor precisión y eficiencia en comparación con ba microarraysanálisis de la expresión génica de sed ^8. ARN obtenido a partir de líneas celulares ^2-4,7, tejidos o muestras tumorales están en secuencia, asignada a los conjuntos genómicas disponibles y se identifican los genes regulados diferencialmente. La inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) se emplea para diseccionar la unión a sitios de unión reguladoras conocidas cromatina factor de transcripción y coregulator. Chip-Sec (CHIP seguida de secuenciación de alto rendimiento) proporciona una detección imparcial de sitios de unión globales. La metabolómica es otro enfoque de la biología de sistemas cada vez más utilizada, que mide cuantitativamente, la respuesta multiparamétrico dinámica de los sistemas vivos, incluyendo a varios estímulos químicos y perturbaciones genéticas.

Mediante la realización de perfiles metabólicos global, una lectura funcional puede obtenerse a partir de células, tejidos y sangre. Además, la información de los experimentos del transcriptoma no siempre reflejan los cambios reales en el nivel de enzimas que contribuyen a las vías bioquímicas. ConjuntoEl análisis de los datos del transcriptoma y metabolome nos permite identificar y correlacionar los cambios en la expresión de genes con los cambios reales de metabolitos. El aprovechamiento de la información de todos estos grandes conjuntos de datos de escala proporcionan los detalles mecanicistas para comprender el papel de los factores de transcripción que regulan los sistemas biológicos complejos, especialmente los que se refieren al desarrollo humano y las enfermedades como el cáncer y la diabetes.

La naturaleza compleja del genoma de los mamíferos hace que sea difícil de integrar e interpretar los datos obtenidos de los experimentos del transcriptoma, cistrome y metabolome totalmente. La identificación de eventos de unión funcionales que puedan dar lugar a cambios en la expresión de los genes diana es importante porque se identifican los sitios de unión una vez funcionales; subsiguiente análisis, incluyendo la unión de transcripción (TF) motivo de análisis, se podría realizar con mayor precisión. Esto lleva a la identificación de las cascadas de TF biológicamente significativos y mecanismos. También Comparis directosen experimentos de RNA-Seq y Chip-Seq no siempre son posibles ya que los datos de cada experimento tienen diferentes escalas y ruidos, y en algunos casos las señales significativas están oscurecidas por el ruido de la población. No tenemos conocimiento de ningún estudio que integra información de estos tres enfoques independientes pero relacionados para entender la regulación metabólica de particular ER en el cáncer de mama. Por lo tanto, nuestro objetivo general de este trabajo es relacionar sucesos de unión productivos a la expresión de genes y cambios de metabolitos. Con el fin de lograr este objetivo, hemos integrado los datos de RNA-Seq, Chip-Seq y metabolómica experimentos y se identificaron los estrógenos inducida ER eventos que conducirían a cambios de expresión génica en las vías metabólicas de unión. Por primera vez, proporcionamos un conjunto completo de protocolos (Figura 1) para generar chip-Sec, el RNA-Seq y metabolómica perfiles y la realización de análisis integrador de los datos para descubrir nuevos circuitos de genes que regulan el metabolismo de mamalíneas celulares de cáncer.

Protocolo

1. Preparación de las muestras de RNA-Seq

1. Cultivo Celular y Tratamiento
   1. Cultivar las células MCF7 en una mejora de MEM (IMEM) más medio de rojo de fenol con 10% de calor inactiva FBS, 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ° C en 5% humidificado atmósfera de _CO2.
      Nota: La misma línea de células y condiciones de cultivo celular se utiliza durante todo el estudio.
   2. Semillas 100.000 células MCF7 por pocillo en placas de 6 pocillos. Tienen por triplicado para cada tratamiento. El día 3, se elimina el medio y añadir 2 ml de medio fresco con o sin 10 ^-8 M E2 a cada pocillo. Las placas se incuban durante 24 horas en 37 ° C en 5% humidificado atmósfera de CO _2.
   3. Para cosechar las células, añadir 1 ml de reactivo de aislamiento de ARN (tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo ácido) en cada pocillo y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente (RT). A continuación, recoger el reactivo de lisado celular con la pipeta y el depósito en tubos de 1,5 ml
2. Aislamiento de ARN
   1. Añadir 200 l chloroform al reactivo de 1 ml de lisado celular (1.1.3) y agitar durante 10 seg. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar las muestras a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, la transferencia de la fase acuosa (superior) a un nuevo tubo sin perturbar las otras fases.
   2. Añadir 500 l 100% de isopropanol a un nuevo tubo con la fase transferido acuoso, y se mezcla por inversión. Se incuba a -20 ° C durante la noche. Centrifugar las muestras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Observar un pellet en la parte inferior del tubo. Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado con 750 l de etanol libre de ARNasa 70% en breve vórtice.
   3. Centrifugar las muestras a 6.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y centrifugar la muestra a 16.000 xg durante 1 min a 4 ° C para recoger todo el etanol restante. Eliminar el etanol restante con la pipeta con una punta de carga de gel y fijar los tubos de hasta boca abajo para secar al aire durante 10 minutos. Disolver el precipitado en 20-50 l de agua tratada con DEPC depending en el tamaño de los gránulos.
3. Se purificó el ARN usando ARN kit de limpieza siguiendo el protocolo ^4. Medir la concentración de ARN utilizando un kit de ensayo basado fluorometrıa siguiendo el protocolo ^9.
   NOTA: DO a 260 nm se toma para determinar la concentración de ARN y la proporción de DO a 260 nm y 280 nm se usan para determinar la pureza de la muestra. Se recomienda la comprobación de la calidad del ARN usando un ensayo Bio-analizador.
4. Tomar aproximadamente 0,5 a 1 mg de ARN purificado para la secuenciación.
   NOTA: Centro de Biotecnología prepara las bibliotecas de secuenciación y realiza de extremo emparejado leer secuenciación utilizando métodos detallados anteriormente ^2.

2. Preparación de la muestra chip-Sec

1. Cultivo Celular y Tratamiento
   1. Seed 500.000 células MCF7 por placa de 10 cm en medio de crecimiento.
      NOTA: Para cada pull down Se han usado 16 placas. El día 3, se elimina el medio y añadir 5 ml de medio fresco con o sin 10 ^-8 M E2 a cadaplato. Tratar las células durante 45 minutos (37 ° C en un ambiente humidificado 5% de CO _2).
2. Reticulación y celular de cosecha
   1. Añadir 250 l 37% de formaldehído en 5 ml de medio para reticular la cromatina, se incuba a temperatura ambiente durante 15 min. Deja de reticulación mediante el lavado de las células con 5 ml de hielo frío 1x MEM.
   2. Recoger las células en 250 l de tampón de lisis celular (10 mM EDTA, mM Tri HCl 50, 1% SDS, N, N-óxido de dimethyldodecan-1-amina 0,5%) por placa.
3. La fragmentación de la cromatina
   1. Sonicar las células durante 30 seg x 8 al amplificador de 30 a alcanzar tamaños requeridos de la cromatina. Enfriar cada muestra en hielo después de un tratamiento con ultrasonidos de 30 segundos.
   2. Centrifugar a 16, 000 xg durante 10 min a 4 ° C, y con cuidado pipeta el sobrenadante sin perturbar el sedimento en la parte inferior.
   3. Tomar una alícuota de 5 l del sobrenadante, y comprobar el tamaño del ADN por electroforesis a través de gel de agarosa al 1,5% como se ha descrito previamente ^10. El tamaño idealde ADN debe estar entre 200-500 pb.
4. La inmunoprecipitación de la cromatina
   1. Guardar 25 l de lisado celular como entrada. En un tubo de 50 ml, mezclar 4 ml de lisado de células con 20 ml de tampón de IP (EDTA 2 mM, NaCl 100 mM, 20 mM Tris-HCl, y 0.5% de Triton X), anticuerpo ER (F10 500 l y 500 l HC- 20), y 500 l de proteína ProtA y protg recubrimiento de perlas magnéticas. Incubar la mezcla por rotación a 4 ° C durante la noche para permitir la formación de complejo anticuerpo cromatina.
5. Se lava y Reverse-reticulación
   1. Utilice un soporte magnético para recoger las perlas magnéticas en el lado magnetizado para eliminar el tampón de lavado.
   2. Lavar las perlas magnéticas en 25 ml de tampón de lavado I (2 mM EDTA, Tris HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X, y NaCl 150 mM). Para lavar las perlas magnéticas sin molestar a los complejos ADN-proteína, en 25 ml de tampón de lavado lentamente al tubo a lo largo del lado y luego invertir los tubos hasta que todas las bolas magnéticas son wi bien mezcladoth el tampón de lavado sin que parezca como una pastilla. Como alternativa, usar el rotador para invertir el tubo. No vórtice las muestras. Lavar las perlas magnéticas utilizando el mismo método en los pasos siguientes.
   3. Lavar las perlas magnéticas en 25 ml Wash-tampón II (EDTA 2 mM, Tris HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X, y NaCl 500 mM).
   4. Lavar las perlas magnéticas en 25 ml Wash-tampón III (EDTA 1,6 mM, Tris HCl 10 mM, 1% NP-40, 1% Dexycholate y 250 mM LiCl).
   5. Lavar las perlas magnéticas en 25 ml de tampón 1x TE (EDTA 1 mM, y mM Tris HCl 10) dos veces.
   6. Eluir el ADN en 500 l de tampón de elución (1% SDS, y 10 mM NaHCO ₃₎ y luego asignar la elución 500 DNA l en 4 tubos. Para el ADN de entradas, eluir el ADN en 125 l de tampón de elución.
   7. Incubar los tubos a 65 ° C durante la noche en un bloque de calentamiento. Cubra los tubos en el bloque de calentamiento con papel de aluminio para mantener el calor incluso a través de todos los tubos. Coloque un peso sobre los tubos para evitar que se abra.
6. Aislamiento de ADN
   1. Enfriar los tubos a temperatura ambiente durante 5 min. Aislar el ADN de las muestras desplegables usando el kit de aislamiento de ADN chip. Siga las instrucciones del fabricante.
      1. Calentar el tampón de elución a 65 ° C. Añadir 625 l de tampón de unión a cada tubo. Si los forma un precipitado, añadir otro tampón de unión 250 l hasta que la solución es clara.
      2. Cargar la muestra en la columna y se centrifuga a 16.000 xg durante 30 seg. Lavar la muestra con 250 l de tampón de lavado. Recuerda añadir etanol a la solución de lavado cuando la primera vez que lo utilizan. Repetir el lavado.
      3. Eluir el ADN en 15 tampón de elución l. Combinar el ADN de los mismos tire hacia abajo de 4 tubos para alcanzar alrededor de 55 l de ADN.
   2. Aislar el ADN de entrada utilizando un kit de purificación de ADN.
      1. Calentar el tampón de elución a 65 ° C. Añadir tampón de unión 625 l en cada tubo y se incuba durante 10 min. Cargar la muestra en la columna en un 2 ml collectien el tubo.
      2. Lavar la muestra con 750 l de tampón de lavado, centrifugar a 16.000 xg durante 1 min. Repetir la centrifugación para eliminar cualquier tampón restante. Eluir el ADN en 30 l de EB.
   3. Medir la concentración de ADN usando un fluorocromo Ensayo comercial con modificaciones ^11.
      1. Diluir el tampón 20x TE en 1x TE como el tampón de ensayo para la dilución de las muestras de reactivo y de ADN. Tomar 5 l de ADN aislado y diluir en 50 l en 1x TE.
      2. De DNA / ml de solución madre 2 mg hacer un estándar de ADN que van desde blanco a 1, 10, 100, 1000 g / ml. En una placa de 96 pocillos, destinar 25 l de cada estándar, así como la dilución de ADN por duplicado. (Se recomienda triplicado para el estándar.)
      3. Prepare el reactivo de trabajo al hacer una dilución de 200 veces de reactivo de ADN de doble cadena en tampón 1x TE en tubo de plástico. Cubrir la solución de reactivo de trabajo con papel de aluminio para evitar la luz. Añadir 200 l de reactivo de trabajo en cada muestra. EnCubate a temperatura ambiente durante 5 min. Cubrir la placa con papel de aluminio para evitar la luz.
      4. Medir la fluorescencia de las muestras usando un lector de placas de fluorescencia (excitación a 480 nm, emisión 520 nm). Generar la curva estándar de ADN de fluorescencia frente a la concentración de ADN. Determinar las concentraciones de las muestras en base a la curva estándar de ADN generado.
7. Verificación del Experimento chip usando qPCR
   1. Tomar 2 l de ADN aisladas y se diluyeron en 20 l de agua. Configurar la reacción qPCR por triplicado mediante la mezcla de 2,5 l de dilución de ADN, 5 l Green I PCR Master Mix, 1 l de cebador, y 1,5 l de agua libre de nucleasa.
   2. Ejecutar la qPCR con el sistema de PCR en tiempo real rápida utilizando el siguiente programa: Paso 1: 95 ° C durante 60 segundos, Paso 2: 95 ° C durante 10 s, 60ºC durante 60 segundos, repita el paso 2 39 veces.
8. Continuar 10 ng muestra de ADN al centro de biotecnología para la secuenciación.
   NOTA: El Bioteccentro h prepara el chip de ADN en las bibliotecas de acuerdo a la instrucción, y lleva a cabo la secuenciación de lectura simple, que utiliza métodos detallados anteriormente ^2.

3. Preparación de la muestra de ensayo metabolómica

1. Cultivo Celular y Tratamiento
   1. Semilla de 400.000 células MCF7 por placa de 10 cm en medio de crecimiento. Para cada tratamiento preparar tres muestras. Utilizar dos placas en cada muestra para recibir suficientes células para la detección. El día 3, se elimina el medio y añadir 5 ml de medio fresco con o sin 10 ^-8 M E2 a las células. Tratar las células durante 24 horas (37 ° C en un ambiente humidificado 5% de CO _2).
2. Coleccion de muestra
   1. Añadir 5 ml de hielo frío 1x PBS a la placa, aspirar el PBS después de inclinar brevemente la placa varias veces. Repetir dos veces, y eliminar la mayor cantidad de PBS como sea posible después del último lavado.
   2. Añadir 750 l de acetona fría previamente a cada placa y raspar las células. Se combinan las células en acetona a partir de dos placas ena un tubo de 2 ml en hielo.
   3. recuento de células para la normalización
      1. Para cada tratamiento, utilizar dos placas adicionales para la cuantificación celular. Para des-unir las células de la placa, añadir 2 ml de tampón HE (1x HBSS, HEPES 10 mM, 0,075% de _NaHCO3, y EDTA 1 mM) en cada placa e incubar durante 5 minutos.
      2. Recoger y mezclar bien las células pipeteando las células en el tampón HE. Utilice total de 20 l solución de células para contar el número de células usando un hemocitómetro.
3. Almacenar las muestras a -80 ° C antes de enviarlo al centro de la metabolómica para identificar y cuantificar los metabolitos utilizando el análisis de cromatografía de gases espectrometría de masas (GC-MS).

4. Análisis Integral

1. RNA-Seq Análisis de datos:
   1. Realizar la comprobación de la calidad de los archivos utilizando FASTQ FastQC: Lee QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Seleccionar FastQC: Leer debajo de la herramienta de NGS: control de calidad y la manipulación. Sube el archivo de datos brutos de Histor actualy.
         NOTA: Se recomienda dar un título para el archivo de salida para recordarle que lo que era el trabajo para ya que podría haber varias salidas.
   2. Ejecutar el archivo de salida y aparecerá debajo de la Historia. Repetir el mismo procedimiento para cada archivo de secuencia. adaptadores de recorte usando el clip bajo NGS: FASTX Toolkit.
   3. Align lee a hg19 utilizando Tophat2 con genoma RefSeq anotación de referencia ¹² (valores por defecto).
      1. Seleccionar Tophat2 bajo herramienta de NGS: análisis de ARN. Indicar la biblioteca de tipo apareado (single-end-vs final emparejado).
      2. Sube el archivo de entrada FASTQ de la historia actual. Seleccione el genoma de referencia. Elija los valores por defecto. O utilizar la lista completa de los parámetros que desee modificar.
      3. Ejecutar y producirá dos archivos de salida: uno es UCSC pista lecho de uniones; otra es una lista de las alineaciones de lectura en formato BAM.
   4. Subir archivos BAM a la herramienta de análisis de datos de secuenciación. Calcular los valores de expresión utilizando QuantHerramienta ficación.
   5. Identificar los genes diferencialmente regulados hasta utilizando la herramienta de análisis de expresión utilizando los valores por defecto y doble cambio> 2 y el valor p <0,05. Del mismo modo, identificar los genes regulados diferencialmente abajo utilizando la herramienta de análisis de expresión utilizando los valores por defecto y doble cambio <0,5 y el valor p <0,05.
2. Análisis de Datos chip-Sec:
   1. Alinear FASTQ lee a hg19 utilizando Bowtie2 ¹³ (valores por defecto) en el Galaxy.
      1. Seleccionar Bowtie2 bajo la herramienta de NSC: Mapping. Verificar si la biblioteca es mate-emparejado (un solo extremo vs-extremo emparejado). Sube el archivo FASTQ de la historia actual.
      2. Seleccione el genoma de referencia. Utilice los ajustes de los parámetros por defecto. Ejecutar y producirá archivo de salida con la secuencia asignada texto es el archivo de BAM. Repita el procedimiento para cada archivo de secuencia.
   2. Identificar los picos utilizando MACS ¹⁴ un p-valor de corte de 6.0e-7 y FDR de 0,01, como se ha descrito anteriormente ^2.
3. Análisis de Datos metabolómica:
   1. Convertir nombres químicos de los metabolitos de KEGG_IDs.
   2. Identificar metabolitos regulados diferencialmente mediante la comparación de los niveles detectados en el vehículo vs. E2 muestras (a 2 veces de corte fue utilizado en este estudio) a tratar.
4. Análisis de integración:
   1. Identificar los genes que tienen sitios de unión ER utilizando la herramienta de análisis de datos de secuenciación. Traducir Regiones de la función de genes usando 20 kb como la distancia de corte.
   2. Identificar los genes diferencialmente arriba y hacia abajo regulada de análisis de datos de RNA-Seq utilizando factor de cambio> 2 veces el cambio y <0,5, respectivamente, con el valor de p <0,05 como cortada. Comparar a la lista de ER sitio de unión que contienen genes utilizando Venn diagrama de comparación.
   3. Utilice esta lista para identificar las vías metabólicas E2 moduladas usando Metscape ¹⁵ módulo de Cytoscape.
      1. Al seleccionar el módulo Metscape de aplicaciones, elija Generar red y después la vía-basopción ed.
      2. Seleccione el organismo (humano). Seleccione el archivo de datos de la lista de E2 compuesto no reglamentada (KEGG ID), así E2 hasta reguladas lista de genes.
      3. Elija el Compuesto -Reacción -Enzyme-Gen como el tipo de red. Elija compuestos / genes como la consulta.
      4. Construir la red. Repita con el compuesto E2 y genes regulados.

Resultados

transcriptómica
Para el análisis de los genes expresados ​​diferencialmente por E2 tratamiento, se optó por realizar un experimento de RNA-Seq. Además de proporcionar información sobre los niveles de ARNm, los datos de RNA-Seq también se pueden utilizar para controlar los cambios en (largos ARNs no codificantes, microRNAs) no codificantes de ARN y eventos de splicing alternativo. Nosotros no proporcionamos información sobre el análisis de los genes no codificantes ARN ...

Discusión

En este artículo, describimos la generación y análisis integrador de la metabolómica datos de RNA-Seq, chip-Sec y de las células MCF-7 que son tratadas con E2. Hemos desarrollado un conjunto de protocolos strategizing para utilizar los métodos más eficientes y amigables mercancías suaves usuario que producen descubrimiento biológicamente relevante. A nuestro entender, el nuestro es el primer estudio para integrar -ómicas datos de tres análisis diferentes y nuevas vías metabólicas identificadas que ER regula...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triglyceride Mix	Sigma	17810-1AMP-S
Oleic acid	Sigma	O1257-10MG	Oleic Acid-Water Soluble powder
TRIzol Reagent	Life technologies	15596-026
Dynabeads Protein A	Life technologies	10006D
Dynabeads Protein G	Life technologies	10007D
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28106	DNA isolation of input sample
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit	Zymo Research	D5205	ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit	Invitrogen	P7589	DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set	QIAGEN	79254	RNA purification
DEPC Treated Water	LIFE TECH	462224	Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB120110	With 1/8 probe
Fisher Scientific Sound Enclosure	Fisher Scientific	FB-432-A	For sound reduction
Eppendorf Tubes 5.0 ml	Eppendorf	0030 119.401	200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix	NEB	S1330S
DNTP MIX	NEB	N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase	NEB	M0253S
FastStart SYBR Green Master	ROCHE	4673484001
Agarose	Fisher	BP160100	1.5% agarose gel
Qubit RNA HS Assay Kit	Life technologies	Q32852	RNA quantification (100 assays)
Formaldehyde	Sigma	F8775
Protease Inhibitor tablets	Roche	4693116001	Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	4906845001	Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits	Life technologies	Q32850	For 100 assays
Automated cell counter	ORFLO	MXZ000
tube Rotator	VWR	10136-084
Victor X5 Multilple plate reader	PerkinElmer	2030-0050
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807
Magnetic Stand	Diagenode	B04000001
Fast Real-time PCR system	Applied Science	4351405