经过一蛋白饱和诱变图书馆的功能评价规范利用高通量测序

摘要

我们提出了一个协议为利用高通量测序蛋白的综合单站点饱和突变库功能评估。重要的是，这种方法采用正交引物对复图书馆建设和测序。提供了使用在氨苄青霉素的临床相关剂量选择的TE​​M-1β内酰胺酶代表性结果。

摘要

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 β-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to β-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

引言

诱变早已在实验室用于研究生物系统及其演进的属性，并产生突变蛋白质或微生物与增强的或新的功能。虽然早期的方法在其上产生生物随机突变的方法依赖，重组DNA技术的出现使研究人员能够引入位点特异性方式与DNA选择的变化， 即 ，位点定向诱变^1,2。与目前的技 ​​术，一般是在聚合酶链反应（PCR），使用诱变寡核苷酸，它是相对容易的在给定基因^3,4-创建并评估突变的小的数字（ 例如 ，点突变）。这是更为困难然而，当目标的办法，例如，所有可能的单站点的创建和评估（或更高阶）的突变。

虽然很多已经从早期的研究试图评估大量m的教训在基因utations，所采用的技术往往是费力的，例如要求每个突变评估独立使用的废话抑制^5-7株，或在自己的能力量化，由于Sanger测序⁸的低测序深度有限。在这些研究中所使用的技术已在很大程度上被利用高通量测序技术方法^9-12取代。这些概念简单的方法意味着创建包括了大量的突变库，库中经受了功能的屏幕或选择，然后深测序（ 即 ，> 10 ⁶排序的顺序读取时）之前获得图书馆，选择后。以这种方式，大量的突变的表型或健身效果，表示为在每个突变体的群体频率的变化，可以同时和更定量评估。

我们之前推出了SIMP（ 即 ，全蛋白饱和诱变文库）用于评估蛋白质的所有可能的单氨基酸突变的文库，适用于基因的一个长度比测序长文件的方法读取长度^11,13:首先，每个氨基酸位置是随机通过位点定向诱变的PCR。在此过程中，该基因被分成与由测序平台收纳总长度连续位置组成的组。诱变的PCR产物为每个组，然后组合，并且每个基团独立地进行选择和高通量测序。通过保持序列和测序读长在基因突变的位置之间的对应关系，这种方法也有最大化的测序深度的优点:当一个可以简单地序列中短窗这样的库，不要拆开成团（ 例如 ，通过一个标准的猎枪。测序方法），最读取得到的将是野生型和由此m个浪费测序吞吐量ajority（ 例如，在100个氨基酸（300 bp）的窗户测序一个500个氨基酸的蛋白的一个全蛋白饱和诱变文库，以最低80％的读出将是野生型序列）。

这里，提出了一种协议，它利用高通量测序为全蛋白饱和诱变文库的功能评估，使用上述方法（ 图1中所述）。重要的是，我们引入的正交的引物的使用量在库中克隆过程条形码每个序列组，这允许它们被复用到一个库，同时进行筛选或选择，然后解复用为深度测序。由于序列组不进行选择独立，这减少了工作量，并确保各突变经历选择的相同水平。 TEM-1β内酰胺酶，其赋予对高层次性的酶β内酰胺类抗生素（ 如氨苄青霉素）的细菌被用作模型系统^14-16。的协议是用于TEM-1在大肠杆菌中一个全蛋白饱和诱变文库的评估中描述大肠杆菌下，在对一个临床剂量氨苄青霉素（50微克/毫升^）17,18的近似的血清水平的选择。

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研究方案

注:参见图1的协议纲要。在协议中几个步骤和试剂需要安全措施（与"注意"表示）。用本品前请咨询材料安全数据表。所有的协议步骤都在室温，除非其他指示进行。

1.准备文化传媒和板

1. 准备并通过高压灭菌1升纯化水100毫升超级最优肉汤（SOB; 表1）灭菌，1升的Luria-BERTANI肉汤（LB; 表2）和1升的LB琼脂（ 表3）。另外准备和消毒三种培养瓶中各含1升LB。
   注意:在整个协议"水"是指高压釜灭菌的净化水; SOB，LB和LB琼脂指高压釜灭菌的解决方案。
2. 通过在10毫升70％乙醇中溶解0.12克盐酸四环素制备四环素的12毫克/毫升的库存。消毒使用0.2微米的过滤器和存储在4℃下避光保存。
3. 凉爽LB-琼脂至50℃，再加入1毫升四环素的库存（12微克/毫升四环素的终浓度）。倒入避光培养皿和凉爽的室温。保存在4℃下避光保存。

2.全基因饱和突变库的构建

注:引物;填妥的项目完成报告，限制性消化和结扎;与纯化的DNA样品可以贮存于-20℃。

1. 设计诱变引
   1. 诱变每个氨基酸位置的所有可能的氨基酸，设计出一对互补的诱变引物（有义/正向和反义/反），用于与以下准则的每个氨基酸位置:
      1. 替换对应于所述氨基酸的密码子由NNS（其中N是所有四个核苷酸碱基的混合物和S是胞嘧啶（C）的混合物和鸟嘌呤（G））中的整洁和中心待诱变呃由每侧大约15个核苷酸侧翼。
      2. 确保了5'和3'端终止于C或G和熔融温度（T _m）为约^70℃3。使用计算脚本NNS_PrimerDesign.m（见补充代码文件），根据这些原则来设计NNS诱变引。
   2. 从商业来源订购引物。为方便使用，让他们在96孔板格式合成和预先在水中稀释至50微米，具有一组包含有义诱变引物和另一个反义引物的板。
   3. 装满水吸管盆，并使用多通道移液管在三个96孔平板95微升转移到263孔中。通过使用多通道移液器从含有有义诱变引物，以含有水板的同源井96孔板转移5微升稀释的引物20倍至2.5微米。
   4. 重复协议的步骤2.1.3稀释反义诱变引。
2. 通过两步PCR的定点诱变NNS分库的每个氨基酸位置的合成
   1. 执行第一轮诱变的PCR。对于每一个诱变引用pBR322_AvrII质粒为模板和引物AatII_F或AvrII_R准备25微升PCR反应（与底漆AvrII_R配对感诱变引，并用引物AatII_F配对反义诱变引;共526 PCR的）。见材料表 AatII_F和AvrII_R序列。
      1. 通过加入从表4中的试剂到15毫升锥形管制备的PCR"主混合物"。转移到吸管盆。使用多道移液器以在三个96孔PCR板15微升转移到263孔中。使用多道移液器从包含经稀释的感诱变引物同源井96孔板转移10微升我n中的PCR板。
      2. 覆盖一个96孔板密封每个PCR板。离心在200 xg离心2分钟。
      3. 转移PCR板，以热循环，并运行下面的程序:98℃30秒; 20个循环:98℃10秒，55℃20秒，72℃1分钟; 72℃，2分钟;保持在4℃。
      4. 重复协议步骤2.2.1.1 - 2.2.1.3对包含经稀释的反义诱变引物的96孔板中。
   2. 执行第二轮诱变的PCR。对于每个氨基酸位置，制备25μl的PCR，使用反应的引物AatII_F和AvrII_R，混合和稀释的第一轮诱变的PCR产物作为模板（总共263 PCR的）。
      1. 装满水吸管盆，并使用多通道移液管在三个96孔平板198微升转移到263孔中。
      2. 通过使用多通道移液器以结合并稀释100倍的每个氨基酸位置上的突变PCR产物第一传输从含有从感测的诱变引物，以含有水板的同源孔所得的PCR产物的96孔PCR板1微升。然后重复用于从反义诱变的引物所得的PCR产物转移。
      3. 通过添加从表5试剂到15毫升锥形管制备的PCR"主混合物"。转移到吸管盆。使用多道移液器以在三个96孔PCR板24微升转移到263孔中。使用多道移液器从含有该混合的96孔板转移1μl的稀释的第一轮诱变的PCR产物在PCR板的同源孔中。
      4. 覆盖一个96孔板密封每个PCR板。离心机以大约200×g离心2分钟。转板，以热循环和运行同一程序作为协议的步骤2.2.1.3。
   3. 分析用凝胶电泳第二轮诱变PCR的结果。确保所有的产品都是正确的尺寸，并没有污染的产品。
      1. 加2ml 2X凝胶上样染料于一个吸管盆，然后使用多道移液器以在三个96孔平板6微升转移到263孔中。使用多道移液器从含有第二轮诱变的PCR产物，以含染料的96-孔板的同源孔96孔PCR板转移6微升。
      2. 制备1.5％琼脂糖凝胶用0.2微克/毫升溴化乙啶（小心）。
      3. 负载的DNA梯中的每一行的第一个和最后一个车道。然后用多道移液器从协议的步骤2.2.3.1装入10微升的样品。
      4. 在100V用于在紫外透射40分钟和图像运行​​凝胶。
      5. 重复步骤协议2.2.3.2 - 2.2.3.4，直到所有样本进行了分析。
   4. 精确测量使用dsDNA定量试剂NNS各分库PCR产物的浓度。
      1. 转让大约15毫升EB缓冲液以移液管盆。使用多道移液器以在三个96孔黑色壁，透明底的测定板49微升转移到263孔中。
      2. 使用多道移液器向1μl的每个第二步骤PCR产物（协议步骤2.2.2）的转移到96孔测定板的同源孔中。
      3. 通过在300微升EB缓冲液稀释的λ噬菌体DNA为2毫微克/微升制备DNA浓度标准曲线，然后造成十个两倍稀释（总11浓度）。转移50微升至从含有无试样的前一步骤的96孔测定板中的一个的行的第一11列;第十二列添加EB缓冲液50微升（试剂空白）。
      4. 通过加入75微升的试剂的制备dsDNA定量试剂（参见材料的表 ），以15毫升锥形管，然后加入15mL的EB缓冲液中。通过颠倒混合管，然后转移到吸管盆地。避光剂。
      5. 使用多道移液器至50μl制备的双链DNA定量试剂转移到测定板的各孔中。移液器向上和向下混合。在RT孵育板5分钟避光。
      6. 测量用酶标仪和标准荧光波长（激发485纳米，发射520纳米; 0.1秒）各样品的荧光。
      7. 从所有样品减去试剂空白的荧光值。产生从λ噬菌体样品的荧光测量值的标准曲线。计算使用他们各自的荧光测量和标准曲线各样品的浓度。
3. NNS分库的克隆到载体的选择
   1. 混合100纳克NNS分库PCR产物的成五个NNS亚库组。按照厂家的说明书，清理使用DNA纯化试剂盒的样品，然后用DS浓度测量DNA定量试剂。
      注意:每个组由沿TEM-1序列隔开大约53个连续的氨基酸的位置（NNS子库组1 - 5是由位置26 - 78 79 - 132 133 - 183 184 - 236，和237 - 290，分别;编号根据安布勒等^[19]）。
   2. 创建克隆载体每个NNS子库组。
      1. 根据表6制备个100微升的PCR，使用引物AvrII_F和AatII_OP1_R - AatII_OP5_R，和质粒pBR322_OP1-5作为模板（AatII_OP1_R与pBR322_OP1配对等）。
      2. 转移到热循环，并运行下面的程序:98℃30秒; 25个循环:98℃10秒，55℃20秒，72℃1.5分钟; 72℃，2分钟;保持在4℃。见T 能材料的AatII_R和AvrII_F序列。
      3. 制备的1％琼脂糖凝胶用0.2微克/毫升溴化乙啶（小心）。
      4. 加入20μl6X凝胶样染料到每个PCR样品。负载DNA梯度凝胶的第一线;加载每个样品的总体积，跳过至少一个阱样本之间。
      5. 50分钟运行在100伏的凝胶。
      6. 使用长波长紫外照明（警告）可视化凝胶。含PCR产物在约3500 bp的消费切片;转移到离心管分开。凝胶切片可以储存在-20℃。
      7. 按照厂家的说明书，净化使用凝胶提取试剂盒和使用dsDNA定量试剂测量浓度的样品。
   3. 对于这两种NNS分库群（协议步2.3.1）和克隆载体（协议步2.3.2），设置限制按照T 能7用AatII和AvrⅡ消化酶消化。在37℃孵育1小时。按照厂家的说明书，清理使用DNA纯化试剂盒的样品，然后用双链DNA quantita浓度测量化试剂。
   4. 下面的表8与关联限制性消化克隆载体（NNS分库组1 pBR322_OP1等），每个限制性消化NNS亚库组设置连接反应。孵育在RT 1小时。清理使用根据制造商的说明的DNA纯化试剂盒反应;洗脱的DNA与20微升的水。
   5. 变换纯化连接反应的整体成库效率E.大肠杆菌细胞通过电。
      1. 解冻E.电感受大肠杆菌细胞，然后位置细胞，并在冰上纯化连接反应。
      2. 将10微升解冻细胞纯化各连接反应，然后转移至电穿孔。电穿孔在1.8千伏。
      3. 通过在1ml的SOB重悬回收细胞。在37℃下孵育1小时。
      4. 重悬10μl，以990微升LB每个回收文化;散布在LB琼脂平板C 100微升ontaining 12微克/毫升四环素。孵育板O / N（〜16小时），在37℃。
      5. 对于每一个恢复文化，准备用50毫升LB和50微升春节股票250毫升培养瓶中。转移到烧瓶剩下的约1毫升回收文化。在37℃下剧烈振荡（〜200rpm）下孵育O / N（〜16小时）。
   6. 计数每个平板上的菌落数。计算成功的转化作为数 ，其中是菌落数， 是回收培养物体积（1,000微升）和是恢复文化的镀量（1微升）。
      注:要确保所有突变的完全覆盖，作为一个经验法则成功的转化的数量应该是≥1过00倍的预期的突变的数量。每个NNS分库有53〜职位，所以突变的预期数量为53的位置×32个密码子/位置≈1.7×10 ^3;给库大小≥100倍（≥1.7×10 ^5）应在每盘≥170菌落。
   7. 根据制造商的说明，从使用质粒纯化试剂盒培养分离质粒DNA，然后使用dsDNA定量试剂测量的浓度。混合在一起100纳克质粒。这就造成最终的全蛋白饱和突变库。

3. TEM-1全蛋白饱和突变库抗生素抗性的选择

1. 选择预培养制备。
   1. 从稀释步协议2.3.7质粒为0.5纳克/微升水和转移20微升至离心管。执行改造，重新covery，电镀，作为协议的步骤2.3.5 1微升的SOB恢复文化如前所述，除了转移到999微升LB中O / N增长
   2. 计数菌落数。为了确保所有的突变完全覆盖应该有≥100菌落，表明^6≥10成功的转化（100×263×位置的密码子32 /位置≈10 ^6）。
   3. 测量50ml的O / N培养的浓度。
      1. 加入1 ml LB到分光光度计小杯中准备的LB空白。测量分光光度计OD600。
      2. 由900微升LB中重悬100微升稀释O / N培养10倍测量OD600。减去空白的OD600读数乘以10给O / N培养的OD600。
   4. 在37℃下预温从协议步骤1.1三种培养瓶中〜30分钟。稀释O / N文化OD600 = 0.1和1ml添加​​到一个烧瓶（最终OD600 = 0.001）。 ŧ他是"预选文化"。
   5. 孵育"预选文化"，在37℃下剧烈振荡（200rpm）下。通过测量OD 600作为协议步骤3.1.3定期监测生长（这是没有必要稀释培养10倍），直到OD 600 = 0.1（〜2.5小时）。
   6. 传送将100ml选择预培养到两个50毫升锥形管中。离心机在4000×g离心在4℃下6分钟。除去大部分上清液，并结合成一个单一的15锥形管中。重复离心并删除所有上清。储存于-20℃。
2. 选择氨苄青霉素抗性。
   1. 而选择预培养是培养，通过在10ml水中溶解0.5克钠氨苄青霉素制备安培的50毫克/毫升的库存在水中。消毒使用0.2微米的过滤器和储存在4℃。
   2. 其它两个瓶，添加四环素至12微克/毫升的最终浓度和选择预培养这种塔的体积 t是最终OD600 = 0.001。一个瓶中，加入1毫升安培，为50微克/毫升的终浓度 - 这就是"选择文化"。
   3. 孵育培养物在37℃下剧烈振荡（200rpm）下。监视这在之前步骤中加入无氨苄青霉素的培养物的生长，直至OD 600 = 0.1（〜2.5小时）。此时，也测量选择培养的OD 600。
   4. 除以选择培养的OD600为0.1，并加入100ml繁殖。在4℃转移此体积（〜400毫升）至50ml锥形管中并离心以4,000 xg离心6分钟。除去大部分上清液，并结合成一个单一的15锥形管中。重复离心并删除所有上清。
   5. 根据制造商的说明，从预先选择（协议步骤3.1.6）和选择（协议步骤3.2.4）培养细胞沉淀分离质粒DNA，然后使用dsDNA定量试剂测量的浓度。

TLE"> 4。高通量测序确定突变的健身效果

1. 用于高通量测序样品的制备
   1. 准备25微升的PCR，以解复用正交引物NNS亚库组
      1. 根据表9准备PCR主混合物;转移23微升到十PCR管。
      2. 加入1微升0.5毫微克/微升纯化的质粒DNA从选择预培养到PCR管1 - 5和从选择培养至铝管6 - 10。
      3. 混合在一起为50微米向正交引OP1_F 50微升 - OP5_F与各自的反向正交引OP1_R - OP5_R。以相同的顺序，传送1微升到PCR管1 - 5和6 - OP5_F OP1_R和- - OP5_R 材料为OP1_F序列10. 见表 。
      4. 转移PCR管到热循环。运行下面的程序:98℃30秒; 20个循环:98℃10秒，55℃;℃20秒，72℃1.5分钟; 72℃，2分钟;保持在4℃。
   2. 准备25微升的PCR来隔离每个NNS子库组
      1. 稀释100倍转增1微升每个分离PCR管中，加入99微升水从协议的步骤4.1.1.4十个项目完成报告。混合，然后吸取了99微升并丢弃。
      2. 混合在一起的50μM正向引Group1_F 50微升 - Group5_F与相应的反向引Group1_R - Group5_R。以相同的顺序，换乘1微升至PCR管1 - 5,6 - Group5_F和Group1_R - - Group5_R 材料为Group1_F序列10.请见下表 。
      3. 根据表9准备PCR预混液，23微升转移到各个PCR管。转移PCR管以热循环;运行同一程序作为协议的步骤2.2.1.3。
   3. 进行最后的25微升的PCR添加索引序列
      1. 迪转增1微升每个分离PCR管中，加入99微升的水琵琶100倍，从协议的步骤4.1.2.3十个项目完成报告。混合，然后吸取了99微升并丢弃。
      2. 根据表9准备PCR预混液，23微升转移到各个PCR管。
      3. 分别505_F - 对于管与模板从NNS分库第1-5组，始发501_F转每管正向引物0.5微升。为与来自预选和选择培养得到的模板管，传送每管0.5微升分别反向引701_R和702_R。对于501_F序列见材料表 - 505_F和701_R和702_R。
      4. 转移PCR管的热循环，并从步骤2.2.1.3运行程序。
   4. 混合和样品净化
      1. 使用根据制造商的说明一dsDNA定量试剂测量的浓度。混合100纳克每PCR产物的intOA单离心管中。
      2. 制备2％的琼脂糖凝胶，0.2微克/毫升溴化乙啶（小心）。
      3. 6×凝胶上样染料加入到该混合的PCR产物的样品。负载DNA梯度凝胶的第一线;装载样品的整个体积。
      4. 50分钟运行在100伏的凝胶。使用长波长紫外照明（警告）可视化凝胶。包含〜360 bp的PCR产物消费税切片;转移到离心管。凝胶切片可以储存在-20℃。
      5. 按照厂家的说明书，使用凝胶提取试剂盒纯化样品和使用dsDNA定量试剂测量浓度。这是用于高通量测序的最终样品。
   5. 在高通量测序平台的序列（见本协议用 ​​于平台的材料表 ）。
      1. 计算样品浓度纳米， ，其中是在毫微克/微升样品的浓度和是样品的DNA（〜360 bp）的序列长度。稀释样品的EB缓冲液4纳米。
      2. 按照制造商的说明变性样品稀释至晚上9时在杂交缓冲。
      3. 负载600微升样品放入试剂盒。以下顺序制造商的说明和屏幕上的提示进行操作。
2. 测序数据的分析
   1. 下载Flash（短的快速长度调整读取^）20，放入文件夹与测序，获得fastq.gz文件一起。
   2. 使用Flash加入对应的配对末端的fastq.gz文件中读取每对指数（正向和反向读取的预选和选择的文化NNS各分库组）。
   3. 打开命令提示符，将目录更改为在协议步4.2.1文件夹中。使用命令读取加入每对:闪 ，其中mates1.fastq.gz和mates2.fastq.gz是包含着文件和反转分别读取。
3. 加入每对读取后，将out.extendedFrags.fastq输出文件到不同的文件夹从预选或选择文化的结果。根据NNS亚库组其所对应（ 即 ，1.fastq，2.fastq等）重命名out.extendedFrags.fastq输出文件。
4. 运行计算脚本NNS_DataAnalyzer.m从每个文件夹（见补充代码文件），以计算每个单氨基酸突变的计数和计数为野生型，对于每个NNS子文库基。
5. 计算的健身效果每个突变在每个位置作为碱10对数的选择获得的计数的比值（ ）与预先选择（ ）条件下，相对于野生型:
   。

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结果

对于含有正交引发位点的五个修饰的pBR322质粒的质粒图谱（pBR322_OP1 - pBR322_OP5）示于图2A。为了测试正交的引物是否是特定使用每对正交引物单独进行的PCR，与所有五个pBR322_OP1-5质粒一起，或与所有质粒减去匹配正交引物对中的质粒。当被包括在匹配的质粒仅获得正确的产物，并在它的缺失（ 图2B），没有得到任何大小的产物。

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讨论

这里一个协议被用于进行全蛋白饱和诱变文库的功能评估，使用高通量测序技术说明。该方法的一个重要方面是在克隆过程中使用的正交引物。简单地说，每个氨基酸位置由诱变PCR随机，并混合在一起成为其组合序列长度由高通量测序收容位置的基团。这些基团被克隆入含有成对正交引发位点，混合在一起，并进行选择的质粒载体，然后使用正交引物解复用，并随后深测序。由于突变测序中阅读?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Typtone	Research Products Intl. Corp.	T60060-1000.0
Yeast extract	Research Products Intl. Corp.	Y20020-500.0
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506-500G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660-5G
Petri plates	Corning	351029
MATLAB	Mathworks	http://www.mathworks.com/products/matlab/
Oligonucleotide primers	Integrated DNA Technologies	https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos	25 nmol scale, standard desalting
pBR322_AvrII	available upon request		pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene
pBR322_OP1 – pBR322_OP5	available upon request		five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites
Q5 high-fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491L	includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer)
15 ml conical tube	Corning	430025
Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus)	Eppendorf
PCR plate, 96 well	Fisher Scientific	14230232
96 well plate seal	Excel Scientific	F-96-100
Veriti 96-well thermal cycler	Applied Biosystems	4375786
6x gel loading dye	New England Biolabs	B7024S
Agarose	Research Products Intl. Corp.	20090-500.0
Ethidium bromide	Bio-Rad	161-0433
UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech)	Fotodyne Inc.	http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB buffer	Qiagen	19086
96-well black-walled, clear bottom assay plates	Corning	3651
Lambda phage DNA	New England Biolabs	N3011S
PicoGreen dsDNA reagent	Invitrogen	P7581	dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4
Victor 3 V microplate reader	PerkinElmer
DNA purification kit	Zymo Research	D4003
Microcentrifuge tubes	Corning	3621
Long-wavelength UV illuminator	Fisher Scientific	FBUVLS-80
Agarose gel DNA extraction buffer	Zymo Research	D4001-1-100
AatII	New England Biolabs	R0117S
AvrII	New England Biolabs	R0174L
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S
EVB100 electrocompetent E. coli	Avidity	EVB100
Electroporator (E. coli Pulser)	Bio-Rad	1652102
Electroporation cuvettes	Bio-Rad	165-2089
Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro)	Amersham Biosciences	80211237
50 ml conical tubes	Corning	430828
Plasmid purification kit	Macherey-Nagel	740588.25
8 well PCR strip tubes	Axygen	321-10-551
Qubit dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q32854	dsDNA quantitation reagent
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q32866
Ampicillin sodium salt	Akron Biotechnology	50824296
MiSeq reagent kit v2 (500 cycles)	Illumina	MS-102-2003
MiSeq desktop sequencer	Illumina	http://www.illumina.com/systems/miseq.html	alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform
FLASh software	John Hopkins University - open source	http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/	software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data
AatII_F			GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC
AvrII_R			CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG
AvrII_F			CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_R			ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_R			ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_R			ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_R			ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_R			ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC
OP1_F			GACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_R			CGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_F			ATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_R			AGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_F			AGTCCCAAGTTCAGACGTAC
OP3_R			GAAAAGTCCCAATGAGTGCC
OP4_F			TCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_R			TATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_F			AGATTGTTACTCCGACGGAC
OP5_R			TATAACAGGCTGCTGAGACC
Group1_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC
Group2_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC
Group3_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC
Group5_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC
502_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC
503_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC
504_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC
505_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC
701_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG
702_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG