解剖和三刺鳃骨架的平面安装

摘要

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

摘要

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species' diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

引言

多样性令人难以置信的大量存在于脊椎动物之间的头部骨骼，尤其是鱼类之一。在许多情况下，这有利于多样性不同喂养策略^{1 - 4，}并可能涉及到外部和内部颅面图案重大变化。鳃骨架是在鱼的喉部内部位于并包围大部分口腔的。鳃骨架是由连续5个同源片段，其中前四个支持鳃。这五个段一起充当鱼类和他们的食物⁵之间的接口。变异的性状，包括鳃耙，咽齿和鳃骨众多有助于有效觅食不同种类的食物。

刺鱼都发生在整个北半球殖民淡水湖泊和小溪洋祠堂后形成的适应辐射。饮食的转变从海洋到淡水更大的猎物小浮游动物造成了戏剧性的变化营养几个颅面特征^6。虽然许多研究都集中在刺鱼⁷外部颅面分歧^{- 13，}重要的颅面变化在内部鳃骨骼多次演变。以形态不同刺种群之间创建育杂种的能力提供了一个绝佳的机会来映射的发展变化对鳃骨架的遗传基础。

的生态意义的一个营养特点是鳃耙，定期皮肤骨骼该行的鳃骨的前部和后部的面孔和用于过滤猎物的图案。鱼类通常在小型猎物饲料往往有更长和更密集的间隔鳃耙鱼类相比上更大的猎物^14,15饲料。变异的鳃耙有报道包括了Within和物种之间^14-19和鳃耙图案化方面对营养壁龛和健身^16。几十年的研究已经广泛记载了threespine刺鱼¹⁷鳃耙数量和长度的变化^{- 21;}然而，这些研究通常集中鳃耙的第一行。最近的工作在整个鳃骨架^22,23和跨在鳃耙单行距²³和²⁴的长度突出学习以上排一个或一个单一的鳃耙理解的重要性，显示模块在鳃耙数的遗传控制鳃耙减少发育遗传基础。

的生态和生物医学意义第二种营养特点是咽齿的图案。在鱼类齿可位于两个所述口腔颚和在鳃骨架，被称为咽齿。口服齿主要用于对p雷伊捕捉而咽齿用于咀嚼和猎物操纵^{25 - 27。}这两套通过共享发展机制形成和发育有²⁸同源考虑。发生有趣的模块，因此一些品种，如斑马鱼，缺乏口腔背咽齿^29，而其他物种有多个齿ceratobranchials，pharyngobranchials，有时齿basihyal和hypobranchials ^30。在刺鱼，咽齿在第五ceratobranchial和背部的腹侧前发现后pharyngobranchials ^31。在刺喂养运动学表明口腔颚主要用于捕获猎物和促进抽吸喂养⁹离开咀嚼咽颚。在鲷，低级咽颌形态学变化很大^32,33并已被证明是自适应和营养生态位³⁴相关联。多PLE淡水棘鱼种群已发展腹侧咽齿号^23,35,36急剧增加。最近的工作已经证明，这个演变齿增益的发育遗传基础是在淡水刺鱼³⁶的两个独立的派生种群很大程度上是不同的。不同于哺乳动物的牙齿，鱼不断再生他们的牙齿在整个成年生活^37。这两个先前描述的高齿淡水种群的进化加速牙齿替代率，提供了难得的脊椎动物系统来研究再生³⁶的遗传基础。

已在淡水刺鱼反复演进的第三营养性状是较长epibranchial和ceratobranchial骨头，上部和下部卡爪的腮弓节段性同源物，分别为^38。长鳃骨赋予较大的口腔和可能是适应性允许更大的猎物为consumed。此外，在其他鱼类，骨头epibranchial是背咽齿板²⁵的抑郁症很重要的。像鳃耙和咽齿，鳃骨骼内部，因此，很难轻易可视化或量化。

这里我们提出了一个详细的协议剖析和平面安装鳃骨架，允许各种重要颅面性状容易的可视化和量化。虽然这个协议描述了一个刺清扫术，此方法同样适用于其他多种鱼类。

研究方案

所有的鱼的工作是经美国加州大学伯克利分校的机构动物护理和使用委员会（协议号为R330）。使用在0.025％三卡因-S浸渍用0.1％碳酸氢钠³⁹缓冲进行安乐死。所有步骤在室温下进行。

1.准备

注意:锥形管或闪烁瓶，可以封紧袋口和水平放置执行步骤1.1-1.5。鱼不需要不断摇动，而是尝试将溶液轻轻倒转或摇动管子或小瓶的齿条鱼的所有侧面暴露于染色液并允许染色均匀渗入组织尽可能经常混合。不要在一个平台摇床大批量的鱼，因为液体的重压将打破振动筛。

1. 固定存储在乙醇与10％的中性缓冲的福尔马林（NBF）中过夜或新鲜安乐死鱼或鱼。另外，使用4％多聚甲醛醛在1×PBS溶液，而不是10％NBF。
   注意:如果中提取DNA，夹之前在乙醇固定并存储尾或胸鳍的一小部分。
2. 在化学罩正确修复处理，用自来水代替（即约pH 7.0）处理2小时。避免使用去离子水，因为它常常可以是酸性的，并且可以脱钙骨。
3. 用0.008％茜素红S中的1％的KOH在水中24小时除去水和污点鱼。对于鱼小于20mm标准长度，用0.004％茜素红S.（请茜素红S的100倍（0.8％）原液，然后可以摊薄）。
4. 在自来水几个小时删除染色（投入适当的废物容器罩）和地方鱼。根据需要，直到水冲洗大多明显变化的水。
5. 除去水和地方鱼放入50％甘油，0.25％KOH轻度结算和随后的解剖。
   注意:此染色协议从先前描述的方法^40,41改性。

2。解剖

注:参见图1相关负责人骨骼形态的审查。

图1:棘鱼骨头部形态茜素红染色罗丹明B滤色器设置在荧光成像三刺头。有用的形态标记:OP =鳃盖，Subop = subopercle，BSR的鳃=射线，术前=前鳃，Infraorb 1-3 = 1-3眶下（也称为circumorbitals或suborbitals），登特=齿骨，PREMAX =颌骨，最大值=颌骨，纳斯=鼻，纬度。 ethm =横向筛窦，PSPH =副蝶骨，弗朗=额骨。对于刺头部骨骼的更详细说明，请参见安高^{（1974）31。} 请点击此处查看大图这个数字。

1. 铺设鱼平面（ 图2A），并在〜45°角插入尖锐＃5钟表镊子进入眼的侧刺穿覆盖在眼睛的膜。
2. 剥离膜从眼睛，类似于剥离酸奶盖（ 图2B）的距离。
3. 将眼睛后方开镊子，抢人眼球后面的视神经举行，并去除眼（ 图2C）。不要刺破眼球，因为它会泄漏黑色素。如果刺破，黑色素可以在后面的步骤中被冲走。
4. 重复的另一边。
5. 从后开始，将一个小解剖剪刀刀片的鳃盖瓣下，拖剪刀片背侧以上鳃盖，然后通过对眼窝（ 图2D）切割软组织。切背到鳃盖骨。
6. 切额骨（背侧眼窝）（ 图2E）。
7. 切周围T中的中线骨蝶骨他中心眼窝（ 图2F）的。
8. 重复鳃盖切在相对侧。
9. 将镊子鳃盖下，慢慢地剥离面远离身体，修剪任何软组织仍然附着（ 图2G - H）。注意不要破坏鳃耙的第一行。
   1. 用血管钳，分离从中线basihyal两侧ceratohyals而剥去和移除前颅面骨（整个下巴，包括齿骨，前颌骨和上颌骨;整个舌骨骨架包括外部皮肤鳃盖，前鳃，subopercle和鳃射线和底层背侧和腹侧软骨内的元素;并且所述颅骨的前部，包括经鼻，横向筛窦和眶下骨骼，参见图1和2I）。
   2. 骨盆棘可以从身体折叠出来，可以作为手柄，镊子抢举行of出现存在。刺锁定到位。要解锁，轻轻一拉用钳子从棘鱼体内直接走，然后轻轻弯曲向后压脊柱平贴鱼。
10. 插入钳闭后，腹为鳃骨架（略低于肠道管）并拖动向前镊子，戏弄除了剩余的肌肉和韧带附着于鳃骨架（ 图2J - K）。
11. 采用封闭钳提示，刮掉肌肉附着背鳃骨架腹侧脑壳在后到前的方向（ 图2L）。
12. 在相对侧重复2.9和2.10。
13. 把握肠道管的基极和拉向前以除去鳃骨架和肠管（图2M - N）。
14. 通过使垂直切割后至第五ceratobranchial的端部（ 图20中分离肠道管）。
15. 从在鳃骨架的背侧脑壳除去任何剩余的骨碎片后，插入剪刀到鳃篮，使双边套背侧齿板之间的背切（切断前至后）（ 图3A - D）。确保切割中心，以避免损坏背齿板。
16. 使橡胶肠腔在腮骨（肠管的前端）的后端两个浅横向切割，以协助打开鳃骨架（ 图3E）。
17. 放置鱼和所有组织片进入罐子和鳃骨架置于用50％甘油，0.25％的KOH微量离心管中，如果不要求进一步结算继续轻柔结算，或100％的甘油。标签罐和管与一个唯一的标识符，以便它们可以被追踪。结算所需的量在很大程度上是鱼，大成鱼的大小的函数（超过40米在标准长度米）通常需要额外的空地上。

图2:棘鱼鳃骨解剖茜素红染色的三刺鱼准备清扫。映入眼帘的是由粗放结算褪色。蓝色箭头指示运动方向。 （ 一 ）刺头侧面观，前是正确的。 （B）覆盖膜眼的去除。 （C）摘除眼球。 （ 四 ）背切鳃盖上面。 （E）额骨晋级。 （F）切蝶骨。 （G - I）的面部骨骼的去除。 （J）去除腹鳃骨骼软组织连接。 （K - L）背鳃骨架连接的去除。 （米- N）鳃骨架的去除。 （O）从鳃骨架分离肠道管。参见步骤2.1到2.16的更多细节。比例尺= 5毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

3.鳃骨架重新染色（如有必要）

1. 以染色鳃骨架较暗或清除组织以上，除去50％甘油，0.25％的KOH溶液中，用1％的KOH两次（一五分钟的洗涤，随后由第二24小时洗涤，同时在平台摇动器水平地摇动）洗涤。
2. 用0.008％茜素红S中的1％的KOH除去1％KOH和再染色24小时。
3. 去除污点和用1％的KOH代替24小时。
4. 除去的KOH溶液中，用50％甘油，0.25％的KOH代替。

4.安装鳃骨架

1. 删除鳃骨架从50％甘油，0.25％的KOH或100％的甘油和地点附近与背侧22毫米×60毫米的玻璃盖玻片的底朝上（ 图3F）。加上鳃骨架的前50％甘油，0.25％的KOH或100％的甘油几滴。如果从50％甘油，0.25％KOH中以100％的甘油，改变溶液转变在微量离心管和> 5分钟安装到平衡组织之前摇动。
2. 铺开模型粘土和地方的两个小球上的盖玻片的任一端充当隔离物。
3. 松散放置在有足够的压力趋于平缓前鳃骨架（ 图3G）上面的第二盖玻片。
4. 皮尔打开左侧背瓣背包括齿板，压平，和盖玻片（ 图3H）之间滑动。
5. 右背瓣重复技术和盖玻片（ 图3I）的边缘推动整个鳃骨架了。
   1. 改变本身，同时按住背部皮瓣钳开并小心地将盖玻片上，压扁在一个平滑的运动鳃骨架。
   2. 另外，安装鳃骨架上的一个盖玻片颠倒，张开每个背侧出横向重力所以不允许鳃骨架收备份。然后用第二区22毫米×60毫米的玻璃盖玻片覆盖并反转准备。
      注:不同的安装技术往往工作的每一个人更好或更坏。每次尝试，看看有什么感觉最舒服的。
6. 轻按顶部盖玻片压平足以让腮骨泥球装持平，但要注意不要挤压标本。
   1. 在安装过程中，ceratobranchials可以旋转和掩盖耙一排。通过滑动盖玻片并重新定向ceratobranchials或整个鳃骨架之间镊子解决这个问题。
7. 储存在滑托盘PREPS持平于ROOM温度。安装在100％的甘油，用制剂可以存储桥接盖玻片之间，用于至少十年。清洁钳和异丙醇或乙醇和求职技巧剪刀。

图3:平板安装腮骨操作和鳃骨架安装所示。蓝色箭头指示运动方向。 （A）鳃骨背侧。 （B - D）旋转和切口背齿板之间。在软组织（E）横向切割，以进一步打开肠道管的基地。 （F）鳃骨架放置在盖玻片准备安装底部。 （G）第二盖玻片放置在鳃骨架的前半部分（上述背侧齿片）。 （H - I）打开背齿板襟翼和两个盖玻片之间的滑动鳃骨架的平坦安装。参见步骤4.1至4.6的更多细节。比例尺= 5毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

该协议导致了解剖和平板安装鳃骨架（ 图4），其中的各种重要营养特质是可以量化的。从背视图，鳃耙，所有咽齿板，几乎所有的鳃骨中的所有行可以很容易地可视化和量化^{22 - 24,35,36,38,42。}茜素红S也发出荧光的若丹明或类似红色滤波器允许与其他标记物（ 例如 ，转基因GFP的^42）和可视化的另一种方法双标记。荧?...

讨论

The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Hydroxide (KOH)	EMD	PX1480-1
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893-4L
10% Neutral Buffered Formalin (NBF)	Azer Scientific	NBF-4-G
Alizarin Red S	EMD	AX0485-3
Microscope Cover Glasses 22 mm x 60 mm	VWR	16004-350
100 mm x 10 mm Glass Petri Dish	Kimble Chase	23064-10010	To dissect samples on
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Can be poured into glass or plastic Petri dishes to make dissecting plates
Modeling Clay	Sargent Art	22-4000	1 lb cream
Scintillation Vials (case of 500)	Wheaton	986586	Borosilicate Glass with Screw Cap
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)	FST	11252-20	Dumostars are an alternative
Dissecting Scissors	FST	15003-08	Alternate sizes are available depending on size of sample
Dissecting Microscope	Leica	S6E with KL300 LED	Many other models work nicely, having a flat base helps
Microcentrifuge Tubes 1.7 ml	Denville	C2170
Cardboard slide tray	Fisher	12-587-10