Meme Kanserinde Östrojen Reseptör Sinyali tarafından Metabolik Yönetmelik Sistem Biyolojisi

Özet

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

Özet

-omics gelişine kanser ve metabolik sendrom gibi kronik hastalıkların anlayışımız geliştirdi yaklaşır. Ancak, gen ifade mikroarrayler, derin sıralama deneyleri veya metabolik profil elde edilen büyük ölçekli veri kümelerinde bilginin etkin madencilik ortaya çıkarmak önemlidir ve daha sonra etkili bir şekilde hastalıklı hücre fenotipleri kritik düzenleyiciler hedef. Östrojen Reseptör α (ÖRa) östrojen duyarlı meme kanseri için önemli olan gen programları düzenleyen ana transkripsiyon faktörlerinin biri. ÖRa meme kanseri metabolizmasında sinyalleme rolünü anlamak için, biz estradiol ile tedavi edilmiş MCF-7 hücrelerinden, transkriptomik cistromic ve metabolomic verilerini kullanarak. Bu yazıda RNA Sek, ChIP-Sek ve metabolomikler deneyleri ve elde edilen verilerin bütünleştirici hesaplama analizi için numune nesil nitelendirdi. Bu yaklaşım, yeni köstebek ortaya koymaya yararlıdırnormal veya hastalıklı hücrelerin etkileri metabolizması, belirli bir transkripsiyon faktörü ile düzenlenmiştir vasküler mekanizmaları ve gen düzenleyici devre.

Giriş

Östrojenler, üreme organı dokularında metabolik dokular, beyin ve kemik ¹ de dahil olmak üzere, her iki kadın ve erkeklerde çok sayıda fizyolojik süreçte önemli regülatörleridir. bu dokularda yararlı etkilerine ek olarak, östrojenler meme ve yeniden üretici dokulara ortaya çıkan kanserlerin sürücü. Östrojenler esas hücre tipi özel etkilere neden Erler ile çalışmak. ChIP-Seq kullanarak RNA Seq ve genom ÖRa DNA bağlayıcı siteleri analizi kullanılarak ÖRa tarafından düzenlenen transkript derin sıralama ÖRa bunlardan kaynaklanan farklı dokularda ve kanserlerde nasıl çalıştığını anlamak için yararlı olduğunu kanıtladı. Biz ve diğerleri gen ifadesi (ÖRP vs ÖRa) farklı reseptörler ile ilişkili profilleri ^2,3, farklı ligandlar ^3-5 ve farklı koregülatörleri ^2,4,6,7 yayınladı.

RNA Seq mikroarray ba göre daha yüksek hassasiyet ve verimlilik sunan transcriptome incelemek için ana yöntemsed gen ekspresyon analizi ^8. Hücre hatları ^2-4,7, doku veya tümör örneklerinden elde edilen RNA mevcut genomik meclisleri eşleştirilir, dizilir ve ayrı düzenlenmiş genler tanımlanmıştır. Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) bilinen düzenleme bağlanma sitelerinin bağlanma transkripsiyon faktörü ve coregulator kromatin incelemek için kullanılır. ChIP-Seq (yüksek verimlilik sıralaması takip ChIP) Küresel bağlama siteleri tarafsız algılanmasını sağlar. Metabolomik başka giderek kullanılan sistem biyolojisi yaklaşımı, nicel önlemler, kimyasallar ve genetik perturbations dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara canlı sistemlerin dinamik multiparametrik yanıttır.

Genel metabolik profil gerçekleştirilerek etkin bir okuma hücre, doku, kan elde edilebilir. Buna ek olarak, transcriptome deneyler bilgi her zaman biyokimyasal yollar katkı enzim seviyesinde gerçek değişiklikleri yansıtmıyor. kombinetranskriptom ve metabolome verilerinin analizi, tespit ve gerçek metabolit değişikliklerle gen ifadesinde bir değişiklik ilişkili olanak sağlamaktadır. Bu büyük ölçekli veri setleri mekanistik ayrıntıları tüm bilgileri Harnessing kompleks biyolojik sistemler, insan gelişimi ve kanser ve diyabet gibi hastalıklara ilgilendirmeyen özellikle olanları düzenleyen transkripsiyon faktörlerinin rolünü anlamak için.

memeli genomunun karmaşık doğası zorlu entegre ve tam transcriptome, cistrome ve metabolome deneylerden elde edilen verileri yorumlamak için yapar. bir zamanlar işlevsel bağlanma siteleri tanımlanır çünkü hedef genlerin ifadesi önemlidir değişikliklere yol açacak fonksiyonel bağlayıcı olayları belirlenmesi; transkripsiyon bağlanma (TF) motif analizi de dahil olmak üzere, analiz takip eden, yüksek hassasiyetle gerçekleştirilebilir. Bu biyolojik olarak anlamlı TF basamak ve mekanizmaların tanımlanmasına yol açar. Ayrıca doğrudan comparisHer bir deneyden alınan veriler terazi ve sesler farklı ve bazı durumlarda anlamlı sinyalleri popülasyon gürültü ile gizlenmiş olan RNA-Seq ve yonga-Seq deneylerin her zaman mümkün değildir. Biz meme kanseri ÖRa doğrudan metabolik düzenleme anlamak için bu üç bağımsız ancak ilgili yaklaşımlardan bilgi entegre herhangi çalışmanın farkında değildir. Bu nedenle, bu yazıda bizim genel amacı gen ifadesi ve metabolit değişikliklere üretken bağlayıcı olayları ilişkilendirmek olduğunu. Bu hedefe ulaşmak için, biz RNA Sek, ChIP-Seq ve metabolomikler deneylerden elde edilen verilerin entegre ve metabolik yollar gen ifadesi değişikliklere yol açacak olayları bağlama ÖRa kaynaklı olanlar östrojen belirledi. İlk kez, biz meme metabolizmasını düzenleyen yeni gen devreleri ortaya çıkarmak için ChIP-Seq, RNA Seq ve metabolomik profil üreten ve veri bütünleştirici analizini gerçekleştirmek için protokoller (Şekil 1) komple bir set sağlamakkanser hücre çizgileri.

Protokol

RNA-Seq Örneklerin hazırlanması 1.

1. Hücre Kültürü ve İşlem
   1. Kültür Geliştirilmiş MEM (IMEM) artı% 10 ısıl aktif olmayan FBS,% 1 penisilin / nemlendirilmiş% 5 _CO2 atmosferinde 37 ° C 'de streptomisin ile fenol-kırmızısı bir ortam içinde MCF7 hücreleri.
      Not: Aynı hücre dizisi ve hücre kültürü durum çalışma boyunca kullanılır.
   2. 6-delikli plakalardaki oyuk başına tohum 100,000 MCF7 hücreleri. Her tedavi için triplicates var. 3 gün, orta kaldırmak ve ya her kuyuya 10 ^-8 M E2 olmadan 2 ml taze orta ekleyin. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferinde 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edin.
   3. hücreleri hasat etmek için, her bir 1 ml RNA izolasyonu reaktifi (asit guanidinyum thiosiyanat-fenol-kloroform) ilave edilir ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (RT) enkübe edilir. Sonra 1.5 ml tüpler içine pipetle ve mevduat hücre lizatı reaktifi toplamak
2. RNA izolasyonu
   1. 200 ul chlorofo ekleme10 saniye boyunca, 1 ml hücre lizatı reaktifi (1.1.3) ve vorteks RM. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüj örnekleri. Santrifüj işleminin ardından, diğer fazlar bozmadan yeni bir tüpe sulu fazın (üst) aktarın.
   2. transfer sulu faz yeni bir tüpe 500 ul% 100 izopropanol ekleyin ve üst edilerek karıştırılır. -20 ° C sıcaklıkta gece boyunca inkübe edilir. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri. tüpün alt kısmında bir pelet gözlemleyin. Süpernatantı atın ve kısa girdap tarafından 750 ul RNaz ücretsiz% 70 etanol ile pelet yıkayın.
   3. Santrifüj örnekler 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca 6,000 x g'de. Süpernatantı, ve geriye kalan etanolü toplamak için 4 ° C'de 1 dakika için 16,000 x g'de santrifüjleyin. 10 dakika boyunca kurumaya aşağı yukarı tarafı tüpleri bir jel yükleme ucu ile pipetleme kalan etanol çıkarın ve ayarlayın. bağımlılığındaki 20-50 ul DEPC arıtılmış su pelet çözülürpelet boyutuna ding.
3. Protokolü ⁴ Aşağıdaki RNA temizleme kiti kullanılarak RNA arındırın. ⁹ protokolü izlenerek fluorometri bazlı analiz kiti kullanılarak RNA konsantrasyonu ölçümü.
   Not: 260 nm'de OD, 260 nm'de OD RNA konsantrasyonu ve oranı tayin edilir ve 280 nm Örnek saflığını belirlemek için kullanılır. Bu Biyo-analizör analizi kullanılarak RNA kalitesini kontrol tavsiye edilir.
4. sekanslama için yaklaşık 0,5-1 ug saflaştırılmış RNA al.
   NOT: Biyoteknoloji merkezi sıralama kütüphaneleri hazırlar ve paired-end önceden ² detaylı yöntemler kullanılarak sıralama okuma gerçekleştirir.

ChIP-Seq Numune 2. Hazırlık

1. Hücre Kültürü ve İşlem
   1. Tohum büyüme ortamında 10 cm plaka başına 500.000 MCF7 hücreleri.
      NOT: Her aşağı çekme için 16 tabak kullanıldı. 3 gün, orta kaldırmak ve ya her 10 ^-8 M E2 olmadan 5 ml taze orta ekleyinplaka. 45 dakika (nemlendirilmiş _bir% 5 _CO2 atmosferinde 37 ° C) için hücreleri tedavi.
2. Çapraz bağ ve Hücre Hasat
   1. Kromatine çapraz bağlanması, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe 5 ml ortam içine 250 ul% 37 formaldehid ekleyin. 5 ml buz 1x MEM ile hücrelerin yıkayarak çapraz bağlanması durdurun.
   2. plaka başına 250 ul hücre lisis tamponu (10 mM EDTA, 50 mM Tris HCI,% 1 SDS,% 0.5 N, N-dimethyldodecan-1-amin oksit) hücreleri hasat.
3. Kromatin parçalanması
   1. Gerekli kromatin boyutlarını ulaşmak için 30 amp 30 sn x 8 hücreleri sonikasyon. 30 saniyelik bir Sonikasyon sonrasında, buz üzerinde her bir örnek soğutun.
   2. Santrifüj 16 °, 000, 4 ° C'de 10 dakika süre ile xg, ve dikkatli bir şekilde alt pelet bozmadan üstte yüzen madde pipet.
   3. Süpernatan 5 ul tablet alın ve daha önce tarif edildiği gibi ^10,% 1.5 agaroz jeli içinden elektroforez ile DNA boyutunu kontrol edin. ideal boyutDNA 200-500 bp arasında olmalıdır.
4. kromatin immünopresipitasyon
   1. giriş olarak hücre lizatı 25 ul kaydedin. 50 ml'lik bir tüp içinde, 20 mi, IP tampon maddesi (2 mM EDTA, 100 mM NaCI, 20 mM Tris-HCl ve% 0.5 Triton X), ÖRa antikoru (500 ul F10 ve 500 ul hücre lisatı 4 ml karıştırın HC- 20) ve 500 ul PROTA ve ProtG proteini manyetik boncuklar kaplanması. chromatin- antikor kompleksinin oluşumuna izin vermek için 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca dönmesi ile inkübe karışımı.
5. Yıkar ve Ters çapraz
   1. yıkama tamponu çıkarmak için manyetize tarafında manyetik boncuk toplamak için manyetik standı kullanın.
   2. 25 ml yıkama tampon maddesi içinde manyetik boncuklar yıkayın I (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCI,% 01 SDS,% 1 Triton X ve 150 mM NaCI). iyice 25ml tüm manyetik boncuk karışık kuyu wi kadar sonra tüpler ters tarafı boyunca tüp yavaşça yıkama tamponu ekleyin DNA Protein kompleksleri bozmadan manyetik boncuk yıkamak içinBir pelet olarak görünmeden yıkama tamponu th. Bir alternatif olarak, tüp ters için rotator kullanımı. örnekleri vorteks etmeyin. aşağıdaki adımları aynı yöntem kullanılarak, manyetik boncuk yıkayın.
   3. 25 ml yıkama tamponu II (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCI,% 01 SDS,% 1 Triton X, 500 mM NaCİ) içinde manyetik boncuk yıkayın.
   4. 25 ml yıkama tampon III manyetik boncuk yıkayın (1.6 mM EDTA, 10 mM Tris HCI,% 1 NP-40,% 1 Dexycholate 250 mM LiCİ).
   5. iki kez 25 mi 1X TE tampon maddesi (1 mM EDTA, 10 mM Tris HCI) manyetik boncuk yıkayın.
   6. 500 ul Elüsyon tamponunda DNA Zehir (% 1 SDS ve 10 mM _NaHCO3) ve daha sonra 4 tüpler içine 500 ul DNA elüsyon tahsis. girişlerden DNA için, 125 ul Elüsyon tamponunda DNA Zehir.
   7. bir ısıtma bloğu üzerinde gece boyunca 65 ° C'de inkübe edin. hatta tüm tüpleri üzerinde ısı tutmak için alüminyum folyo ile ısıtma bloğu tüpleri örtün. açılış onları tutmak için borular üzerinde bir ağırlık koyun.
6. DNA izolasyonu
   1. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında tüpler soğutun. ChIP DNA izolasyon kiti kullanılarak aşağı çekme örneklerinden DNA izole. üreticiden yönergeleri izleyin.
      1. 65 ° C'de elüsyon tamponu ısıtın. Her tüpe bağlayıcı tampon 625 ul ekle. Çözelti berraklaşıncaya kadar çökelti oluşmazsa, başka bir 250 ul bağlayıcı tampon eklemek.
      2. 30 saniye boyunca 16.000 xg'de sütun ve santrifüj üzerine örnek yükleyin. 250 ul yıkama tamponu ile örnek yıkayın. İlk kez ne zaman kullanılacağını yıkama tamponu etanol eklemeyi unutmayın. yıkama tekrarlayın.
      3. 15 ul Elüsyon tamponunda DNA Zehir. Aynı DNA yaklaşık 55 ul DNA elde etmek için 4 tüpler aşağı çekme birleştirin.
   2. DNA izolasyon kiti kullanılarak Girdi DNA izole.
      1. 65 ° C'de elüsyon tamponu ısıtın. Her bir tüp içinde 625 ul bağlayıcı tampon ilave edin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. 2 ml collecti kolona örnek yükleyintüp.
      2. 1 dakika boyunca 16,000 xg'de 750 ul yıkama tamponu, santrifüj ile örnek yıkayın. herhangi bir geri kalan tampon çıkarmak için santrifüj tekrarlanır. EB 30 ul içine DNA Zehir.
   3. Modifikasyon ¹¹ ile Ticari Florokrom Test kullanma DNA Konsantrasyon ölçün.
      1. reaktif ve DNA örneklerinin seyreltilmesi için tahlil tamponu olarak 1x TE içine 20x TE tampon sulandırmak. 5 ul izole edilen DNA almak ve 1X TE 50 ul içinde seyreltin.
      2. 2 ug / ml DNA stok solüsyonundan boş 1, 10, 100, 1000 ug / ml arasında değişen bir DNA standart hale. 96 oyuklu bir plaka içerisinde, 25 her bir standart ul olarak kopya DNA seyreltme ayırmaktadır. (Standart Triplicate tavsiye edilir.)
      3. Plastik tüp içinde 1X TE tamponu içinde dsDNA reaktif bir 200-kat seyreltme yapılarak çalışma reaktifi hazırlayın. ışık önlemek için alüminyum folyo ile çalışan reaktif çözümü örtün. Her numune içine reaktifi çalışan 200 ul ekleyin. İçinde5 dakika boyunca oda sıcaklığında cubate. ışık önlemek için alüminyum folyo ile plaka örtün.
      4. (480 nm, emisyon 520 nm uyarma), bir floresan plaka okuyucu kullanarak örneklerin floresans ölçün. DNA konsantrasyonuna karşı çiçeklenme DNA standart eğri oluşturmak. oluşturulan DNA, standart eğrisine göre numune konsantrasyonları belirlenir.
7. qPCR kullanarak ChIP Deney doğrulanması
   1. DNA izole edilmiş ve su içinde 20 ul seyreltilmiş 2 ul alır. 2.5 ul DNA seyreltme, 5 ul Green I PCR master karışımı, 1 ul astar ve 1.5 ul nükleaz ücretsiz su karıştırılarak üç nüsha olarak qPCR reaksiyonu ayarlayın.
   2. Aşağıdaki programı kullanarak Hızlı Real-Time PCR sistemi ile qPCR çalıştırın: Adım 1: 95 ° C 60 saniye, Adım 2: 60 saniye tekrarlayın Adım 2 39 kez 10 saniye süreyle 95 ° C, 60 ° C.
8. sıralama için Biotech merkezine 10 ng DNA örneği gönderin.
   NOT: Biotech merkezi talimatına göre kütüphaneler içine ChIP DNA hazırlar ve daha önce ² detaylı yöntemler kullanılarak tek okunan sıralama yapar.

3. Metabolomik Deneyi Numune Hazırlama

1. Hücre Kültürü ve İşlem
   1. Tohum büyüme ortamında 10 cm plaka başına 400.000 MCF7 hücreleri. Her tedavi için üç numune hazırlamak. tespiti için yeterli hücre almak için her bir örnek iki tabak kullanın. 3 gün, orta kaldırmak ve hücrelere veya 10 ^-8 M E2 olmadan 5 ml taze orta ekleyin. 24 saat (nemlendirilmiş _bir% 5 _CO2 atmosferinde 37 ° C) için hücreleri tedavi.
2. Örnek koleksiyon
   1. , Plaka PBS 1x 5 ml buz soğuk ekle kısaca plaka birkaç kez devirme sonra PBS aspire. İki kez tekrarlayın ve son yıkamadan sonra mümkün olduğunca PBS kaldırmak.
   2. Her bir plaka için önceden soğuk aseton 750 ul ilave edin ve hücreleri kazıyın. iki plakalardan aseton hücreleri birleştirmekBuz üzerinde 2 ml tüp.
   3. normalleşmesi için hücre sayımı
      1. Her bir muamele için, hücre ölçümü için fazladan iki tabak kullanın. Için, hücreleri plakadan de takmak O, her plaka (1 x HBSS, 10 mM HEPES,% 0.075 NaHCO ₃ ve 1 mM EDTA) tampon ve 5 dakika için inkübe 2 ml ekleyin.
      2. Toplayın ve HE tampon hücreleri pipetleme iyice hücreleri karıştırın. hemasitometre kullanarak hücre sayısını saymak için 20 ul hücre çözüm toplam kullanın.
3. belirlemek ve gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (GC-MS) analizi kullanılarak metabolitleri ölçmek için Metabolomik merkezine göndermeden önce -80 ° C'de örnekleri saklayın.

4. Bütünleştirici Analizi

1. RNA Dizi veri analizi:
   1. FastQC kullanarak fastq dosyalarının Kalite kontrolü yapın: Okuma QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. FastQC seçin: NGS ve aracı altında Oku: QC ve manipülasyon. Geçerli histor gelen ham veri dosyası yükleY.
         NOT: Çıktı dosyası işi birden çıkışları olabilir çünkü için ne hatırlatmak için bir başlık vermek için tavsiye edilir.
   2. Yürütme ve çıktı dosya Tarih altında görünecektir. Her dizi dosya için aynı işlemi tekrarlayın. FASTX Toolkit: NGS altında Clip kullanarak Trim adaptörler.
   3. Hizala RefSeq genom referans açıklama ¹² (varsayılan değerler) ile Tophat2 kullanarak hg19 için okur.
      1. NGS bir aracı altında Tophat2 seçin: RNA analizi. kütüphane eşleştirilmiş tipini (eşleştirilmiş sonu vs tek uçlu) belirtiniz.
      2. Geçerli tarihin giriş fastq dosyasını yükleyin. Referans genomunu seçin. varsayılan ayarları seçin. Ya da değiştirmek için tam parametre listesini kullanın.
      3. Yürütme ve iki çıkış dosyaları üretecek: Bir kavşak UCSC YATAK pist; Başka bir BAM formatında okuma güzergahlarının bir listesidir.
   4. dizi veri analizi aracı BAM dosyalarını yükleyin. Quant kullanarak ifade değerlerini hesaplamakification Aracı.
   5. Varsayılan değerleri kullanarak İfade Analizi Aracı'nı kullanarak farklı şekilde yukarı regüle genleri tanımlamak ve değişim> 2 ve p-değeri <0.05 katlayın. Aynı şekilde, varsayılan değerleri kullanarak İfade Analizi Aracı'nı kullanarak farklı şekilde aşağı regüle genleri tanımlamak ve değişim <0,5 ve p-değeri <0.05 katlayın.
2. ChIP-Seq Veri Analizi:
   1. Align fastq Galaxy Bowtie2 ¹³ (Varsayılan Değerler) kullanarak hg19 okur.
      1. MGK aracı altında Bowtie2 seçin: Mapping. kütüphane arkadaşı-eşleştirilmiş (eşleştirilmiş sonu vs tek uçlu) ise doğrulayın. Geçerli tarihinin fastq dosyasını yükleyin.
      2. Referans genomunu seçin. varsayılan parametre ayarları kullanın. Yürütme ve eşlenen dizisi BAM dosya olarak okur ile çıkış dosyası üretecektir. Her dizi dosyası için aynı işlemi tekrarlayın.
   2. Daha önce ² açıklandığı gibi, MACS ¹⁴ 6.0E-7 bir p değeri kesme ve 0.01 FDR kullanarak doruklarına tanımlayın.
3. Metabolomik Veri Analizi:
   1. KEGG_IDs metabolitlerin kimyasal isimleri dönüştürün.
   2. V. E2 Araç tespit seviyeleri karşılaştırılarak ayrı düzenlenmiş metabolitleri kısmını (2 kat kesme bu çalışmada kullanılmıştır) örnekleri işlemden geçirildi.
4. Bütünleştirici analiz:
   1. dizi veri analizi aracını kullanarak ÖRa bağlama siteleri genleri belirlemek. mesafe cut-off olarak 20 kb kullanarak genler işlev Bölgeler çevirin.
   2. Kesilmiş sırasıyla p değeri <0.05 olan katlık değişime> 2 kullanılarak RNA Seq veri analizinden farklı olarak yukarı ve aşağı düzenlenen genleri tanımlamak ve değişim <0,5 kat. Venn şeması karşılaştırma kullanılarak ÖRa bağlanma yeri içeren genlerin listesine karşılaştırın.
   3. Cytoscape ve Metscape ¹⁵ modülünü kullanarak E2 modüle metabolik yolları belirlemek için bu listeyi kullanın.
      1. apps Metscape modülü seçerek, ağ ve ardından yolu-bas oluşturun seçined seçeneği.
      2. Organizma (Insan) seçin. E2 düzensiz bileşik listesinin seç veri dosyası (KEGG ID) yanı sıra E2 gen listesi up-regüle.
      3. Ağ türü olarak -Reaction Enzim-Gene Bileşik seçin. sorgu olarak bileşik / genleri seçin.
      4. ağ kurmak. E2 aşağı regüle bileşik ve genler kullanılarak tekrarlayın.

Sonuçlar

transkriptomik
E2 tedavisi ile farklı ifade genleri analiz etmek, biz bir RNA-Seq deney gerçekleştirmek için seçti. mRNA seviyeleri ile ilgili bilgilerin yanı sıra, RNA-Seq veriler, kodlayıcı olmayan RNA (uzun kodlayıcı olmayan RNA'lar, mikroRNAlar) ve alternatif bağlayıcı olayları değişiklikleri izlemek için de kullanılabilir. Çalışmamızın kapsamı metabolik düzenlenmesi için önemli olan protein kodlama genleri tanımlamak için olduğundan biz, RNA...

Tartışmalar

Bu yazıda, E2 ile tedavi edilir MCF-7 hücrelerinden üretimini ve RNA-Sek, ChIP-Sek ve metabolomikler verilerinin bütünleştirici analizini nitelendirdi. Biz biyolojik ilgili keşif üretmek en etkin yöntem ve kullanıcı dostu yumuşak mallar kullanmak için strateji protokoller bir dizi geliştirdi. Bildiğimiz kadarıyla, bizim üç farklı analiz ve ÖRa doğrudan meme kanseri hücrelerinde düzenlenmiş belirlenen yeni metabolik yollar dan -omics verileri entegre etmek ilk çalışmadır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triglyceride Mix	Sigma	17810-1AMP-S
Oleic acid	Sigma	O1257-10MG	Oleic Acid-Water Soluble powder
TRIzol Reagent	Life technologies	15596-026
Dynabeads Protein A	Life technologies	10006D
Dynabeads Protein G	Life technologies	10007D
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28106	DNA isolation of input sample
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit	Zymo Research	D5205	ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit	Invitrogen	P7589	DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set	QIAGEN	79254	RNA purification
DEPC Treated Water	LIFE TECH	462224	Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB120110	With 1/8 probe
Fisher Scientific Sound Enclosure	Fisher Scientific	FB-432-A	For sound reduction
Eppendorf Tubes 5.0 ml	Eppendorf	0030 119.401	200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix	NEB	S1330S
DNTP MIX	NEB	N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase	NEB	M0253S
FastStart SYBR Green Master	ROCHE	4673484001
Agarose	Fisher	BP160100	1.5% agarose gel
Qubit RNA HS Assay Kit	Life technologies	Q32852	RNA quantification (100 assays)
Formaldehyde	Sigma	F8775
Protease Inhibitor tablets	Roche	4693116001	Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	4906845001	Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits	Life technologies	Q32850	For 100 assays
Automated cell counter	ORFLO	MXZ000
tube Rotator	VWR	10136-084
Victor X5 Multilple plate reader	PerkinElmer	2030-0050
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807
Magnetic Stand	Diagenode	B04000001
Fast Real-time PCR system	Applied Science	4351405