Biologie des systèmes de régulation métabolique par Estrogen Receptor Signaling dans le cancer du sein

Résumé

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

Résumé

Avec l'avènement des -omiques approches notre compréhension des maladies chroniques comme le cancer et le syndrome métabolique est améliorée. Cependant, l'exploitation minière efficace de l'information dans les ensembles de données à grande échelle qui sont obtenus à partir des microarrays d'expression des gènes, des expériences de séquençage profondes ou le profilage métabolique est indispensable pour découvrir et cibler efficacement les régulateurs critiques de phénotypes cellulaires malades. Estrogen Receptor α (ERa) est l'un des facteurs de transcription maître régissant les programmes de gènes qui sont importants pour les cancers du sein sensibles aux œstrogènes. Afin de comprendre au rôle du ERa de signalisation dans le métabolisme du cancer du sein, nous avons utilisé des données transcriptomiques, cistromic et métabolomique de MCF-7 cellules traitées avec l'estradiol. Dans ce rapport, nous avons décrit la génération d'échantillons pour l'ARN-Seq, ChIP-Seq et expériences de métabolomique et l'analyse informatique intégrative des données obtenues. Cette approche est utile pour délimiter roman taupemécanismes culaire et circuits de gènes de régulation qui sont réglementés par un facteur de transcription particulier qui a une incidence métabolisme des cellules normales ou malades.

Introduction

Les estrogènes sont des régulateurs importants de nombreux processus physiologiques chez les femmes et les hommes , y compris les tissus reproducteurs, les tissus métaboliques, le cerveau et les os ^1. En plus des effets bénéfiques dans ces tissus, les œstrogènes conduisent aussi des cancers qui découlent de mammaires et les tissus reproducteurs. Les estrogènes travaillent principalement par RÉ pour induire des effets spécifiques de type cellulaire. séquençage profond des transcrits régulés par ERa en utilisant l'ADN ERa analyse des sites de liaison ARN-Seq et l'ensemble du génome en utilisant ChIP-Seq avéré être utile de comprendre comment fonctionne ERa dans différents tissus et les cancers qui en découlent. Nous et d' autres ont publié des profils de gènes d'expression associés aux différents récepteurs (ERa vs ERß) ^2,3, différents ligands ^3-5 et différents corégulateurs ^2,4,6,7.

ARN-Seq est la principale méthode pour examiner le transcriptome, offrant une précision et une plus grande efficacité par rapport à ba microarraygène sed analyse de l' expression ^8. ARN obtenu à partir des lignées cellulaires ^2-4,7, des tissus ou des échantillons de tumeur sont séquences, mis en correspondance avec les ensembles génomiques disponibles et les gènes régulés de manière différentielle sont identifiés. Immunoprécipitation de chromatine (ChIP) est utilisé pour disséquer le facteur de transcription et de co-régulateur se liant à des sites de liaison connus de régulation de la chromatine. ChIP-Seq (ChIP suivi par séquençage à haut débit) fournit une détection impartiale des sites de liaison mondiaux. La métabolomique est une autre approche de la biologie des systèmes de plus en plus utilisé, ce qui quantitativement les mesures, la réponse multiparamétrique dynamique des systèmes vivants à divers stimuli, y compris les produits chimiques et les perturbations génétiques.

En effectuant le profilage métabolique global, une lecture fonctionnelle peut être obtenue à partir de cellules, les tissus et le sang. En outre, des informations à partir d'expériences de transcriptome ne reflètent pas toujours les changements réels dans le niveau des enzymes qui contribuent à des voies biochimiques. Combinéanalyse des données de transcriptome et métabolome nous permet d'identifier et de corréler les changements dans l'expression des gènes avec des changements de métabolites réels. Exploiter l'information de tous ces grands ensembles de données à grande échelle fournissent les détails mécanistiques pour comprendre le rôle des facteurs de transcription régulant les systèmes biologiques complexes, en particulier ceux qui ont trait au développement humain et des maladies comme le cancer et le diabète.

La nature complexe du génome de mammifère, il est difficile d'intégrer et pleinement interpréter les données obtenues à partir des expériences transcriptomiques, cistrome et métabolome. L'identification des événements de liaison fonctionnels qui conduisent à des changements dans l'expression des gènes cibles est important parce que les sites de liaison une fois fonctionnels sont identifiés; qui a suivi l'analyse, y compris la liaison transcription (TF) analyse de motif, pourrait être réalisée avec une plus grande précision. Cela conduit à l'identification des cascades et des mécanismes de TF biologiquement significatives. comparis Aussi directssur des expériences d'ARN-Seq et ChIP-Seq ne sont pas toujours possible, car les données de chaque expérience ont différentes échelles et des bruits et dans certains cas des signaux significatifs sont obscurcis par le bruit de la population. Nous ne sommes pas au courant d'aucune étude qui a intégré les informations de ces trois approches distinctes, mais pour comprendre la régulation métabolique directe par ERa dans le cancer du sein. Par conséquent, notre objectif global de cet article est de rapporter des événements de liaison productifs à l'expression des gènes et des changements de métabolites. Afin d'atteindre cet objectif, nous avons intégré des données à partir d'ARN-Seq, ChIP-Seq et métabolomique expériences et identifié les œstrogènes induite ERa événements qui conduirait à des changements d'expression des gènes dans les voies métaboliques de liaison. Pour la première fois, nous fournissons un ensemble complet de protocoles (figure 1) pour générer ChIP-Seq, ARN-Seq et métabolomique profilage et effectuer une analyse intégrative des données pour découvrir de nouveaux circuits de gènes régulant le métabolisme du cancer du seindes lignées cellulaires de cancer.

Protocole

1. Préparation des échantillons d'ARN-Seq

1. Culture cellulaire et traitement
   1. La culture des cellules MCF7 par une amélioration MEM (IMEM) plus le milieu de rouge de phénol avec 10% de FBS chaleur inactive, 1% de pénicilline / streptomycine à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de _CO2 à 5%.
      Remarque: lignée cellulaire même et l'état de culture cellulaire est utilisé tout au long de l'étude.
   2. Semences 100.000 cellules MCF7 par puits dans des plaques 6 puits. Avoir triplicats pour chaque traitement. Le jour 3, éliminer le milieu et ajouter 2 ml de milieu frais avec ou sans puits 10 ^-8 M E2 à chacun. Laisser incuber les plaques pendant 24 heures à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de _CO2 à 5%.
   3. Pour récolter les cellules, ajouter 1 ml de réactif d'isolement d'ARN (thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme acide) dans chaque puits et incuber pendant 5 minutes à la température ambiante (TA). Ramassez ensuite le réactif de lysat cellulaire par pipetage et le dépôt en tubes de 1,5 ml
2. Isolement de l'ARN
   1. Ajouter 200 pi chloroform 1 ml de réactif de lysat cellulaire (1.1.3) et vortexer pendant 10 secondes. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Centrifuger les échantillons à 16000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Après centrifugation, transférer la phase aqueuse (supérieure) dans un nouveau tube sans déranger les autres phases.
   2. Ajouter 500 ul de 100% d'isopropanol dans un nouveau tube à la phase aqueuse transférée, et mélanger par retournement. Incuber à -20 ° C pendant une nuit. Centrifuger les échantillons à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Observer un culot au fond du tube. Jeter le surnageant et laver le culot avec 750 ul de 70% d'éthanol sans RNase par une brève vortex.
   3. Centrifuger les échantillons à 6000 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et centrifuger l'échantillon à 16.000 xg pendant 1 min à 4 ° C pour recueillir tout l'éthanol restant. Retirer l'éthanol restant par pipetage avec une pointe de gel de chargement et de fixer les tubes à l'envers sécher à l'air pendant 10 minutes. Dissoudre le culot dans 20-50 DEPC eau traitée ul dépending de la taille des pellets.
3. Purifier l'ARN en utilisant l' ARN kit de nettoyage suivant le protocole ^4. Mesurer la concentration d'ARN en utilisant un kit de dosage par fluorimétrie à la base selon le protocole ^9.
   REMARQUE: DO à 260 nm est prélevé pour déterminer la concentration de l'ARN et le rapport de DO à 260 nm et 280 nm sont utilisés pour déterminer la pureté de l'échantillon. Il est recommandé de vérifier la qualité de l'ARN en utilisant un dosage Bio-analyseur.
4. Prenez environ 0,5 à 1 pg d'ARN purifié pour le séquençage.
   NOTE: Centre Biotech prépare les bibliothèques de séquençage et effectue apparié-end lire le séquençage en utilisant des méthodes décrites précédemment ^2.

2. Préparation de ChIP-Seq Sample

1. Culture cellulaire et traitement
   1. Seed 500.000 cellules MCF7 par 10 cm plaque dans un milieu de croissance.
      NOTE: Pour chaque pull down 16 plaques ont été utilisées. Le jour 3, éliminer le milieu et ajouter 5 ml de milieu frais avec ou sans 10 ^-8 M E2 à chaqueassiette. Traiter les cellules pendant 45 min (37 ° C humidifiée à 5% de CO ₂ atmosphère).
2. Crosslink et Cell récolte
   1. Ajouter 250 ul de formaldehyde à 37% dans 5 ml de milieu pour réticuler la chromatine, incuber à température ambiante pendant 15 min. Arrêtez de réticulation par lavage des cellules avec 5 ml de glace froide 1x MEM.
   2. Récolter les cellules dans 250 ul de tampon de lyse cellulaire (10 mM d'EDTA, 50 mM de Tri HCl, 1% de SDS, 0,5% de N, N-oxyde dimethyldodecan-1-amine) par plaque.
3. Fragmentation de chromatine
   1. Soniquer les cellules pendant 30 secondes x 8 à ampli de 30 à atteindre des tailles de chromatine nécessaires. Refroidir chaque échantillon sur la glace après une sonication de 30 sec.
   2. Centrifuger à 16 000 g pendant 10 min à 4 ° C et avec précaution, pipeter le surnageant sans perturber le culot au fond.
   3. Prenez une aliquote de 5 ul du surnageant, et vérifier la taille de l' ADN par électrophorèse sur gel d' agarose à 1,5% comme décrit précédemment ^10. La taille idéalede l'ADN doit être compris entre 200-500 pb.
4. Immunoprécipitation de la chromatine
   1. Économisez 25 pi de lysat cellulaire en entrée. Dans un tube de 50 ml, mélanger 4 ml de lysat cellulaire avec 20 ml de tampon IP (2 mM d'EDTA, 100 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl et 0,5% de Triton X), un anticorps ERa (500 ul F10 et 500 ul HC- 20), et 500 ul ProtA et protg protéine revêtement des billes magnétiques. Incuber le mélange par rotation à 4 ° C pendant une nuit pour permettre la formation d'un complexe anticorps chromatin-.
5. Washes et Inverse-réticulation
   1. Utilisez un support magnétique pour recueillir les billes magnétiques sur le côté aimanté pour enlever le tampon de lavage.
   2. Laver les billes magnétiques dans 25 ml de tampon de lavage I (EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X et NaCl 150 mM). Pour se laver soigneusement les billes magnétiques sans perturber complexes ADN-protéines, ajouter 25 ml de tampon de lavage lentement vers le tube le long du côté puis inverser les tubes jusqu'à ce que toutes les billes magnétiques sont bien mélangés with le tampon de lavage sans apparaître comme une pastille. Comme alternative, utiliser le rotateur pour inverser le tube. Ne pas vortexer les échantillons. Laver les billes magnétiques en utilisant le même procédé dans les étapes suivantes.
   3. Laver les billes magnétiques dans 25 ml de lavage de tampon II (EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X et NaCl 500 mM).
   4. Laver les billes magnétiques dans 25 ml de lavage-tampon III (mM EDTA 1,6, Tris HCl 10 mM, 1% de NP-40, 1% Dexycholate et 250 mM LiCl).
   5. Laver les billes magnétiques dans 25 ml de tampon 1 x TE (EDTA 1 mM, et Tris-HCl 10 mM) à deux reprises.
   6. Éluer l' ADN dans 500 ul de tampon d'élution (SDS à 1%, et 10 mM NaHCO ₃₎ puis répartir l'élution d'ADN à 500 ul dans 4 tubes. Pour l'ADN à partir des entrées, éluer l'ADN dans 125 ul de tampon d'élution.
   7. Incuber les tubes à 65 ° C pendant une nuit sur un bloc de chauffage. Couvrir les tubes sur le bloc de chauffage avec une feuille d'aluminium pour garder la chaleur même sur tous les tubes. Placer un poids sur les tubes pour les empêcher de l'ouverture.
6. Isolement de l'ADN
   1. Refroidir les tubes à température ambiante pendant 5 min. Isoler l'ADN à partir des échantillons déroulants en utilisant le kit d'isolement ChIP ADN. Suivez les instructions du fabricant.
      1. Réchauffer le tampon d'élution à 65 ° C. Ajouter 625 ul de tampon de liaison à chaque tube. Si le précipité se forme, ajouter un autre tampon de liaison 250 pi jusqu'à ce que la solution soit limpide.
      2. Charger l'échantillon sur la colonne et centrifuger à 16 000 g pendant 30 secondes. Laver l'échantillon avec 250 pi de tampon de lavage. Pensez à ajouter de l'éthanol dans le tampon de lavage lors de la première fois à l'utiliser. Répétez le lavage.
      3. Éluer l'ADN dans 15 ul de tampon d'élution. Combinez l'ADN de même tirer vers le bas à partir de 4 tubes pour atteindre environ 55 ul d'ADN.
   2. Isoler l'ADN d'entrée en utilisant un kit de purification d'ADN.
      1. Réchauffer le tampon d'élution à 65 ° C. Ajouter un tampon de liaison 625 pl dans chaque tube et on incube pendant 10 min. Chargez l'échantillon sur la colonne dans un 2 ml collectisur le tube.
      2. Laver l'échantillon avec 750 pi de tampon de lavage, centrifuger à 16 000 xg pendant 1 min. Répétez centrifuger pour éliminer tout tampon restant. Éluer l'ADN dans 30 ul d'EB.
   3. Mesurer la concentration d'ADN en utilisant un Commercial Fluor Assay avec Modification ^11.
      1. On dilue le tampon TE 20x dans 1 x TE comme le tampon d'essai pour la dilution des échantillons et des réactifs ADN. Prenez 5 ul d'ADN isolé et diluer dans 50 pi de TE 1x.
      2. De solution mère / ml d'ADN de 2 pg faire une norme d'ADN allant de blanc à 1, 10, 100, 1000 pg / ml. Dans une plaque de 96 puits, d'allouer 25 pi de chaque norme ainsi que l'ADN de dilution en double exemplaire. (Triplicate pour la norme est recommandée.)
      3. Préparer le réactif de travail en faisant une dilution de 200 fois de réactif dsDNA dans un tampon 1x TE dans un tube en plastique. Couvrir la solution de travail du réactif avec du papier d'aluminium pour éviter la lumière. Ajouter 200 pi de réactif de travail dans chaque échantillon. Danscubate à la température ambiante pendant 5 min. Couvrir la plaque avec une feuille d'aluminium pour éviter la lumière.
      4. Mesurer la fluorescence des échantillons en utilisant un lecteur de plaque de fluorescence (excitation à 480 nm, émission 520 nm). Générer la courbe standard ADN de florescence fonction de la concentration de l'ADN. Déterminer les concentrations des échantillons en fonction de la courbe étalon de l'ADN généré.
7. Vérification de ChIP Experiment Utilisation de qPCR
   1. Prendre 2 pl isolés ADN et dilués dans 20 ul dans l'eau. Mettre en place la réaction qPCR en triple en mélangeant 2,5 ul de dilution de l'ADN, 5 pi Green I PCR master mix, 1 ul d'amorce, et 1,5 eau exempte de nucléase ul.
   2. Exécutez le qPCR avec le système PCR en temps réel rapide en utilisant le programme suivant: Etape 1: 95 ° C pendant 60 secondes, Etape 2: 95 ° C pendant 10 secondes, 60 ° C pendant 60 secondes, répétez l'étape 2 39 fois.
8. Envoyer 10 ng échantillon d'ADN au centre Biotech pour le séquençage.
   NOTE: Le bioteccentre h prépare l'ADN ChIP dans les bibliothèques selon l'instruction, et effectue le séquençage simple lecture en utilisant des méthodes décrites précédemment ^2.

3. Metabolomics Assay Préparation d'échantillons

1. Culture cellulaire et traitement
   1. Seed 400.000 cellules MCF7 par 10 cm plaque dans un milieu de croissance. Pour chaque traitement préparer trois échantillons. Utilisez deux plaques dans chaque échantillon pour recevoir suffisamment de cellules pour la détection. Le jour 3, éliminer le milieu et ajouter 5 ml de milieu frais avec ou sans 10 ^-8 M E2 aux cellules. Traiter les cellules pendant 24 heures (37 ° C humidifiée à 5% de CO ₂ atmosphère).
2. Collecte d'échantillons
   1. Ajouter 5 ml glacé 1x PBS à la plaque, aspirez le PBS après basculement brièvement la plaque à plusieurs reprises. Répéter deux fois, et enlever le plus PBS que possible après le dernier lavage.
   2. Ajouter 750 ul d'acétone pré-froid à chaque plaque et gratter les cellules. Combiner les cellules dans de l'acétone à partir de deux plaques endans un tube de 2 ml sur de la glace.
   3. Nombre de cellules pour la normalisation
      1. Pour chaque traitement, en utilisant deux plaques supplémentaires pour la quantification des cellules. Pour dé-fixer les cellules de la plaque, ajouter 2 ml de HE tampon (1x HBSS, HEPES 10 mM, 0,075% NaHCO _3, et 1 mM EDTA) dans chaque plaque et incuber pendant 5 min.
      2. Recueillir et bien mélanger les cellules par pipetage des cellules dans le tampon HE. Utilisez total de 20 solution de cellules pi pour compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre.
3. Conserver les échantillons à -80 ° C avant de l'envoyer au centre métabolomique pour identifier et quantifier les métabolites par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse (GC-MS) analyse.

4. Analyse intégrative

1. ARN-Seq Analyse de données:
   1. Effectuer une vérification de la qualité des fichiers FASTQ utilisant FastQC: Lire QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Sélectionnez FastQC: Lire sous l'outil de NGS: QC et la manipulation. Téléchargez le fichier de données brutes du histor couranty.
         NOTE: Il est recommandé de donner un titre pour le fichier de sortie pour vous rappeler ce que le travail était pour car il pourrait y avoir plusieurs sorties.
   2. Exécuter et le fichier de sortie apparaîtra sous l'Histoire. Répétez la même procédure pour chaque fichier de séquence. adaptateurs compensateurs à l'aide de clip sous NGS: FASTX Toolkit.
   3. Aligner la lecture à l' aide de hg19 Tophat2 avec génome de référence RefSeq annotation ¹² (valeurs par défaut).
      1. Sélectionnez Tophat2 sous outil de NGS: analyse de l'ARN. Indiquez la bibliothèque de type jumelé (single-end vs apparié-end).
      2. Téléchargez le fichier d'entrée FASTQ de l'histoire actuelle. Sélectionnez le génome de référence. Choisissez paramètres par défaut. Ou utiliser la liste complète des paramètres à modifier.
      3. Exécuter et il produira deux fichiers de sortie: l'une est UCSC BED trace de jonctions; un autre est une liste des alignements de lecture au format BAM.
   4. Télécharger des fichiers BAM séquençage outil d'analyse de données. Calculer les valeurs d'expression en utilisant Quantification Tool.
   5. Identifier les gènes différentiellement régulés à la hausse en utilisant Expression Analysis Tool en utilisant les valeurs par défaut et plier le changement> 2 et p <0,05. De même, d'identifier les gènes différentiellement régulés à la baisse en utilisant Expression Analysis Tool en utilisant les valeurs par défaut et plier le changement <0,5 et p <0,05.
2. ChIP-Seq Analyse des données:
   1. Alignez FASTQ Lit à hg19 utilisant Bowtie2 ¹³ (valeurs par défaut) dans le Galaxy.
      1. Sélectionnez Bowtie2 sous l'outil de NSC: Mapping. Vérifiez si la bibliothèque est partenaire appariées (single-end vs apparié-end). Téléchargez le fichier FASTQ de l'histoire actuelle.
      2. Sélectionnez le génome de référence. Utilisez les paramètres par défaut. Exécuter et il va produire le fichier de sortie avec la séquence cartographiée lit comme fichier BAM. Répétez la procédure pour chaque fichier de séquence.
   2. Identifier les pics en utilisant MACS ¹⁴ Une coupure de 6.0E-7 p-valeur et de FDR de 0,01, comme décrit précédemment ^2.
3. Metabolomics Analyse des données:
   1. Convertir les noms chimiques des métabolites à KEGG_IDs.
   2. Identifier les métabolites différentiellement régulés en comparant les niveaux détectés dans le véhicule vs. E2 traités échantillons (2 fois coupure a été utilisé dans cette étude).
4. Analyse intégrative:
   1. Identifier les gènes qui ont des sites de liaison ERa en utilisant l'outil d'analyse de données de séquençage. Traduire les régions à la fonction des gènes en utilisant 20 kb que la distance de coupure.
   2. Identifier les gènes différentiellement haut et bas-régulé de l' analyse de données ARN-Seq utilisant un facteur de changement> 2 et plier le changement <0,5, respectivement avec la valeur de p <0,05 coupée. Comparer à la liste des sites de liaison contenant des gènes ERa utilisant la comparaison de diagramme de Venn.
   3. Utilisez cette liste pour identifier E2 voies métaboliques modulées utilisant Metscape ¹⁵ module Cytoscape.
      1. En sélectionnant le module Metscape à partir d'applications, choisissez Générer réseau et puis voie-basl'option ed.
      2. Sélectionnez le Organism (Human). Sélectionnez le fichier de données E2 liste composé non réglementée (KEGG ID) ainsi E2 régulée à la hausse la liste des gènes.
      3. Choisissez Composé -réaction -Enzyme-Gene comme type de réseau. Choisissez composés / gènes comme la requête.
      4. Construire réseau. Répéter en utilisant l'E2 régulé à la baisse composé et les gènes.

Résultats

transcriptomique
Pour analyser les gènes exprimés de manière différentielle par traitement E2, nous avons choisi de réaliser une expérience d'ARN-Seq. En plus de fournir des informations sur les niveaux d'ARNm, les données d'ARN-Seq peuvent également être utilisés pour suivre l'évolution de (longs ARN non codants, microARN) non codantes de l'ARN et des événements d'épissage alternatif. Nous ne fournissons des informations sur l'analyse des...

Discussion

Dans cet article, nous avons décrit la génération et l'analyse intégrative de l'ARN-Seq, ChIP-Seq et les données de métabolomique de cellules MCF-7 qui sont traités avec E2. Nous avons développé un ensemble de protocoles d'élaboration de stratégies à utiliser les méthodes les plus efficaces et les utilisateurs marchandises douce amicales qui produisent la découverte biologiquement pertinente. À notre connaissance, la nôtre est la première étude à intégrer -omique les données de trois dif...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triglyceride Mix	Sigma	17810-1AMP-S
Oleic acid	Sigma	O1257-10MG	Oleic Acid-Water Soluble powder
TRIzol Reagent	Life technologies	15596-026
Dynabeads Protein A	Life technologies	10006D
Dynabeads Protein G	Life technologies	10007D
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28106	DNA isolation of input sample
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit	Zymo Research	D5205	ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit	Invitrogen	P7589	DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set	QIAGEN	79254	RNA purification
DEPC Treated Water	LIFE TECH	462224	Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB120110	With 1/8 probe
Fisher Scientific Sound Enclosure	Fisher Scientific	FB-432-A	For sound reduction
Eppendorf Tubes 5.0 ml	Eppendorf	0030 119.401	200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix	NEB	S1330S
DNTP MIX	NEB	N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase	NEB	M0253S
FastStart SYBR Green Master	ROCHE	4673484001
Agarose	Fisher	BP160100	1.5% agarose gel
Qubit RNA HS Assay Kit	Life technologies	Q32852	RNA quantification (100 assays)
Formaldehyde	Sigma	F8775
Protease Inhibitor tablets	Roche	4693116001	Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	4906845001	Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits	Life technologies	Q32850	For 100 assays
Automated cell counter	ORFLO	MXZ000
tube Rotator	VWR	10136-084
Victor X5 Multilple plate reader	PerkinElmer	2030-0050
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807
Magnetic Stand	Diagenode	B04000001
Fast Real-time PCR system	Applied Science	4351405