ハイスループットシーケンシングを利用し全体プロテイン飽和突然変異誘発ライブラリの機能評価のためのプロトコル

要約

我々は、ハイスループットシーケンシングを利用したタンパク質の包括的な単一部位飽和突然変異誘発ライブラリの機能評価のためのプロトコルを提示します。重要なことに、このアプローチは、ライブラリー構築および配列決定を多重化するために直交するプライマー対を使用しています。アンピシリンの臨床的に関連する用量で選択されたTEM-1βラクタマーゼを使用して、代表的な結果を提供しています。

要約

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 β-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to β-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

概要

突然変異誘発は、長い生物学的システムとそれらの進化の特性を研究するために実験室で使用されており、強化された又は新規の機能を有する変異タンパク質または生物を生成します。初期のアプローチは、生物においてランダム突然変異を生成する方法に頼っているが、組換えDNA技術の出現は、部位特異的にDNAに選択の変更、 すなわち 、部位特異的突然変異誘発^1,2を導入する研究者を可能にしました。現在の技術は、典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に変異原性オリゴヌクレオチドを用いて、所与の遺伝子^3,4の突然変異の少数（ 例えば 、点突然変異）を作成し、評価するのが比較的容易です。時目標アプローチは、すべての可能なシングルサイト（または上位）の変異、例えば、作成及び評価、ただしはるかに困難です。

多くはMの多数を評価しようとする初期の研究から学習してきたが遺伝子におけるutationsは、使用される技術は、独立して、ナンセンスサプレッサー株を^5-7を使用して、各変異の評価を必要とする例えば、しばしば面倒だった、または起因サンガーシーケンシング⁸の低いシーケンシング深さへの定量的な能力に制限されていました。これらの研究で使用される技術は、主にハイスループットシークエンシング技術^9-12を利用^する方法に取って代わられています。これらの多数の突然変異を含むライブラリーを作成伴う概念的に単純なアプローチ、機能のための画面や選択にライブラリを施し、その後、ディープシークエンシング（ すなわち 、> 10 ⁶シーケンシング読み取りのオーダー）の前に得られたライブラリーと選択後。このようにして、多数の突然変異の表現型または適応度の効果は、各変異体の集団頻度の変化として表され、同時に、より定量的に評価することができます。

我々は以前あほを導入しましたタンパク質中のすべての可能な単一のアミノ酸変異のライブラリーを評価するためのル・アプローチ（ すなわち 、全タンパク質飽和突然変異誘発ライブラリ。）、より長いシーケンシング読み取り長^11,13よりも長さの遺伝子に適用：まず、各アミノ酸位置がランダム化されます部位指向性変異原性PCRによる。このプロセスの間に、遺伝子は、配列決定プラットフォームに収容全長と連続する位置からなるグループに分割されます。各グループの突然変異誘発PCR産物はその後組み合わされ、各グループは、独立して選択し、ハイスループット配列決定に供されます。シーケンスおよび配列の読み取り長の変異の位置との対応関係を維持することによって、このアプローチは、最大化、配列決定の深さの利点を有する：1は、単に基（ 例えば 、標準的な散弾銃によってに分割することなく、短いウィンドウでこのようなライブラリーを配列決定することができながら、配列決定アプローチ）は、ほとんどの野生型および従ってMなり得る読み取りシークエンシングのスループットのajorityは（ 例えば、100個のアミノ酸（300 bp）の窓に配列決定さ500アミノ酸のタンパク質の全タンパク質飽和突然変異誘発ライブラリーのために、読み込みの最低80％は野生型配列となります）無駄にしました。

ここでは、プロトコルは、（ 図1に概説）上記のアプローチを用いて、全タンパク質の飽和突然変異誘発ライブラリーの機能的な評価のためのハイスループットシークエンシングを利用する提示されています。重要なことは、我々は、スクリーニングまたは選択に同時に受ける彼らは1ライブラリに多重化することを可能にする、各シーケンスグループを、バーコード、ライブラリクローニング処理に直交するプライマーの使用法を紹介し、その後深いシーケンシングのために逆多重化。系列グループは、独立選択に供されていないので、これは、作業負荷を軽減し、各変異は選択の同じレベルを経験することを保証します。 TEM-1βラクタマーゼ、高レベルの耐性を付与する酵素βラクタム抗生物質（ 例えば 、アンピシリン）細菌では、モデル系^14〜16として使用されます。プロトコルは、 大腸菌におけるTEM-1の全タンパク質の飽和突然変異誘発ライブラリーの評価のために記載されていますアンピシリンの臨床用量（50μg/ mlの^）17,18のおおよその血清レベルでの選択の下で大腸菌 。

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プロトコル

注意：プロトコルの概要については、 図1を参照してください。プロトコルのいくつかの手順および試薬は、（「注意」で示す）安全対策が必要です。使用前に製品安全データシートを参照してください。他に示されない限り、すべてのプロトコルの工程は室温で行われます。

1.培養培地とプレートを準備します

1. 準備と滅菌1Lの精製水をオートクレーブで100mlの超最適ブロス（SOB; 表1）、1 Lルリア-ベルターニ培地（LB; 表2）と1LのLB寒天（ 表3）。別々に準備し、各1 L、LBを含む3つの培養フラスコを滅菌
   注：プロトコルを通して、「水」は、精製水、滅菌オートクレーブを指します。 SOB、LBおよびLB寒天はオートクレーブ滅菌ソリューションを参照してください。
2. 70％エタノール10mlに0.12グラムのテトラサイクリン塩酸塩を溶解することにより、テトの12 mg / mlでストックを準備します。 0.2μmのフィルターとストアを使用して滅菌4℃で光から保護。
3. クールLB寒天を50℃にした後、テトの株式（12 / mlのテトの最終濃度）の1ミリリットルを追加します。ペトリ皿の中に注ぎ、光から保護し、室温で冷却します。光から保護して4℃で保存します。

全遺伝子飽和突然変異誘発ライブラリーの2建設

注：プライマーを、 PCRを、制限消化およびライゲーションを完了しました。および精製されたDNAサンプルを、-20℃で保存することができます。

1. 突然変異誘発プライマーを設計します
   1. すべての可能なアミノ酸に各アミノ酸位置を変異誘発するには、次のガイドラインと、各アミノ酸位置のために（センス/フォワードおよびアンチセンス/リバース）の相補的変異誘発プライマー対を設計します。
      1. アミノ酸に対応するコドン（Nは​​4つ全てのヌクレオチド塩基の混合物であり、Sはシトシンの混合物（C）とグアニン（G）である）プリムおよび中央NNSによって変異誘発される置き換えてくださいえー、それぞれの側に約15個のヌクレオチドによって隣接。
      2. 5 'および3' CまたはGで終端し、融解温度（T _m）は約70℃で³であることを終了することを確認してください。これらのガイドラインに従ってNNS突然変異誘発プライマーを設計するために、計算スクリプトNNS_PrimerDesign.mを（補足コードファイルを参照してください）​​を使用します。
   2. 商業的供給源からのプライマーを注文します。使いやすさのために、それらは、96ウェルプレートフォーマットセンス変異誘発プライマーおよび別のアンチセンスプライマーを含有するプレートの一組で、50μMまで水で予め希釈で合成しました。
   3. 水をピペット盆地を記入し、3 96ウェルプレート上で263ウェルに95μLを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用しています。水を含有するプレートの同族ウェルにセンス変異誘発プライマーを含む96ウェルプレートからの5μlのを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用して、2.5μMにプライマー20倍に希釈します。
   4. 繰り返すアンチセンス変異誘発プライマーを希釈するためのプロトコルのステップ2.1.3。
2. 二段階PCR部位特異的突然変異誘発によって各アミノ酸位置のNNSサブライブラリーの合成
   1. 第一ラウンドの変異原性のPCRを行います。各突然変異誘発プライマーは、鋳型とプライマーとしてpBR322_AvrIIプラスミドを用いて、25μlのPCR反応を準備AatII_FまたはAvrII_R（; 526 PCRの合計プライマーAvrII_Rと対にセンス変異誘発プライマー、およびプライマーAatII_Fと対にアンチセンス変異誘発プライマー）。 AatII_FとAvrII_Rシーケンスのための材料の表を参照してください。
      1. 15mLのコニカルチューブに、表4からの試薬 ​​を添加することによって、PCR「マスターミックス」を調製します。ピペット盆地に転送します。 3 96ウェルPCRプレート上で263ウェルに15μLを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。私は同族のウェルに希釈されたセンス変異誘発プライマーを含む96ウェルプレートから10μLを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用して、nはPCRプレート。
      2. 96ウェルプレートシールで各PCRプレートをカバーしています。 2分間200×gで遠心分離します。
      3. サーモサイクラーにPCRプレートを移し、次のプログラムを実行します。30秒98°Cを。 20サイクル：10秒、98℃、20秒間55℃、1分間72°C; 2分間72°C; 4℃で保持します。
      4. 希釈されたアンチセンス変異誘発プライマーを含む96ウェルプレートのために2.2.1.3 - 繰返しプロトコルは2.2.1.1ステップ。
   2. 第二ラウンドの変異原性のPCRを行います。各アミノ酸位置については、プライマーAatII_FとAvrII_Rを用いて25μlのPCR反応液を調製し、混合し、鋳型（263 PCRの合計）として、第一ラウンドの突然変異誘発PCR産物を希釈しました。
      1. 水をピペット盆地を記入し、3 96ウェルプレート上で263ウェルに198μLを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用しています。
      2. にマルチチャンネルピペットを用いて、各アミノ酸位置の突然変異誘発PCR産物を100倍結合し、希薄水を含むプレートの同族ウェルにセンス変異誘発プライマーから得られたPCR産物を含む96ウェルPCRプレートから最初の転送1μlの。そして、アンチセンス変異誘発プライマーから得られたPCR産物のための転送を繰り返します。
      3. 15mLのコニカルチューブに、表5からの試薬 ​​を添加することによって、PCR「マスターミックス」を調製します。ピペット盆地に転送します。 3 96ウェルPCRプレート上で263ウェルに24μLを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。混合を含む96ウェルプレートの1μLを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用して、PCRプレート中で同系のウェルに第一ラウンドを突然変異誘発PCR産物を希釈しました。
      4. 96ウェルプレートシールで各PCRプレートをカバーしています。 2分間、約200×gで遠心分離します。転送プレートはサーモサイクラーとプロトコルステップ2.2.1.3と同じプログラムを実行します。
   3. ゲル電気泳動によって、第2ラウンドの変異原性PCRの結果を分析します。すべての製品は、製品を汚染する正しいサイズおよび不在であることを確認してください。
      1. ピペット流域に2倍ゲルローディング色素の2ミリリットルを追加し、3、96ウェルプレート上で263ウェルに6μLを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用しています。色素を含む96ウェルプレートの同族ウェルに2回目の変異原性PCR産物を含む96ウェルPCRプレートから6μLを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。
      2. 0.2 / mlのエチジウムブロマイド（注意）を用いて1.5％アガロースゲルを準備します。
      3. 各行の最初と最後のレーンでのロードDNAラダー。そして、プロトコルのステップ2.2.3.1からのサンプルを10μlをロードするためにマルチチャンネルピペットを使用しています。
      4. UVトランスイルミネーター上で40分間および画像用の100Vでゲルを実行します。
      5. すべてのサンプルが分析されるまで、2.2.3.4 - を繰り返しプロトコルは2.2.3.2手順。
   4. 正確のdsDNA定量試薬を使用して、各NNSサブライブラリーPCR産物の濃度を測定します。
      1. 移転ピペット流域に約15ミリリットルのEB緩衝液。 3 96ウェル黒壁、透明底アッセイプレート上で263ウェルに49μLを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。
      2. 96ウェルアッセイプレートの同族ウェルにそれぞれ第二段階PCR産物（プロトコルステップ2.2.2）の1μLを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。
      3. 300μlのEB緩衝液中で2 ngの/μlにラムダファージDNAを希釈することにより、DNA濃度の標準曲線を作成した後、（11濃度の合計）1002年倍希釈液を作ります。何のサンプルが含まれていない前のステップからの96ウェルアッセイプレートの1の行の最初の11列への転送を50μl;第十二列にEB緩衝液（試薬ブランク）の50μlを添加します。
      4. 試薬75μlのを追加することによって、二本鎖DNAの定量試薬を調製後、EB緩衝液の15ミリリットルを追加し、15ミリリットルコニカルチューブに（ 材料の表を参照してください）。チューブを転倒混和した後、ピペット盆地に転送します。光から試薬を保護します。
      5. アッセイプレートの各ウェルに準備したdsDNA定量試薬50μlのを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。アップダウンをピペットで混ぜます。光から保護し、室温で5分間、プレートをインキュベートします。
      6. マイクロプレートリーダーと標準フルオレセイン波長（; 0.1秒励起485 nmで、発光520 nm）を用いて、各サンプルの蛍光を測定します。
      7. すべてのサンプルから試薬ブランクの蛍光値を引きます。ラムダファージサンプルの蛍光測定値から標準曲線を生成します。それぞれの蛍光測定値と標準曲線を用いて、各試料の濃度を計算します。
3. 選択ベクターへのNNSのサブライブラリーのクローニング
   1. 5 NNSのサブライブラリーのグループに各NNSのサブライブラリーのPCR産物の100 ngのを混ぜます。メーカーの説明書に従って、DNA精製キットを用いて、サンプルをクリーンアップしてからのdsを使用して濃度を測定DNAの定量試薬。
      注：各グループは、TEM-1配列（NNSサブライブラリーグループ1に沿って離間約53個の連続した​​アミノ酸位置で構成されている - 5は、位置26で構成されている - 78、79から132まで、133から183まで、184から236、および237から290まで、それぞれ、番号付け）アンブラーら ¹⁹に従って。
   2. 各NNSサブライブラリグループのクローニングベクターを作成します。
      1. テンプレート（pBR322_OP1と対になってAatII_OP1_R、など）AatII_OP5_R、およびプラスミドpBR322_OP1-5 -プライマーAvrII_FとAatII_OP1_Rを使用して、 表6によると5を100μlのPCRを準備します。
      2. サーマルサイクラーと次のプログラムを実行するために転送：30秒98°Cを。 25サイクル：10秒、98℃、20秒間55℃、1.5分間72°C; 2分間72°C; 4℃で保持します。 AatII_RとAvrII_Fのシーケンスのための材料のできる Tを参照してください。
      3. 0.2 / mlのエチジウムブロマイド（注意）1％アガロースゲルを準備します。
      4. 各PCRサンプルに6倍ゲルローディング色素の20μLを加えます。 DNAラダーとゲルの最初のレーンをロードします。サンプル間でも、少なくとも1をスキップして、各サンプルのボリューム全体をロードします。
      5. 50分間、100Vでゲルを実行します。
      6. 長波長紫外線照射器（注意）を用いてゲルを可視化します。 〜3500塩基対でのPCR産物を含む物品税スライス。個別のマイクロチューブに移します。ゲル切片を-20℃で保存することができます。
      7. 製造業者の説明書に従って、ゲル抽出キットとのdsDNA定量試薬を使用して測定濃度を用いてサンプルを精製します。
   3. NNSのサブライブラリーグループ（プロトコルステップ2.3.1）およびクローニングベクター（プロトコルステップ2.3.2）の両方について、設定制限ができる T 7に記載のAatIIおよびAvrIIでの酵素で消化する。37℃で1時間インキュベートします。メーカーの指示に従って、DNA精製キットを用いて、サンプルをクリーンアップした後、二本鎖DNA quantitaを使用して濃度を測定ション試薬。
   4. 同族の制限消化クローニングベクター（などpBR322_OP1、とNNSのサブライブラリーグループ1）と各制限消化NNSのサブライブラリーグループについては、 表8を次の連結反応を設定します。室温で1時間インキュベートします。製造元の指示に従ってDNA精製キットを用いて反応をクリーンアップします。水20μlのDNAを溶出。
   5. ライブラリ-効率的な大腸菌に精製された連結反応の全体を変換しますエレクトロポレーションによって細胞を大腸菌 。
      1. 雪解けエレクトロE.その後、 大腸菌細胞と氷上で細胞および精製されたライゲーション反応を配置します。
      2. 転送10μlを各精製されたライゲーション反応に細胞を解凍し、次いでエレクトロポレーションキュベットに移します。 1.8 kVのでエレクトロポ。
      3. 1ミリリットルSOBに再懸濁することにより細胞を回収。 37℃で1時間インキュベートします。
      4. 990μlのLBの各回復文化の10μlのを再懸濁し、 LB寒天プレートCに100μLを広めますontaining 12 / mlのテト。プレートを37℃でO / N（〜16時間）インキュベートします。
      5. 各回復培養には、50ミリリットルのLBと50μlのTetリ株式で250ミリリットルの培養フラスコを準備します。回復文化の残り〜1ミリリットルをフラスコへ移します。 （〜200 rpm）で激しく振盪しながら37℃でO / N（〜16時間）インキュベートします。
   6. 各プレート上のコロニーの数を数えます。成功した形質転換体の数を計算ここで、 コロニーの数は、 回復培養容量（千μl）をし、 回復培養物の容量は、（1μl）をめっきします。
      注：成功した形質転換体の数があるべき経験則として、すべての突然変異の完全なカバレッジを確保するために≥1予想される変異の数を超える00倍。各NNSのサブライブラリーは〜53ポジションを持っているので、突然変異の予想される数は、32個のコドン/位置≈1.7×10 ^3×53箇所です。ライブラリーサイズは≥100倍（≥1.7×10 ^5）を得、各プレート上≥170コロニーがあるはずです。
   7. 製造業者の説明書に従って、プラスミド精製キットを用いて培養物からプラスミドDNAを単離し、その後のdsDNA定量試薬を用いて濃度を測定します。一緒に各プラスミド100ngのを混ぜます。これは、最終的な全タンパク質飽和突然変異誘発ライブラリーを作成します。

抗生物質耐性のためのTEM-1の全タンパク質飽和突然変異誘発ライブラリの3セレクション

1. 事前選択培地の調製。
   1. 水の中の0.5ng /μlにプロトコルのステップ2.3.7からのプラスミドを希釈し、マイクロチューブに20μlのを転送します。変換を実行し、再covery、めっきおよびO / N成長以前に999μlのLBにSOB回復文化の転送1μlを除いて、プロトコルのステップ2.3.5で説明したように
   2. コロニーの数を数えます。すべての変異の完全なカバレッジを確保するために^≥106成功した形質転換体（10 ^6≈32コドン/ポジション×100×263の位置）を示す≥100コロニー、そこにあるべきです。
   3. 50ミリリットルO / N培養の濃度を測定します。
      1. 分光光度計のキュベットに1ミリリットルLBを追加することにより、LBブランクを準備します。分光光度計でOD600を測定します。
      2. 900μlのLBの中に100μLを再懸濁することにより、O / N培養10倍に希釈OD600を測定します。ブランクのOD600の読みを減算し、O / N培養のOD600を与えるために10を掛けます。
   4. 37℃で約30分間、プロトコルのステップ1.1から3培養フラスコを事前に温めます。 OD600 = 0.1にO / N培養物を希釈し、1フラスコ（最終OD600 = 0.001）に1ミリリットルを追加します。 T彼は、「事前選択の文化」です。
   5. 激しく振盪（200rpm）しながら37℃での「事前選択文化」をインキュベートします。定期的にOD600 = 0.1（〜2.5時間）まで（文化10倍に希釈する必要はありません）プロトコルのステップ3.1.3のようにOD600を測定することにより、成長を監視します。
   6. 2 50mlコニカルチューブに事前選択培地の100ミリリットルを転送します。 4℃で6分間、4000×gで遠心分離します。上清の大部分を除去し、単一の15コニカルチューブにまとめます。遠心分離を繰り返し、すべての上清を除去します。 -20℃で保管してください。
2. アンピシリン耐性の選択。
   1. 事前選択文化がインキュベートされているが、10ミリリットルの水に0.5グラムのアンピシリンナトリウムを溶解させることにより、水中のアンプを50mg / mlのストックを用意。 4℃で0.2μmのフィルターとストアを使用して滅菌します。
   2. 他の2つのフラスコに、12μgの/ mlおよび事前選択培養例えば股関節の体積の最終濃度までのTetを追加最終OD600 = 0.001トン。 1フラスコに、50μg/ mlの最終濃度のために、1ミリリットルアンプを追加する - これが「選択文化」です。
   3. 激しく振盪（200rpm）しながら37℃で培養をインキュベートします。 OD600 = 0.1（〜2.5時間）まで全くアンピシリンが前の手順で追加しなかったために培養物の増殖を、監視します。このとき、また、選択培地のOD600を測定します。
   4. 0.1に選択培地のOD600を分割し、100ミリリットルを掛け。 4℃で6分間、4000×gで50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にこのボリューム（〜400ml）に転送します。上清の大部分を除去し、単一の15コニカルチューブにまとめます。遠心分離を繰り返し、すべての上清を除去します。
   5. 製造業者の説明書に従って、事前選択（プロトコルステップ3.1.6）と選択（プロトコルステップ3.2.4）培養細胞ペレットからプラスミドDNAを単離し、その後のdsDNA定量試薬を用いて濃度を測定します。

突然変異のフィットネス効果を決定するためTLE "> 4。ハイスループットシーケンシング

1. ハイスループットシークエンシングのための試料の調製
   1. 直交するプライマーを用いて逆多重化NNSのサブライブラリーのグループに25μlのPCRのを準備します
      1. 表9に記載の PCRマスターミックスを調製します。 10 PCRチューブに23μlずつ移します。
      2. 10から6をチューブに5および選択培養物から - 1チューブをPCRするために事前選択培養からの0.5ng /μlの精製されたプラスミドDNAの1μLを加えます。
      3. それぞれの逆直交プライマーOP1_RとOP5_F - - OP5_R一緒に50μMのフォワード直交プライマーOP1_F50μlのを混ぜます。同じ順序で、PCRチューブへの転送1μlの1から5および6 - OP5_FとOP1_R - - OP5_R OP1_Fのシーケンスのための材料の 10を参照してください表 。
      4. サーモサイクラーにPCRチューブを転送します。次のプログラムを実行します。30秒98°Cを。 20サイクル：10秒、55°、98°C; 20秒間℃、1.5分間72°C; 2分間72°C; 4℃で保持します。
   2. NNSサブライブラリーのグループのそれぞれを分離するために25μLのPCRを準備
      1. PCRチューブを分離するために各1μLを移し、水99μLを追加することにより、プロトコルのステップ4.1.1.4から10のPCRを100倍希釈します。ミックスは、その後、99μlのをピペットで廃棄します。
      2. それぞれのリバースプライマーGroup1_RとGroup5_F - - Group5_R一緒に50μMのフォワードプライマーGroup1_F50μlのを混ぜます。同じ順序でPCRチューブに、転送1μlの1から5と6 - 10 Group1_Fのシーケンスのための材料の表参照- Group5_FとGroup1_R - Group5_R。
      3. 各PCRチューブに23μlのを転送、 表9に記載の PCRマスターミックスを調製します。サーモサイクラーにPCRチューブを移します。プロトコルステップ2.2.1.3と同じプログラムを実行します。
   3. 索引作成配列を付加する最終25μlのPCRのを行います
      1. ディリュートPCRチューブを分離するために各1μLを移し、水99μLを追加することにより、プロトコルのステップ4.1.2.3から10のPCRを100倍。ミックスは、その後、99μlのをピペットで廃棄します。
      2. 各PCRチューブに23μlのを転送、 表9に記載の PCRマスターミックスを調製します。
      3. それぞれ505_F - NNSのサブライブラリーグループ1-5から発信テンプレートとチューブの場合、チューブあたり0.5μlのフォワードプライマー501_Fを転送します。事前選択し、選択培養物から得られたテンプレートを使用してチューブの場合、チューブ当たり0.5μlのは、それぞれ、プライマー701_Rと702_Rを​​逆に転送します。 505_F、および701_Rと702_R - 501_Fのシーケンスのための材料の表を参照してください。
      4. サーモサイクラーにPCRチューブを移し、ステップ2.2.1.3からプログラムを実行します。
   4. サンプルを混合し、精製
      1. 製造業者の指示に従ってのdsDNA定量試薬を用いて濃度を測定します。各PCR産物intの100 ngのを混ぜますOA単一のマイクロチューブ。
      2. 0.2 / mlのエチジウムブロマイド（注意）で2％アガロースゲルを準備します。
      3. 混合PCR産物サンプルに6倍ゲルローディング色素を追加します。 DNAラダーとゲルの最初のレーンをロードします。サンプルのボリューム全体をロードします。
      4. 50分間、100Vでゲルを実行します。長波長紫外線照射器（注意）を用いてゲルを可視化します。 〜360塩基対でのPCR産物を含む物品税スライス。チューブを微量遠心する転送します。ゲル切片を-20℃で保存することができます。
      5. 製造業者の説明書に従って、ゲル抽出キットを用いてサンプルを精製したdsDNA定量試薬を用いて濃度を測定します。これは、ハイスループット配列決定のための最終的なサンプルです。
   5. ハイスループットシークエンシング・プラットフォーム上の配列（このプロトコルで使用されるプラットフォームのための材料の表を参照してください）。
      1. nm単位での試料の濃度を計算しますここで、 試料の濃度はngの/μl中で、 サンプルDNA（〜360塩基対）の配列の長さです。 EB緩衝液で4 nMのにサンプルを希釈します。
      2. サンプルを変性し、ハイブリダイゼーション緩衝液中で午後9時に希釈するために、製造元の指示に従ってください。
      3. 試薬カートリッジにロードしたサンプルの600μLを。製造元の指示し、画面の指示以下のシーケンス。
2. 配列決定データの解析
   1. フラッシュ（ショートの高速長さ調整読み取り^）20をダウンロード^し 、配列決定から得られfastq.gzファイルとともにフォルダに配置します。
   2. ペアエンドに対応するfastq.gzファイルを結合するために使用するフラッシュ（フォワードおよびリバースは、事前選択し、選択培養に各NNSのサブライブラリーグループに対して読み込み）インデックスのペアごとに読み込みます。
      1. プロトコルステップ4.2.1のフォルダにコマンドプロンプトを開いてディレクトリー。フラッシュ 、mates1.fastq.gzとmates2.fastq.gzが前方を含むファイルであり、逆に読み込み、それぞれ：コマンドを使用して読み取るの各ペアに参加しましょう​​。
   3. 読み込みの各ペアに参加した後、事前選択または選択培養液からの結果を別のフォルダにout.extendedFrags.fastq出力ファイルを配置します。それは（ すなわち 、1.fastq、2.fastqなど）に対応するNNSのサブライブラリーグループに応じout.extendedFrags.fastq出力ファイルの名前を変更します。
   4. 各NNSのサブライブラリーグループのために、野生型のため、各単一のアミノ酸変異のカウント、およびカウントを計算するために、各フォルダから計算スクリプトNNS_DataAnalyzer.m（補足コードファイルを参照してください）​​を実行します。
   5. フィットネス効果を計算各変異の各位置選択で得られたカウント数の比率のベース10対数（など ）（事前選択対野生型と比較して）条件：
      。

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結果

直交プライミング部位（pBR322_OP1 - pBR322_OP5）を含む5変更されたpBR322プラスミドのためのプラスミドマップを図2Aに示されています。直交プライマーが特異的であるかどうかをテストするには、PCRは全て5 pBR322_OP1-5プラスミドと一緒に、またはすべてのプラスミドマイナス直交プライマーペアに一致するプラスミドで、個別に直交するプライマーの各ペアを?...

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ディスカッション

ここで、プロトコルは、ハイスループットシークエンシング技術を使用して、全タンパク質の飽和突然変異誘発ライブラリーの機能的評価を行うために記載されています。この方法の重要な局面は、クローニングプロセスの間に直交プライマーの使用です。簡潔には、各アミノ酸位置は、突然変異誘発PCRによってランダム化され、そして合わせた配列の長さ、ハイスループットシークエンシ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Typtone	Research Products Intl. Corp.	T60060-1000.0
Yeast extract	Research Products Intl. Corp.	Y20020-500.0
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506-500G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660-5G
Petri plates	Corning	351029
MATLAB	Mathworks	http://www.mathworks.com/products/matlab/
Oligonucleotide primers	Integrated DNA Technologies	https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos	25 nmol scale, standard desalting
pBR322_AvrII	available upon request		pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene
pBR322_OP1 – pBR322_OP5	available upon request		five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites
Q5 high-fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491L	includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer)
15 ml conical tube	Corning	430025
Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus)	Eppendorf
PCR plate, 96 well	Fisher Scientific	14230232
96 well plate seal	Excel Scientific	F-96-100
Veriti 96-well thermal cycler	Applied Biosystems	4375786
6x gel loading dye	New England Biolabs	B7024S
Agarose	Research Products Intl. Corp.	20090-500.0
Ethidium bromide	Bio-Rad	161-0433
UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech)	Fotodyne Inc.	http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB buffer	Qiagen	19086
96-well black-walled, clear bottom assay plates	Corning	3651
Lambda phage DNA	New England Biolabs	N3011S
PicoGreen dsDNA reagent	Invitrogen	P7581	dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4
Victor 3 V microplate reader	PerkinElmer
DNA purification kit	Zymo Research	D4003
Microcentrifuge tubes	Corning	3621
Long-wavelength UV illuminator	Fisher Scientific	FBUVLS-80
Agarose gel DNA extraction buffer	Zymo Research	D4001-1-100
AatII	New England Biolabs	R0117S
AvrII	New England Biolabs	R0174L
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S
EVB100 electrocompetent E. coli	Avidity	EVB100
Electroporator (E. coli Pulser)	Bio-Rad	1652102
Electroporation cuvettes	Bio-Rad	165-2089
Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro)	Amersham Biosciences	80211237
50 ml conical tubes	Corning	430828
Plasmid purification kit	Macherey-Nagel	740588.25
8 well PCR strip tubes	Axygen	321-10-551
Qubit dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q32854	dsDNA quantitation reagent
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q32866
Ampicillin sodium salt	Akron Biotechnology	50824296
MiSeq reagent kit v2 (500 cycles)	Illumina	MS-102-2003
MiSeq desktop sequencer	Illumina	http://www.illumina.com/systems/miseq.html	alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform
FLASh software	John Hopkins University - open source	http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/	software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data
AatII_F			GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC
AvrII_R			CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG
AvrII_F			CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_R			ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_R			ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_R			ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_R			ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_R			ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC
OP1_F			GACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_R			CGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_F			ATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_R			AGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_F			AGTCCCAAGTTCAGACGTAC
OP3_R			GAAAAGTCCCAATGAGTGCC
OP4_F			TCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_R			TATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_F			AGATTGTTACTCCGACGGAC
OP5_R			TATAACAGGCTGCTGAGACC
Group1_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC
Group2_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC
Group3_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC
Group5_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC
502_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC
503_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC
504_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC
505_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC
701_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG
702_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG