JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים פרוטוקול עבור ההערכה התפקודית של ספריות mutagenesis רווי אתר יחיד המקיפות של חלבוני ניצול רצף תפוקה גבוהה. חשוב לציין, גישה זו משתמשת זוגות פריימר מאונכים לבצע ריבוב בניית רצף ספרייה. תוצאות נציג באמצעות TEM-1 β-lactamase שנבחר במינון רלוונטי קליני של אמפיצילין מסופקות.

Abstract

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 β-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to β-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

Introduction

Mutagenesis הועסק ארוך במעבדה כדי ללמוד את המאפיינים של מערכות ביולוגיות האבולוציה שלהם, ועל מנת לייצר חלבונים או אורגניזמים מוטנטים עם פונקציות משופרות או רומן. בעוד גישות מוקדם הסתמכו על שיטות אשר מייצרים מוטציות אקראיות באורגניזמים, הופעתו של טכנולוגיית ה- DNA רקומביננטי אפשרה לחוקרים להציג שינויים בחר DNA באופן אתר ספציפי, כלומר., 1,2 mutagenesis באתר ביים. בעזרת טכניקות נוכחיות, בדרך כלל באמצעות oligonucleotides מוטגנים ב תגובת שרשרת פולימראז (PCR), הוא יחסית קליל ליצור ולהעריך מספר קטן של מוטציות (למשל., מוטציות נקודתיות) בגן מסוים 3,4. זה הרבה יותר קשה אולם כאשר גישות המטרה, למשל, יצירה וההערכה של כל האתר היחיד האפשרי (או מסדר גבוה) מוטציות.

בעוד הרבה כבר למדו מן המחקרים המוקדמים מנסה להעריך במספרים גדולים של מ 'utations בגנים, הטכניקות המשמשות היו לעתים קרובות מייגעות, למשל המחייב את הערכה של כל מוטציה באמצעות מדכא שטויות עצמאי זני 5-7, או היו מוגבלים ביכולת הכמותית שלהם בשל עומק הרצף הנמוך של סנגר רצף 8. הטכניקות בשימוש במחקרים אלה כבר החליפו במידה רבה על ידי שיטות ניצול טכנולוגית רצף תפוקה גבוהה 9-12. גישות פשוטות מושגית אלה כרוכים יצירת ספרייה הכוללת מספר רב של מוטציות, משעבדת את הספרייה למסך או מבחר לתפקוד, ולאחר מכן-רצף עמוק (כלומר., בסדר גודל של> 10 6 רצף כניסות) הספרייה שהושגה לפני לאחר הבחירה. בדרך זו, את ההשפעות פנוטיפי או התאמה של מספר רב של מוטציות, ייצגו כשינוי בתדירות אוכלוסייה של כל מוטציה, ניתן להעריך בו זמנית ועוד כמותית.

בעבר הצגנו פתי(. כלומר, ספריות mutagenesis הרוויה כולה חלבון) הגישה le להערכת ספריות של כל המוטציות חומצה אמינית אחת אפשרית חלבונים, החלים על גנים עם אורך זמן רב יותר מאשר רצף לקרוא אורך 11,13: ראשית, כל עמדה חומצות אמיניות הוא אקראי על ידי אתר מכוון PCR מוטגנים. במהלך תהליך זה, גן מחולק קבוצות המורכבות עמדות רציפות באורך כולל לאכלס ידי פלטפורמת הרצף. מוצרי PCR מוטגנים לכל קבוצה מצורפים יחד, וכל קבוצה נתונה עצמאי בחירת רצף תפוקה גבוהה. על ידי שמירה על התכתבות בין המיקום של מוטציות ברצף והאורך לקריאת הרצף, גישה זו יש את היתרון של עומק רצף למקסם: בעוד אחד יכול פשוט רצף ספריות כאלה בחלונות קצרים ללא פיצול לקבוצות (למשל, על ידי רובה רגיל. גישת רצף), רוב הקורא המתקבל יהיה סוג-פרא ולכן מajority של תפוקת רצף המבוזבזת (למשל, עבור ספריית mutagenesis רווי כולה חלבון של חלבון חומצת אמינו 500 רצף ב 100 חומצות אמיניות (300 חלונות נ"ב), לכל הפחות 80% של הקורא יהיה רצף wild-type).

כאן, פרוטוקול מוצג אשר מנצל רצף תפוקה גבוהה עבור ההערכה התפקודית של ספריות mutagenesis רווי כולה חלבון, בגישה לעיל (המתואר באיור 1). חשוב לציין, אנחנו מציגים את השימוש של פריימרים מאונכים בתהליך שיבוט הספרייה ברקוד כל קבוצת רצף, אשר מאפשרת להם להיות מרובבות לתוך ספרייה אחד, נתון בו זמנית כדי הקרנה או בחירה, ולאחר מכן דה-מרובב על רצף עמוק. מאחר שקבוצות הרצף אינן חשופות בחירה באופן עצמאי, זה מפחית את עומס העבודה ומבטיח שכל מוטציה חווה את אותה רמת בחירה. TEM-1 β-lactamase, אנזים אשר מקנה עמידות גבוהה ברמהβ-לקטם אנטיביוטיקה (למשל., אמפיצילין) בחיידקים משמשת כמערכת מודל 14-16. פרוטוקול מתואר להערכת ספריית mutagenesis רווי כולה החלבון של TEM-1 ב E. coli תחת בחירה ברמה בסרום משוערת עבור מנה קלינית של אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) 17,18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: ראה איור 1 עבור קווי המתאר של הפרוטוקול. צעדים ריאגנטים כמה בפרוטוקול דורשים אמצעי בטיחות (מסומנים עם "זהירות"). התייעץ גיליונות נתוני בטיחות חומרים לפני השימוש. כל צעדי הפרוטוקול מבוצעים ב RT אלא אם כן זה צביעה.

1. כן מדיה התרבות צלח

  1. הכן לעקר ידי מעוקר 1 L מים מטוהרים, 100 מ"ל סופר אופטימל מרק (SOB; טבלה 1), 1 ליטר לוריא- Bertani מרק (LB; טבלה 2) ו -1 L LB-אגר (לוח 3). הכן בנפרד לעקר שלוש צלוחיות תרבות כל LB. 1 L המכיל
    הערה: לאורך כל הפרוטוקול "המים" מתייחסים חיטוי מעוקר מים מטוהרים; SOB, LB ו LB-אגר מתייחסים הפתרונות מעוקרות החיטוי.
  2. הכינו מלאי 12 מ"ג / מ"ל ​​של ט על ידי המסת hydrochloride טטרציקלין 0.12 גרם ב 10 מ"ל של אתנול 70%. לעקר באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר ולאחסןב 4 ° C מוגן מפני אור.
  3. LB-אגר מצננים 50 ° C ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של המניה ט (ריכוז סופי של 12 מיקרוגרם / מ"ל ​​ט). יוצקים לתוך צלחות פטרי וקריר ב RT מוגן מפני אור. חנות ב 4 ° C מוגן מפני אור.

2. בניית-גן הפריטים בספריית mutagenesis רוויה

הערה: Primers; PCRs הושלמה, מעכל ו קשירת הגבלה; ניתן לאחסן דגימות DNA מטוהרים ב -20 ° C.

  1. עיצוב פריימרים mutagenesis
    1. כדי mutagenize כל עמדת חומצות אמיניות לכל חומצות אמינו האפשריות, לעצב זוג פריימרים mutagenesis משלימים (במובן / קדימה antisense / הפוכה) לכל תפקיד חומצת אמינו עם ההנחיות הבאות:
      1. להחליף את קודון המתאים חומצת אמינו להיות mutagenized ידי NNS (כאשר N הוא תערובת של כל ארבעה בסיסים נוקליאוטידים ו- S הוא תערובת של ציטוזין (C) גואנין (G)) ובמרכז חסודהאה, מוקף כ -15 נוקלאוטידים בכל צד.
      2. ודא 5 'ו 3' מסתיים לסיים ב C או G וכי טמפרטורת ההתכה (T מ) הוא כ 70 ° C 3. השתמש NNS_PrimerDesign.m סקריפט חישובית (ראה קובץ קוד משלים) לתכנן פריימרים mutagenesis NNS פי הנחיות אלו.
    2. פריימרים להזמין ממקור מסחרי. על מנת להקל על השימוש, יש להם מסונתז בפורמט צלחת 96-היטב מראש מדולל במים עד 50 מיקרומטר, עם סט אחד של צלחות המכילות פריימרים mutagenesis תחושת ועוד פריימרים antisense.
    3. מלאו אגן פיפטה עם מים ולהשתמש פיפטה רבה להעביר 95 μl 263 בארות מעל שלוש צלחות 96-היטב. לדלל את פריימרים פי 20 ל -2.5 מיקרומטר באמצעות פיפטה רבה להעביר 5 μl מהצלחות 96-היטב המכילות את פריימרים mutagenesis ההגיוניים בארות מאותו המקור של הצלחות המכילות מים.
    4. חזורצעד פרוטוקול 2.1.3 לדלל את פריימרים mutagenesis antisense.
  2. סינתזה של-ספריות משנה NNS לכל תפקיד חומצת אמינו על ידי mutagenesis אתר מכוונת שני שלבים PCR
    1. בצעו את PCRs מוטגנים בסיבוב הראשון. עבור כל צבע יסוד mutagenesis, להכין תגובת PCR 25 μl באמצעות פלסמיד pBR322_AvrII כמו AatII_F התבנית פריימרים או AvrII_R (פריימרים mutagenesis תחושה זיווג עם פריימר AvrII_R, ו פריימרים mutagenesis antisense זיווג עם פריימר AatII_F; סך של 526 PCRs). ראה טבלה של חומרים עבור רצפי AatII_F ו AvrII_R.
      1. הכן PCR "תערובת אמן" על ידי הוספת חומרים כימיים מטבלה 4 צינור חרוטי 15 מ"ל. מעביר אגן פיפטה. השתמש פיפטה רבה להעביר 15 μl 263 בארות מעל שלוש צלחות 96-היטב PCR. השתמש פיפטה רב להעביר 10 μl מהצלחות 96-היטב המכיל את פריימרים mutagenesis תחושה מדולל ל בארות מאותו מקור in צלחות PCR.
      2. כיסוי כל צלחת PCR עם חותם צלחת 96-היטב. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 2 דקות.
      3. מעבירים את צלחות PCR כדי thermocycler ולהפעיל את התוכנית הבאה: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 20 מחזורים: 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 72 ° C עבור 1 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; להחזיק ב 4 ° C..
      4. פרוטוקול חזור על שלבים 2.2.1.1 - 2.2.1.3 עבור צלחות 96-היטב המכיל את פריימרים mutagenesis antisense מדולל.
    2. בצעו את PCRs בסיבוב השני מוטגנים. לכל תפקיד חומצת אמינו, להכין AatII_F פריימרים באמצעות תגובה 25 μl PCR ו AvrII_R, ואת מעורבות ומדולל בסיבוב הראשון מוצרי ה- PCR מוטגנים כתבנית (סה"כ 263 PCRs).
      1. מלאו אגן פיפטה עם מים ולהשתמש פיפטה רבה להעביר 198 μl 263 בארות מעל שלוש צלחות 96-היטב.
      2. שלב ו לדלל 100-לקפל את מוצרי ה- PCR מוטגנים לכל תפקיד חומצת אמינו באמצעות פיפטה רבה כדיההעברה הראשונה 1 μl מהצלחות 96-היטב PCR המכיל את מוצרי ה- PCR הנובעים פריימרים mutagenesis הגיוני בארות מאותו מקור של צלחות המכילות מים. לאחר מכן לחזור על העברה של מוצרי ה- PCR הנובעים פריימרים mutagenesis antisense.
      3. הכן PCR "תערובת אמן" על ידי הוספת חומרים כימיים מטבלה 5 צינור חרוטי 15 מ"ל. מעביר אגן פיפטה. השתמש פיפטה רבה להעביר 24 μl 263 בארות מעל שלוש צלחות 96-היטב PCR. השתמש פיפטה רב להעביר 1 μl מהצלחות 96-היטב המכיל את מעורבות ומדולל בסיבוב הראשון מוצרי ה- PCR מוטגנים אל בארות מאותו מקור של צלחות PCR.
      4. כיסוי כל צלחת PCR עם חותם צלחת 96-היטב. צנטריפוגה ב כ XG 200 במשך 2 דקות. צלחות העברה thermocycler ולהפעיל אותה תוכנית כמו בשלב פרוטוקול 2.2.1.3.
    3. נתחו את התוצאות של PCRs מוטגנים בסיבוב השני על ידי ג'ל אלקטרופורזה.ודא כי כל המוצרים הם של הגודל הנכון ונעדר של זיהום מוצרים.
      1. הוסף 2 מ"ל של צבע טעינת ג'ל 2x לאגן פיפטה ולאחר מכן להשתמש פיפטה רב להעביר 6 μl 263 בארות מעל שלוש צלחות 96-היטב. השתמש פיפטה רב להעביר 6 μl מהצלחות 96-היטב PCR המכיל את מוצרי ה- PCR סיבוב שני מוטגנים אל בארות מאותו מקור של צלחות 96-היטב המכיל צבען.
      2. כן ג'ל agarose 1.5% עם 0.2 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד (זהירות).
      3. סולם DNA טען נתיבים ראשונים והאחרונים של כל שורה. לאחר מכן השתמש פיפטה רבה לטעון 10 μl של דגימות משלב פרוטוקול 2.2.3.1.
      4. הפעל את הג'ל על 100 וולט במשך 40 דקות ותמונה על transilluminator UV.
      5. פרוטוקול חזור על שלבי 2.2.3.2 - 2.2.3.4 עד שכל הדגימות מנותחות.
    4. למדוד במדויק את הריכוז של כל מוצר NNS תת-ספריה PCR באמצעות ריאגנט quantitation dsDNA.
      1. לְהַעֲבִירכ 15 מ"ל EB חיץ אגן פיפטה. השתמש פיפטה רבה להעביר 49 μl 263 בארות מעל שלוש צלחות assay תחתונות 96-היטב, שחור קירות, ברורות.
      2. השתמש פיפטה רבה להעביר 1 μl של כל מוצר שני שלבים PCR (שלב פרוטוקול 2.2.2) על בארות מאותו המקור של צלחות assay 96-היטב.
      3. כן עקומת סטנדרט ריכוז ה- DNA על ידי דילול DNA הפאג למבדה 2 ng / μl ב 300 μl חיץ EB ולאחר מכן לבצע עשרה דילולים כפולים (עבור סכום כולל של 11 ריכוזים). העברת 50 μl לאחת עשרה העמודות הראשונות של שורה של אחד מלוחות assay 96-היטב מהשלב הקודם אשר אינו מכיל מדגם; לעמודה י"ב להוסיף 50 μl של חיץ EB (מגיב ריק).
      4. הכן מגיב quantitation dsDNA ידי הוספת 75 μl של מגיב (ראו טבלה של חומרים) כדי צינור חרוטי 15 מ"ל, ואז מוסיפים 15 מ"ל של חיץ EB. מערבבים על ידי היפוך צינור ולאחר מכן להעביר אגן פיפטה. גן מגיב מן האור.
      5. השתמש פיפטה רב להעביר 50 μl של מגיב quantitation dsDNA מוכן היטב בכל צלחות assay. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה. דגירה צלחות ב RT במשך 5 דקות מוגנים מפני אור.
      6. מדוד קרינה של כל דגימה באמצעות קורא microplate ואת אורכי גל והעמסה סטנדרטיים (עירור 485 ננומטר, פליטה 520 ננומטר; 0.1 שניות).
      7. הפחת את ערך הקרינה של ריק מגיב מכל הדגימות. ליצור עקומת תקן מן מדידות הקרינה של דגימות הפאג למבדה. חשב את הריכוז של כל דגימה באמצעות מדידות הקרינה שלהם ואת עקומת סטנדרט.
  3. שיבוט של ספריות משנת NNS לתוך וקטורי בחירה
    1. מערבבים 100 ng של כל מוצר תת-ספריה NNS PCR לחמש NNS קבוצות תת-ספריה. בעקבות 'הוראות היצרן, לנקות דגימות באמצעות ערכת טיהור DNA ולאחר מכן ריכוז למדוד באמצעות dsמגיב quantitation DNA.
      הערה: כל קבוצה מורכבת של כ 53 עמדות חומצות רציפות אמינו במרווחים לאורך רצף TEM-1 (NNS תת-ספריית קבוצות 1 - 5 מורכבות עמדות 26 - 78, 79 - 132, 133 - 183, 184 - 236, ו 237 - 290, בהתאמה; מונה על פי אמבלר ואח 19)..
    2. צור שיבוט וקטורים לכל קבוצת משנה הספרייה NNS.
      1. הכן חמישה 100 PCRs μl לפי טבלה 6, באמצעות פריימרים AvrII_F ו AatII_OP1_R - AatII_OP5_R, ו פלסמידים pBR322_OP1-5 כתבנית (AatII_OP1_R זיווג עם pBR322_OP1, וכו ').
      2. מעבירים thermocycler ולהפעיל את התוכנית הבאה: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 25 מחזורים: 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; להחזיק ב 4 ° C.. ראה T מסוגל של חומרים עבור רצפים של AatII_R ו AvrII_F.
      3. כן ג'ל agarose 1% עם 0.2 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד (זהירות).
      4. הוסף 20 μl של צבע טעינת ג'ל 6x מדגם PCR. טען את הנתיב הראשון של הג'ל עם סולם DNA; לטעון כל נפח של כל דגימה, מדלג לפחות אחד טוב בין דגימות.
      5. הפעל הג'ל על 100 וולט במשך 50 דקות.
      6. דמיינו ג'ל באמצעות נורת UV לטווח אורך הגל (זהירות). פרוסות ובלו המכילות את מוצר ה- PCR ב ~ 3,500 נ"ב; להעביר להפריד צינורות microfuge. פרוסות ג'ל ניתן לאחסן ב -20 ° C.
      7. בעקבות 'הוראות היצרן, לטהר דגימות באמצעות ערכת ג'ל מיצוי וריכוז מידה באמצעות ריאגנט quantitation dsDNA.
    3. עבור שתי הקבוצות תת-ספריית NNS (שלב פרוטוקול 2.3.1) ו וקטורי שיבוט (שלב פרוטוקול 2.3.2), להגדיר הגבלה מעכלת עם אנזימי AatII ו AvrII פי T 7 מסוגלים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. בעקבות 'הוראות היצרן, לנקות דגימות באמצעות ערכת טיהור DNA ולאחר מכן ריכוז למדוד באמצעות quantita dsDNAמגיב tion.
    4. הגדרת תגובות קשירת באי לוח 8 לכל קבוצת משנה הספרייה NNS מתעכל הגבלה עם וקטור שיבוט מתעכל הגבלה מאותו המקור (קבוצת משנה הספרייה NNS 1 עם pBR322_OP1, וכו '). לדגור על RT במשך שעה 1. לנקות תגובות באמצעות ערכת טיהור DNA על פי הוראות היצרן; elute DNA עם 20 μl של מים.
    5. להפוך את מכלול תגובות הקשירה מטוהר לתוך E. ספרייה יעילה קולי תאים על ידי electroporation.
      1. הפשרת א electrocompetent קולי תאים ולאחר מכן מקום תאים ותגובות קשירת מטוהרים על קרח.
      2. העברת 10 μl מופשרים תאים לתגובת כל קשירת מטוהרים ולאחר מכן להעביר קובט electroporation. Electroporate ב 1.8 קילו וולט.
      3. שחזור תאים על ידי resuspending ב 1 מ"ל SOB. דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
      4. Resuspend 10 μl של כל תרבות התאוששות 990 μl LB; להפיץ 100 μl על ג צלחות LB-אגרontaining 12 מיקרוגרם / מ"ל ​​ט. דגירה צלחות O / N (~ 16 שעות) בשעה 37 ° C.
      5. עבור כל תרבות התאוששות, להכין בקבוק תרבות 250 מ"ל עם 50 מ"ל LB ו -50 מניות ט μl. מעביר בקבוקון את ~ 1 המ"ל הנותר של תרבות התאוששות. דגירה O / N (~ 16 שעות) בשעה 37 ° C עם רעד נמרץ (~ 200 סל"ד).
    6. ספירת מושבות על כל צלחת. לחשב את מספר transformants מוצלח כמו figure-protocol-13010 , איפה figure-protocol-13083 הוא מספר מושבות, figure-protocol-13166 הוא נפח תרבות התאוששות (1,000 μl) ו figure-protocol-13268 נפח של תרבות התאוששות מצופה (1 μl).
      הערה: כדי להבטיח כיסוי מלא של כל המוטציות, ככלל אצבע מספר transformants מוצלח צריך להיות ≥100-לקפל על מספר מוטציות צפויות. כל הספרייה משנה NNS ~ 53 עמדות, כך המספר הצפוי של מוטציות הוא 53 עמדות × 32 קודונים / מיקום ≈ 1.7 × 10 3; לתת גודל ספרייה ≥100 פי (≥1.7 × 10 5) לא אמור להיות ≥170 מושב על כל צלחת.
    7. על פי הוראות היצרן, לבודד DNA פלסמיד מתרבויות באמצעות ערכת טיהור פלסמיד ולאחר מכן למדוד ריכוזים באמצעות ריאגנט quantitation dsDNA. מערבבים יחד 100 ננוגרם של כל פלסמיד. זה יוצר את ספריית mutagenesis רווי כולה החלבון הסופית.

בחירת 3. ספריית mutagenesis רווית Whole-חלבון TEM-1 עבור עמידות לאנטיביוטיקה

  1. הכנת התרבות הפרה-הבחירה.
    1. לדלל את פלסמיד משלב פרוטוקול 2.3.7 ל -0.5 ng / μl במים ולהעביר 20 μl לצינור microcentrifuge. בצע טרנספורמציה, מחדשcovery, ציפוי O / N צמיחה כפי שתואר לעיל בשלב פרוטוקול 2.3.5, למעט העברת 1 μl של התרבות התאוששות SOB 999 LB. μl
    2. ספירת מושבות. כדי להבטיח כיסוי מלא של כל המוטציות לא אמורה להיות ≥100 מושבות, המציין ≥10 6 transformants מוצלח (100 × 263 עמדות × 32 קודונים / מיקום ≈ 10 6).
    3. למדוד את ריכוז של תרבות 50 מ"ל O / N.
      1. הכן ריק LB על ידי הוספת 1 מ"ל LB קובט ספקטרופוטומטר. מדוד OD600 על ספקטרופוטומטר.
      2. לדלל את פי 10 התרבות O / N ידי resuspending 100 μl ב 900 LB. μl מדוד את OD600. הפחת את הקריאה OD600 של ריק ולהתרבות על ידי 10 לתת את OD600 של התרבות O / N.
    4. טרום לחמם את שלוש צלוחיות תרבות משלב פרוטוקול 1.1 עבור ~ 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לדלל את O / N תרבות OD600 = 0.1 ולהוסיף 1 מ"ל ל בקבוקון אחד (OD600 הסופי = 0.001). Tשלו הוא "תרבות טרום הבחירה".
    5. דגירה "תרבות טרום הבחירה" על 37 מעלות צלזיוס עם רעד נמרץ (200 סל"ד). מעת לעת לפקח הצמיחה על ידי מדידת OD600 כמו בשלב פרוטוקול 3.1.3 (זה לא הכרחי כדי לדלל התרבות של פי 10) עד OD600 = 0.1 (~ 2.5 שעות).
    6. העברת 100 מ"ל של התרבות הפרה-הבחירה לשני צינורות חרוטי 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 6 דקות ב 4 °. הסר ביותר של supernatant ולשלב לתוך צינור חרוטי 15 יחיד. חזור על צנטריפוגה ולהסיר את כל supernatant. חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
  2. בחירה להתנגדות אמפיצילין.
    1. בעוד תרבות טרום הבחירה היא דוגרת, להכין מלאי של 50 מ"ג / מיליליטר של Amp במים על ידי המסת אמפיצילין סודיום 0.5 גרם ב 10 מ"ל מים. לעקר באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. אל שתי צלוחיות אחרים, להוסיף ט לריכוז סופי של 12 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו כרך של tha כגון תרבות טרום הבחירה ך * OD600 הסופי = 0.001. כדי בקבוקון אחד, להוסיף 1 מ"ל Amp, ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​- זהו "תרבות הבחירה".
    3. דגירה התרבויות בשעה 37 ° C עם רעד נמרץ (200 סל"ד). צג הצמיחה של התרבות בגינם לא אמפיצילין נוסף בשלב הקודם, עד OD600 = 0.1 (~ 2.5 שעות). בשלב זה, גם למדוד את OD600 של תרבות הבחירה.
    4. מחלקים את OD600 של התרבות מבחר לתוך 0.1 ולהתרבות על ידי 100 מ"ל. העבר בכרך זה (~ 400 מ"ל) 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטי ב 4000 XG במשך 6 דקות ב 4 °. הסר ביותר של supernatant ולשלב לתוך צינור חרוטי 15 יחיד. חזור על צנטריפוגה ולהסיר את כל supernatant.
    5. על פי הוראות היצרן, לבודד פלסמיד דנ"א מן המיון מוקדם (שלב פרוטוקול 3.1.6) ובחירה (שלב פרוטוקול 3.2.4) כדורי תא תרבות ולאחר מכן למדוד ריכוזים באמצעות ריאגנט quantitation dsDNA.
tle "> 4. רצף תפוקה גבוהה כדי לקבוע את השפעות הכושר של מוטציות

  1. הכנת דגימות עבור סידור תפוקה גבוהה
    1. כן 25 PCRs μl לדה-זמנית קבוצות תת-ספריית NNS עם פריימרים מאונכים
      1. להכין תערובת אב PCR לפי טבלה 9; להעביר 23 μl עד עשרה צינורות PCR.
      2. הוסף 1 μl של 0.5 ng / μl DNA פלסמיד מטוהרים מן התרבות טרום הבחירה PCR צינורות 1 - 5 ו מתרבות מבחר לצינורות 6 - 10.
      3. מערבב יחד 50 μl של 50 מיקרומטר קדימה OP1_F פריימרים מאונכים - OP5_F עם OP1_R פריימרים מאונכים ההפוך בהתאמה - OP5_R. באותו סדר, העברת 1 μl צינורות PCR 1 - 5 ו -6 - 10. ראה טבלה של חומרים עבור רצפים של OP1_F - OP5_F ו OP1_R - OP5_R.
      4. העבר צינורות PCR כדי thermocycler. הפעל את התוכנית הבאה: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 20 מחזורים: 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 °; צלזיוס למשך 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; להחזיק ב 4 ° C..
    2. כן 25 PCRs μl לבודד כל אחת מהקבוצות תת-ספריית NNS
      1. לדלל 100-לקפל את PCRs העשרה משלב פרוטוקול 4.1.1.4 על ידי העברת 1 μl של כל להפריד צינורות PCR והוסיף 99 μl של מים. מערבבים, אז פיפטה 99 μl וזורקים.
      2. מערבבים יחד 50 μl של 50 פריימרים מיקרומטר קדימה Group1_F - Group5_F עם Group1_R פריימרים הפוכה בהתאמה - Group5_R. באותו סדר, העברת 1 μl כדי PCR צינורות 1 - 5 ו -6 - 10. ראה טבלה של חומרים עבור רצפים של Group1_F - Group5_F ו Group1_R - Group5_R.
      3. להכין תערובת אב PCR לפי טבלה 9, להעביר 23 μl על צינור אחד PCR. העבר צינורות PCR כדי thermocycler; להפעיל את אותה תוכנית כמו בשלב פרוטוקול 2.2.1.3.
    3. לבצע 25 PCRs μl הסופי להוסיף רצפים לאינדקס
      1. diלאוטה 100-לקפל את PCRs העשרה משלב פרוטוקול 4.1.2.3 על ידי העברת 1 μl של כל להפריד צינורות PCR והוסיף 99 μl של מים. מערבבים, אז פיפטה 99 μl וזורקים.
      2. להכין תערובת אב PCR לפי טבלה 9, להעביר 23 μl על צינור אחד PCR.
      3. עבור צינורות עם תבנית שמקורם קבוצות תת-ספריה NNS 1-5, להעביר 0.5 μl לכל פריימרים צינור קדימה 501_F - 505_F בהתאמה. עבור צינורות עם תבנית הנובעים תרבויות קדם-והתאמת, להעביר 0.5 μl לכל צינור הפוכה פריימרים 701_R ו 702_R, בהתאמה. ראה טבלה של חומרים עבור רצפים של 501_F - 505_F, ו 701_R ו 702_R.
      4. העבר צינורות PCR אל thermocycler ולהפעיל את התוכנית משלב 2.2.1.3.
    4. מערבבים ולטהר דגימות
      1. ריכוזים מדודים באמצעות ריאגנט quantitation dsDNA פי הוראות היצרן. מערבבים 100 ng של כל int מוצר ה- PCRצינור OA יחיד microcentrifuge.
      2. כן ג'ל agarose 2% עם 0.2 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד (זהירות).
      3. להוסיף צבע טעינת ג'ל 6x מדגם מוצרי PCR המעורב. טען את הנתיב הראשון של הג'ל עם סולם DNA; לטעון כל נפח של המדגם.
      4. הפעל הג'ל על 100 וולט במשך 50 דקות. דמיינו ג'ל באמצעות נורת UV לטווח אורך הגל (זהירות). פרוסה ובלו המכילה את מוצר ה- PCR ב ~ 360 נ"ב; להעביר microfuge שפופרת. ניתן לאחסן פרוסת ג'ל ב -20 ° C.
      5. בעקבות הוראות היצרן, לטהר מדגם באמצעות ערכת ג'ל מיצוי למדוד ריכוז באמצעות ריאגנט quantitation dsDNA. זהו המדגם הסופי עבור סידור תפוקה גבוהה.
    5. רצף על פלטפורמת רצף תפוקה גבוהה (ראה טבלה של חומרים עבור פלטפורמה בשימוש בפרוטוקול זה).
      1. חישוב ריכוז מדגם ננומטר כמו figure-protocol-21923, שם figure-protocol-21992 הוא הריכוז של המדגם בשנת ng / μl ו figure-protocol-22093 הוא אורך רצף של DNA במדגם (~ 360 נ"ב). לדלל מדגם 4 ננומטר חיץ EB.
      2. עקוב אחר הוראות היצרן כדי לפגל מדגם לדלל עד 9 בערב במאגר הכלאה.
      3. טען 600 μl של מדגם לתוך מחסנית מגיבה. הרצף הבא להוראות היצרן הנחיות על המסך.
  2. ניתוח של נתוני רצף
    1. הורד Flash (התאמת אורך תענית הסיפורים קצרה) 20, להציב לתוך תיקייה יחד עם קבצי fastq.gz המתקבלים רצף.
    2. להשתמש בפלאש להצטרף קבצי fastq.gz המתאימים-סוף לזווג קורא לכל זוג המדדים (קדימה הפוך קוראים לכל קבוצה תת-ספריית NNS עבור התרבויות קדם-והתאמה).
      1. פתח את שורת הפקודה ושינוי בספרייה לתיקייה בשלב פרוטוקול 4.2.1. הצטרפו כל זוג קורא באמצעות הפקודה: פלאש , שבו mates1.fastq.gz ו mates2.fastq.gz הם קבצים המכילים את קדימה לאחור קורא, בהתאמה.
    3. לאחר שהצטרף כל זוג קורא, למקם את קובץ פלט out.extendedFrags.fastq לתיקיות נפרדות תוצאות של תרבויות קדם-בחירה או בחירה. שנה את שם הקובץ פלט out.extendedFrags.fastq לפי קבוצת תת-ספריה NNS שאליו הוא עולה בקנה אחד (כלומר., 1.fastq, 2.fastq, וכו ').
    4. הפעל את NNS_DataAnalyzer.m סקריפט חישובית (ראה קובץ קוד משלים) מכל תיקייה כדי לחשב את הספירה עבור כל מוטציה בחומצה אמינית אחת, ואת הספירה עבור wild-type, לכל קבוצת משנה הספרייה NNS.
    5. לחשב את השפעת הכושר figure-protocol-23860 של כל מוטציה figure-protocol-23939 בכל תא figure-protocol-24024 כמו עשר לוגריתם בבסיס היחס של ספירת המתקבל בבחירה ( figure-protocol-24144 ) מול הבחירה מראש ( figure-protocol-24232 תנאים), ביחס wild-type:
      figure-protocol-24330 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מפת פלסמיד במשך חמשת פלסמידים pBR322 השונים המכילים אתרים יחולו אורתוגונלי (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) מוצגת באיור 2 א. כדי לבדוק אם פריימרים המאונכים הם ספציפיים, PCRs בוצע באמצעות כל זוג פריימרים מאונך בנפרד, יחד עם כל חמשת פלסמידים pBR322_OP1-5, או עם כל פלסמידי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הנה פרוטוקול מתואר לביצוע ההערכה התפקודית של ספריות mutagenesis רווי כולה חלבון, באמצעות טכנולוגיית ריצוף תפוקה גבוהה. היבט חשוב של השיטה הוא השימוש פריימרים מאונך במהלך תהליך השיבוט. בקצרה, כל עמדת חומצת אמינו היא אקראית על ידי מוטגנים PCR, ו מעורבת יחד לקבוצות של עמדות בש?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare they have no competing financial interests

Acknowledgements

R.R. acknowledges support from the National Institutes of Health (RO1EY018720-05), the Robert A. Welch Foundation (I-1366), and the Green Center for Systems Biology.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
TyptoneResearch Products Intl. Corp.T60060-1000.0
Yeast extractResearch Products Intl. Corp.Y20020-500.0
Sodium chlorideFisher ScientificBP358-212
Potassium chlorideSigma-AldrichP9333-500G
Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506-500G
AgarFisher ScientificBP1423-500
Tetracycline hydrochlorideSigma-AldrichT7660-5G
Petri platesCorning351029
MATLAB Mathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/
Oligonucleotide primersIntegrated DNA Technologieshttps://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos25 nmol scale, standard desalting
pBR322_AvrIIavailable upon requestpBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene
pBR322_OP1 – pBR322_OP5available upon requestfive modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites
Q5 high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0491Lincludes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer)
15 ml conical tubeCorning430025
Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus)Eppendorf
PCR plate, 96 wellFisher Scientific14230232
96 well plate sealExcel ScientificF-96-100
Veriti 96-well thermal cyclerApplied Biosystems4375786
6x gel loading dyeNew England BiolabsB7024S
AgaroseResearch Products Intl. Corp.20090-500.0
Ethidium bromideBio-Rad161-0433
UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech)Fotodyne Inc.http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB bufferQiagen19086
96-well black-walled, clear bottom assay platesCorning3651
Lambda phage DNANew England BiolabsN3011S
PicoGreen dsDNA reagentInvitrogenP7581dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4
Victor 3 V microplate readerPerkinElmer
DNA purification kitZymo ResearchD4003
Microcentrifuge tubesCorning3621
Long-wavelength UV illuminatorFisher ScientificFBUVLS-80
Agarose gel DNA extraction bufferZymo ResearchD4001-1-100
AatIINew England BiolabsR0117S
AvrIINew England BiolabsR0174L
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202S
EVB100 electrocompetent E. coliAvidityEVB100
Electroporator (E. coli Pulser)Bio-Rad1652102
Electroporation cuvettesBio-Rad165-2089
Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro)Amersham Biosciences80211237
50 ml conical tubesCorning430828
Plasmid purification kitMacherey-Nagel740588.25
8 well PCR strip tubesAxygen321-10-551
Qubit dsDNA HS assay kitInvitrogenQ32854dsDNA quantitation reagent
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
Qubit fluorometerInvitrogenQ32866
Ampicillin sodium saltAkron Biotechnology50824296
MiSeq reagent kit v2 (500 cycles)IlluminaMS-102-2003
MiSeq desktop sequencerIlluminahttp://www.illumina.com/systems/miseq.htmlalternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform
FLASh softwareJohn Hopkins University - open sourcehttp://ccb.jhu.edu/software/FLASH/software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data
AatII_FGATAATAATGGTTTCTTAGACG
TCAGGTGGC
AvrII_RCTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT
TAAAAATGAAG
AvrII_FCTTCATTTTTAATTTAAAAGGA
CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_RACCTGACGTCCGTATTTCAAC
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_RACCTGACGTCCGCTCACGGA
GTGTACTAATTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_RACCTGACGTCGTACGTCTGA
ACTTGGGACTTAAGAAACCA
TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_RACCTGACGTCCCGTTCTCGAT
ACCAAGTGATAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_RACCTGACGTCGTCCGTCGGA
GTAACAATCTTAAGAAACCAT
TATTATCATGACATTAAC
OP1_FGACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_RCGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_FATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_RAGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_FAGTCCCAAGTTCAGACGTAC
OP3_RGAAAAGTCCCAATGAGTGCC
OP4_FTCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_RTATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_FAGATTGTTACTCCGACGGAC
OP5_RTATAACAGGCTGCTGAGACC
Group1_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC
Group2_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC
Group3_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC
AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC
AATGATACCGCGAGACCC
Group5_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG
GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACTATAGCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
502_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACATAGAGGCACA
CTCTTTCCCTACACGAC
503_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACCCTATCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
504_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACGGCTCTGAACA
CTCTTTCCCTACACGAC
505_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACAGGCGAAGACA
CTCTTTCCCTACACGAC
701_RCAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATCGAGTAATGTGACTG
GAGTTCAGACGTG
702_RCAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATTCTCCGGAGTGACTG
GAGTTCAGACGTG

References

  1. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
  2. Mullis, K. B., Faloona, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).
  3. Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency. Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).
  4. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
  5. Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme. J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).
  6. Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence. J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).
  7. Kleina, L. G., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors. J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).
  8. Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).
  9. Fowler, D. M., et al. High-resolution mapping of protein sequence-function relationships. Nat Methods. 7 (9), 741-746 (2010).
  10. Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. Experimental illumination of a fitness landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).
  11. McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. The spatial architecture of protein function and adaptation. Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).
  12. Deng, Z., et al. Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution. J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).
  13. Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase. Cell. 160 (5), 882-892 (2015).
  14. Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity. Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).
  15. Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
  16. Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science. 312 (5770), 111-114 (2006).
  17. Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva. Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).
  18. Giachetto, G., et al. Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).
  19. Ambler, R. P., et al. A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases. Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).
  20. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies). Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  21. Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein. RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).
  22. Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. A systematic survey of an intragenic epistatic landscape. Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).
  23. Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts. Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).
  24. Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

113mutagenesismutagenesisTEM 1 beta lactamase

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved