Systems Biology di regolazione metabolica da Estrogen Receptor Signaling nel cancro al seno

Riepilogo

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

Abstract

Con l'avvento dei -omica si avvicina la nostra comprensione delle malattie croniche come il cancro e la sindrome metabolica è migliorata. Tuttavia, efficace estrazione di informazioni contenute nei set di dati di grandi dimensioni che si ottengono da microarray di espressione genica, esperimenti di sequenziamento profonde o profili metabolici è essenziale per scoprire e quindi efficacemente indirizzare i regolatori critici del fenotipo delle cellule malate. Estrogen Receptor α (ERα) è uno dei fattori di trascrizione maestro che regolano i programmi genetici che sono importanti per i tumori al seno estrogeno sensibili. Al fine di comprendere il ruolo di ERα segnalazione in seno metabolismo del cancro abbiamo utilizzato i dati trascrittomica, cistromic e metabolomica da MCF-7 cellule trattate con estradiolo. In questa relazione abbiamo descritto la generazione di campioni per l'RNA-Seq, Chip-Seq e gli esperimenti di metabolomica e l'analisi computazionale integrativa dei dati ottenuti. Questo approccio è utile nel delineare romanzo talpameccanismi colari e circuiti gene regolatore che sono regolati da un particolare fattore di trascrizione che impatti il ​​metabolismo delle cellule normali o malati.

Introduzione

Gli estrogeni sono importanti regolatori di molti processi fisiologici in entrambi i maschi e femmine, tra cui tessuti riproduttivi, tessuti metabolici, cervello e ossa ^1. Oltre ai benefici effetti in questi tessuti, estrogeni guidare anche i tumori che derivano da mammaria e tessuti riproduttivi. Estrogeni lavorano principalmente attraverso ER per indurre effetti specifici tipo di cellula. sequenziamento profondo delle trascrizioni regolate da ERα utilizzando RNA-Seq e genome-wide ERα DNA analisi siti di legame con ChIP-Seq ha dimostrato di essere utile per capire come funziona ERα in diversi tessuti e tumori che ne derivano. Noi e altri abbiamo pubblicato profili di espressione genica associati a recettori diversi (ERα vs ERβ) ^2,3, differenti ligandi ^3-5 e diverse coregulators ^2,4,6,7.

RNA-Seq è il metodo principale per esaminare il trascrittoma, offrendo una maggiore precisione ed efficienza rispetto a ba microarraygene sed analisi di espressione ^8. RNA ottenuto da linee cellulari ^2-4,7, tessuti o campioni di tumore sono in sequenza, mappato alle assemblee genomiche disponibili e geni differenzialmente regolati sono identificati. Immunoprecipitazione della cromatina (chip) è impiegato per sezionare il fattore di trascrizione e coregulator legame con noti siti di normative vincolanti cromatina. ChIP-Seq (ChIP seguita da alta sequenziamento rendimento) fornisce il rilevamento imparziale dei siti di legame a livello mondiale. Metabolomica è un altro approccio di sistema biologico sempre più utilizzato, che quantitativamente misure, risposta multiparametrica dinamica dei sistemi viventi a vari stimoli, tra cui i prodotti chimici e le perturbazioni genetiche.

Eseguendo profilo metabolico globale, una lettura funzionale può essere ottenuta da cellule, tessuti, e sangue. Inoltre, le informazioni da esperimenti trascrittoma non riflettono sempre i cambiamenti reali nel livello di enzimi che contribuiscono alla vie biochimiche. Combinatoanalisi dei dati trascrittoma e metaboloma ci permette di identificare e correlare i cambiamenti nell'espressione genica con i cambiamenti dei metaboliti attuali. Sfruttando le informazioni provenienti da tutti questi gruppi di dati su larga scala forniscono i dettagli meccanicistici per comprendere il ruolo dei fattori di trascrizione che regolano i sistemi biologici complessi, in particolare quelli che riguardano lo sviluppo e malattie come il cancro e il diabete umano.

La natura complessa del genoma dei mammiferi rende difficile integrare e interpretare i dati ottenuti dagli esperimenti trascrittoma, cistrome e metaboloma completamente. Identificare gli eventi di legame funzionali che avrebbe portato a cambiamenti nell'espressione dei geni bersaglio è importante perché una volta che i siti di legame funzionali sono identificati; conseguente analisi, tra cui vincolante di trascrizione (TF) analisi motivo, potrebbero essere eseguite con maggiore accuratezza. Questo porta alla identificazione di cascate TF biologicamente significativi e meccanismi. Comparis anche direttisu esperimenti RNA-Seq e Chip-Seq non sempre possibile in quanto i dati di ciascun esperimento sono diverse scale e rumori e in alcuni casi segnali significativi vengono oscurati dal rumore popolazione. Non siamo a conoscenza di alcun studio che integra le informazioni da questi tre approcci indipendenti ma collegati per capire la regolazione metabolica diretta da ERα nel cancro al seno. Pertanto, il nostro obiettivo generale di questo lavoro è di mettere in relazione gli eventi produttivi vincolanti alle espressione genica e le modifiche dei metaboliti. Al fine di raggiungere questo obiettivo, abbiamo integrato i dati da RNA-Seq, Chip-Seq esperimenti e metabolomica e individuato i estrogeni indotti ERα eventi che avrebbero portato a cambiamenti di espressione genica in vie metaboliche vincolante. Per la prima volta, mettiamo a disposizione un set completo di protocolli (Figura 1) per la generazione di ChIP-Seq, RNA-Seq e metabolomica profiling e l'esecuzione di analisi integrativa dei dati per scoprire circuiti genici romanzo che regolano il metabolismo del senolinee cellulari di cancro.

Protocollo

1. Preparazione di campioni di RNA-Seq

1. Colture cellulari e trattamento
   1. Cultura le cellule MCF7 in MEM Improved (IMEM) più medium fenolo-rosso con 10% di calore inattiva FBS, 1% di penicillina / streptomicina a 37 ° C in umidificata 5% CO ₂ nell'atmosfera.
      Nota: linea cellulare stesso e condizioni di coltura cellulare viene utilizzato nel corso dello studio.
   2. Seed 100.000 cellule MCF7 per pozzetto in 6 pozzetti. Hanno triplicato per ogni trattamento. Il giorno 3, rimuovere il supporto e aggiungere 2 ml di terreno fresco con o senza 10 ^-8 M E2 in ogni pozzetto. Incubare le piastre per 24 ore a 37 ° C in umidificata 5% CO ₂ nell'atmosfera.
   3. Per raccogliere le cellule, aggiungere 1 ml di isolamento dell'RNA reattivo (acido guanidina tiocianato-fenolo-cloroformio) in ciascun pozzetto e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Poi raccogliere il reagente lisato cellulare pipettando e deposito in provette da 1,5 ml
2. Isolamento RNA
   1. Aggiungere 200 ml chloroform a 1 ml di lisato cellulare reattivo (1.1.3) e vortex per 10 secondi. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 15 min a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase acquosa (superiore) in una nuova provetta senza disturbare le altre fasi.
   2. Aggiungere 500 microlitri 100% di isopropanolo in un tubo con la fase trasferita-acquosa, e mescolare invertendo. Incubare a -20 ° C per una notte. Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C. Osservare una pellet sul fondo della provetta. Eliminare il surnatante e lavare il pellet con 750 microlitri RNasi-free 70% di etanolo da breve vortice.
   3. Centrifugare i campioni a 6.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e centrifugare il campione a 16.000 xg per 1 min a 4 ° C per raccogliere tutto l'etanolo residuo. Rimuovere l'etanolo residuo pipettando con una punta di gel-carico e impostare i tubi fino rivolto verso il basso per asciugare per 10 minuti. Sciogliere il pellet in 20-50 acqua DEPC trattati ul Depending delle dimensioni del pellet.
3. Purificare l'RNA utilizzando RNA kit di pulizia seguendo il protocollo ^4. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando un kit di test fluorimetria basato seguendo il protocollo ^9.
   NOTA: OD a 260 nm è presa per determinare la concentrazione di RNA e il rapporto di OD a 260 nm e 280 nm sono utilizzati per determinare la purezza del campione. Si raccomanda il controllo della qualità RNA utilizzando test Bio-analizzatore.
4. Prendere circa 0,5 a 1 mg di RNA purificato per il sequenziamento.
   NOTA: il centro Biotech prepara le librerie di sequenziamento ed esegue abbinato-end leggere sequenziamento utilizzando metodi precedentemente descritti ^2.

2. Preparazione del campione ChIP-Seq

1. Colture cellulari e trattamento
   1. Seed 500.000 cellule MCF7 ogni 10 cm Piatto in terreno di crescita.
      NOTA: Per ogni tirare verso il basso sono stati utilizzati 16 tavole. Il giorno 3, rimuovere il supporto e aggiungere 5 ml di terreno fresco con o senza 10 ^-8 M E2 a ognipiatto. Trattare le cellule per 45 min (37 ° C in umidificata 5% CO ₂ atmosfera).
2. Reticolazione e Cell Harvest
   1. Aggiungere 250 microlitri 37% di formaldeide in 5 ml di mezzo di reticolare cromatina, incubare a temperatura ambiente per 15 min. Smettere di reticolazione lavando le cellule con 5 ml di ghiaccio freddo 1x MEM.
   2. Raccogliere le cellule in 250 microlitri cellulare Lysis buffer (10 mM EDTA, 50 mM Tri HCl, 1% SDS, 0,5% N, N-ossido dimethyldodecan-1-ammina) per piastra.
3. La frammentazione della cromatina
   1. Sonicare le cellule per 30 sec x 8 a amplificatore di 30 per raggiungere dimensioni cromatina richiesti. Raffreddare ogni campione sul ghiaccio dopo una sonicazione di 30 sec.
   2. Centrifugare a 16, 000 xg per 10 min a 4 ° C, e con attenzione a pipetta il sopranatante senza disturbare il pellet sul fondo.
   3. Prendete una un'aliquota 5 ml del surnatante, e controllare la dimensione del DNA mediante elettroforesi attraverso 1,5% gel di agarosio come descritto in precedenza ^10. La dimensione idealedi DNA deve essere compreso tra 200-500 bp.
4. immunoprecipitazione della cromatina
   1. Risparmia il 25 microlitri di lisato cellulare come input. In un tubo da 50 ml, mescolare 4 ml di lisato cellulare con 20 ml di tampone di IP (2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, e 0,5% Triton X), anticorpo ERα (500 microlitri F10 e 500 microlitri HC- 20), e 500 microlitri Prota e protg proteine ​​rivestimento sfere magnetiche. Incubare la miscela per rotazione a 4 ° C durante la notte per consentire la formazione di anticorpo chromatin-.
5. Lavaggi e Reverse-reticolazione
   1. Utilizzare un supporto magnetico per raccogliere le perline magnetiche sul lato magnetizzato per rimuovere il tampone di lavaggio.
   2. Lavare le perline magnetiche in 25 ml di tampone di lavaggio I (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, e 150 mM NaCl). Per lavare accuratamente le sfere magnetiche senza disturbare complessi DNA-proteina, aggiungere 25 ml di tampone di lavaggio lentamente al tubo lungo il lato poi invertire i tubi fino a quando tutte le sfere magnetiche sono misti ben with il tampone di lavaggio senza apparire come una pallina. In alternativa, utilizzare il rotatore per invertire il tubo. Non vortice dei campioni. Lavare le perline magnetiche con lo stesso metodo nelle seguenti fasi.
   3. Lavare le perline magnetiche in 25 ml di lavaggio-buffer II (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, e 500 mM NaCl).
   4. Lavare le sfere magnetiche in 25 ml di lavaggio-buffer III (1,6 mm EDTA, 10 mM Tris HCl, 1% NP-40, 1% Dexycholate e 250 mm LiCl).
   5. Lavare le perline magnetiche in 25 ml 1x tampone TE (1 mM EDTA e 10 mM Tris HCl) due volte.
   6. Eluire il DNA in 500 microlitri tampone di eluizione (1% SDS, e 10 mm NaHCO ₃₎ e poi assegnare l'eluizione 500 microlitri DNA in 4 tubi. Per il DNA da ingressi, eluire il DNA in 125 microlitri tampone di eluizione.
   7. Incubare le provette a 65 ° C durante la notte su un blocco riscaldante. Coprire le provette sul blocco di riscaldamento con un foglio di alluminio per mantenere il calore anche su tutti i tubi. Mettere un peso sui tubi per impedire loro di apertura.
6. Isolamento del DNA
   1. Raffreddare le provette a temperatura ambiente per 5 min. Isolare il DNA da campioni di tirare verso il basso utilizzando il kit di isolamento DNA chip. Seguire le istruzioni del produttore.
      1. Riscaldare il tampone di eluizione a 65 ° C. Aggiungere 625 microlitri di buffer di legame per ogni provetta. Se le forme precipitato, aggiungere un altro tampone di legame 250 microlitri fino a quando la soluzione è chiara.
      2. Caricare il campione attraverso la colonna e centrifugare a 16.000 xg per 30 sec. Lavare il campione con 250 ml di tampone di lavaggio. Ricordarsi di aggiungere etanolo al tampone di lavaggio quando prima volta usarlo. Ripetere il lavaggio.
      3. Eluire il DNA in 15 microlitri tampone di eluizione. Combina il DNA della stessa tirare giù da 4 tubi per ottenere circa 55 ml di DNA.
   2. Isolare il DNA ingresso utilizzando un kit di purificazione del DNA.
      1. Riscaldare il tampone di eluizione a 65 ° C. Aggiungere 625 microlitri di buffer di legame in ogni provetta e incubare per 10 min. Caricare il campione attraverso la colonna in 2 ml collectisul tubo.
      2. Lavare il campione con 750 microlitri tampone di lavaggio, centrifugare a 16.000 xg per 1 min. Ripetere centrifugazione per eliminare ogni residuo di buffer. Eluire il DNA in 30 ml di EB.
   3. Misurare la concentrazione di DNA Utilizzando un commerciale Fluorocromo Assay con Modifica ^11.
      1. Diluire il tampone TE 20x in 1x TE come tampone per diluire i campioni dei reagenti e del DNA. Prendere 5 ml DNA isolato e diluirlo in 50 ml di 1x TE.
      2. Da / DNA ml di soluzione 2 mg fare uno standard di DNA che vanno dal bianco per 1, 10, 100, 1000 mg / ml. In un piatto ben 96, allocare 25 ml di ogni standard così come la diluizione del DNA in duplice copia. (Si consiglia triplicato per standard.)
      3. Preparare il reagente di lavoro facendo una diluizione 200 volte da dsDNA reagente in tampone 1x TE in tubo di plastica. Coprire la soluzione reagente di lavoro con un foglio di alluminio per evitare la luce. Aggiungere 200 ml di reagente di lavoro in ogni campione. Incubate a temperatura ambiente per 5 min. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per evitare la luce.
      4. Misurare la fluorescenza dei campioni utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza (eccitazione a 480 nm, emissione 520 nm). Generare la curva standard del DNA di fluorescenza in funzione della concentrazione di DNA. Determinare le concentrazioni dei campioni in base alla curva standard generata DNA.
7. Verifica della ChIP esperimento utilizzando qPCR
   1. Take 2 ml isolate DNA e diluito in 20 ml di acqua. Impostare la reazione qPCR in triplice copia mescolando 2,5 ml di diluizione del DNA, 5 ml Green I PCR Master Mix, 1 ml di primer, e 1,5 ml di acqua priva di nucleasi.
   2. Eseguire il qPCR con il sistema rapido Real-Time PCR utilizzando il seguente programma: Fase 1: 95 ° C per 60 sec, Fase 2: 95 ° C per 10 secondi, 60 ° C per 60 secondi, ripetere il punto 2 39 volte.
8. Invia campione di DNA 10 ng per il centro Biotech per il sequenziamento.
   NOTA: Il Biotech Centro prepara il DNA ChIP in librerie in base alle istruzioni, ed esegue la sequenza singola lettura utilizzando metodi precedentemente descritti ^2.

3. Metabolomica Assay Preparazione del campione

1. Colture cellulari e trattamento
   1. Seed 400.000 cellule MCF7 ogni 10 cm Piatto in terreno di crescita. Per ogni trattamento preparare tre campioni. Utilizzare due piastre in ciascun campione per ricevere abbastanza cellule per la rilevazione. Il giorno 3, rimuovere il supporto e aggiungere 5 ml di terreno fresco con o senza 10 ^-8 M E2 alle cellule. Trattare le cellule per 24 ore (37 ° C in umidificata 5% CO ₂ atmosfera).
2. Raccolta dei campioni
   1. Aggiungere 5 ml ghiacciata PBS 1x alla piastra, aspirare il PBS dopo breve inclinando la piastra più volte. Ripetere due volte, e rimuovere il più PBS possibile dopo l'ultimo lavaggio.
   2. Aggiungere 750 ml di acetone pre-freddo per ciascuna piastra e raschiare le cellule. Combinare le cellule in acetone da due piastre ain una provetta 2 ml su ghiaccio.
   3. conta delle cellule per la normalizzazione
      1. Per ogni trattamento, usare due piastre supplementari per la quantificazione delle cellule. Per de-fissare le cellule dalla piastra, aggiungere 2 ml di SE tampone (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO _{3 e} 1 mM EDTA) in ogni piatto e incubare per 5 min.
      2. Raccogliere e mescolare bene le cellule pipettando le cellule nel buffer HE. Utilizzare totale di 20 microlitri soluzione cella per contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
3. Conservare i campioni a -80 ° C prima di inviare al centro Metabolomica di identificare e quantificare i metaboliti mediante gascromatografia spettrometria di massa (GC-MS) analisi.

4. Analisi Integrativa

1. RNA-Seq Analisi dei dati:
   1. Eseguire il controllo qualità dei file FASTQ utilizzando FastQC: Leggi QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Selezionare FastQC: Leggere sotto lo strumento di NGS: QC e manipolazione. Carica il file di dati grezzi da histor correntey.
         NOTA: Si raccomanda di dare un titolo per il file di output per ricordare ciò che il lavoro è stato per dato che ci potrebbe essere più uscite.
   2. Esegui e apparirà il file di output sotto la Storia. Ripetere la stessa procedura per ogni file di sequenza. adattatori trim mediante clip in NGS: FASTX Toolkit.
   3. Allinea legge per hg19 utilizzando Tophat2 con RefSeq genoma di riferimento annotazione ¹² (valori di default).
      1. Selezionare Tophat2 sotto strumento di NGS: analisi di RNA. Indicare libreria di tipo accoppiato (single-end vs abbinato-end).
      2. Carica il file di input FASTQ dalla storia attuale. Selezionare il genoma di riferimento. Scegliere le impostazioni predefinite. Oppure utilizzare l'elenco dei parametri completo da modificare.
      3. Esegui e produrrà due file di output: uno è UCSC LETTO traccia di raccordi; un altro è un elenco di allineamenti di lettura in formato BAM.
   4. Caricare file BAM di strumento di analisi dei dati di sequenziamento. Calcolare i valori di espressione utilizzando QuantStrumento ification.
   5. Identificare geni differenzialmente up-regolati utilizzando Expression Analysis Tool utilizzando i valori predefiniti e ripiegare il cambiamento> 2 e p-value <0.05. Allo stesso modo, identificare i geni differenzialmente down-regolato utilizzando Expression Analysis Tool utilizzando i valori predefiniti e ripiegare il cambiamento <0,5 e p-value <0.05.
2. ChIP-Seq Analisi dei dati:
   1. Allineare FASTQ Legge di hg19 utilizzando Bowtie2 ¹³ (valori di default) in Galaxy.
      1. Selezionare Bowtie2 sotto lo strumento di NSC: Mapping. Verificare se la libreria è mate-abbinato (single-end vs abbinato-end). Carica il file FASTQ dalla storia attuale.
      2. Selezionare il genoma di riferimento. Utilizzare le impostazioni dei parametri di default. Esegui e produrrà file di output con la sequenza mappata legge come file di BAM. Ripetere la procedura per ogni file di sequenza.
   2. Identificare i picchi che utilizzano MACS ¹⁴ un valore p di taglio del 6.0e-7 e FDR di 0,01, come descritto in precedenza ^2.
3. Metabolomica Analisi dei dati:
   1. Convertire nomi chimici dei metaboliti di KEGG_IDs.
   2. Identificare metaboliti differenziale regolamentati confrontando i livelli rilevati nel veicolo vs. E2 trattati campioni (2 volte cut-off è stato utilizzato in questo studio).
4. Analisi Integrativa:
   1. Identificare i geni che hanno siti di legame ERα utilizzando lo strumento di analisi dei dati di sequenziamento. Tradurre Regioni alla funzione geni utilizzando 20 kb come distanza di cut-off.
   2. Identificare geni differenzialmente l'alto e verso il basso-regolato dalla analisi dei dati di RNA-Seq utilizzando cambiamento fold> 2 e ripiegare il cambiamento <0,5, rispettivamente, con il p-value <0.05 come tagliare. Confrontare l'elenco dei ERα sito di legame che contengono geni che utilizzano Venn confronto diagramma.
   3. Utilizzare questo elenco per identificare E2 vie metaboliche modulati utilizzando il modulo Metscape ¹⁵ di Cytoscape.
      1. Selezionando modulo Metscape da applicazioni, scegliere costruire una rete e poi pathway-basopzione ed.
      2. Selezionare l'Organismo (umano). Selezionare file di dati di E2 elenco composto non regolamentata (KEGG ID) e E2 up-regolata lista gene.
      3. Scegli Composto -Reaction -Enzyme-Gene come tipo di rete. Scegli composti / geni come la query.
      4. Costruire una rete. Ripetere con l'E2 down-regolato composto e geni.

Risultati

trascrittomica
Per analizzare i geni espressi in modo differenziale di trattamento E2, abbiamo scelto di eseguire un esperimento di RNA-Seq. Oltre a fornire informazioni sui livelli di mRNA, sequenze di Rna-Seq possono anche essere utilizzati per monitorare i cambiamenti (RNA lunghi non codificanti, microRNA) non codificanti RNA e gli eventi di splicing alternativo. Noi non forniamo informazioni sull'analisi dei geni non codificanti RNA o, in alternativa trascritte, in quanto ...

Discussione

In questo articolo, abbiamo descritto la generazione e l'analisi integrativo di RNA-Seq, Chip-Seq dati e metabolomica da cellule MCF-7 che sono trattati con E2. Abbiamo sviluppato una serie di protocolli strategizing di utilizzare i metodi più efficienti e user-friendly articoli molli che producono scoperta biologicamente rilevanti. A nostra conoscenza, il nostro è il primo studio a integrare omiche dati provenienti da tre diverse analisi e nuove vie metaboliche identificate che ERα regolato direttamente nelle ce...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triglyceride Mix	Sigma	17810-1AMP-S
Oleic acid	Sigma	O1257-10MG	Oleic Acid-Water Soluble powder
TRIzol Reagent	Life technologies	15596-026
Dynabeads Protein A	Life technologies	10006D
Dynabeads Protein G	Life technologies	10007D
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28106	DNA isolation of input sample
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit	Zymo Research	D5205	ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit	Invitrogen	P7589	DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set	QIAGEN	79254	RNA purification
DEPC Treated Water	LIFE TECH	462224	Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB120110	With 1/8 probe
Fisher Scientific Sound Enclosure	Fisher Scientific	FB-432-A	For sound reduction
Eppendorf Tubes 5.0 ml	Eppendorf	0030 119.401	200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix	NEB	S1330S
DNTP MIX	NEB	N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase	NEB	M0253S
FastStart SYBR Green Master	ROCHE	4673484001
Agarose	Fisher	BP160100	1.5% agarose gel
Qubit RNA HS Assay Kit	Life technologies	Q32852	RNA quantification (100 assays)
Formaldehyde	Sigma	F8775
Protease Inhibitor tablets	Roche	4693116001	Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	4906845001	Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits	Life technologies	Q32850	For 100 assays
Automated cell counter	ORFLO	MXZ000
tube Rotator	VWR	10136-084
Victor X5 Multilple plate reader	PerkinElmer	2030-0050
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807
Magnetic Stand	Diagenode	B04000001
Fast Real-time PCR system	Applied Science	4351405