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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll für die funktionelle Bewertung umfassender single-site Sättigungsmutagenese Bibliotheken von Proteinen Hochdurchsatz-Sequenzierung verwendet. Wichtig ist, nutzt dieser Ansatz orthogonalen Primerpaare Bibliothek Konstruktion und Sequenzierung zu multiplexen. Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von TEM-1 β-Lactamase in klinisch relevanter Dosierung von Ampicillin ausgewählt werden bereitgestellt.

Zusammenfassung

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 β-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to β-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

Einleitung

Mutagenese wurde lange im Labor verwendet worden, um die Eigenschaften von biologischen Systemen und ihre Entwicklung zu studieren, und mutierte Proteine ​​oder Organismen mit verbesserten oder neuen Funktionen zu erzeugen. Während die ersten Ansätze auf Methoden verlassen , die in Organismen zufällige Mutationen erzeugen, Forscher das Aufkommen der rekombinanten DNA - Technologie ermöglicht die Einführung wählen Änderungen an DNA in einer ortsspezifisch, dh., Ortsgerichtete Mutagenese 1,2. Mit den derzeitigen Techniken, typischerweise unter Verwendung von mutagenen Oligonukleotide in einer Polymerase - Kettenreaktion (PCR) ist es relativ leicht zu erzeugen und zu bewerten , eine kleine Anzahl von Mutationen (z. B. Punktmutationen) in einem gegebenen Gen 3,4. Es ist viel schwieriger, aber wenn das Ziel Ansätze, zum Beispiel die Erstellung und Bewertung aller möglichen Single-Site (oder höherer Ordnung) Mutationen.

Während ein Großteil wurde von frühen Studien gelernt Versuch, eine große Zahl von m zu beurteilenutations in Genen, die verwendeten Techniken waren oft mühsam, zum Beispiel die Bewertung der einzelnen Mutation erfordern eine unabhängige Verwendung von Nonsense - Suppressor - Stämmen 5-7, oder sie wurden in ihrer quantitativen Fähigkeit aufgrund der geringen Sequenzierungstiefe von Sanger - Sequenzierung 8 begrenzt. Die Techniken , die in diesen Studien verwendet wurden weitgehend durch Verfahren ersetzt worden 9-12 High-Throughput - Sequenzierung Technologie. Diese konzeptionell einfache Ansätze zur Folge Erstellen einer Bibliothek , die eine große Anzahl von Mutationen umfasst, Unterwerfen der Bibliothek an einen Bildschirm oder eine Auswahl für die Funktion und dann tief Sequenzierung (dh. In der Größenordnung von> 10 6 Sequenzierung liest) die Bibliothek erhalten vor und nach der Auswahl. Auf diese Weise können die phänotypische oder Eignung Wirkungen einer großen Anzahl von Mutationen, wie die Änderung in Bevölkerungsfrequenz jedes mutanten dargestellt, bewertet werden, um gleichzeitig und quantitativ.

Wir führten zuvor eine einfa(. dh Ganz Protein Sättigungsmutagenese - Bibliotheken) le Ansatz für Bibliotheken aller möglichen einzelnen Aminosäure - Mutationen in Proteinen Beurteilung für Gene mit einer Länge länger als die Sequenzierung lesen Länge 11,13: Zuerst wird jede Position Aminosäure randomisierten durch ortsgerichtete mutagene PCR. Während dieses Prozesses wird das Gen in Gruppen aufgeteilt, bestehend aus zusammenhängenden Positionen mit einer Gesamtlänge von der Sequenzierungs Plattform untergebracht sind. Die mutagene PCR-Produkte für jede Gruppe werden dann kombiniert, und jede Gruppe unabhängig voneinander zur Auswahl und Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen. Durch die Aufrechterhaltung hat eine Entsprechung zwischen der Position von Mutationen in der Sequenz und die Sequenzierung Leselänge dieser Ansatz den Vorteil der Maximierung Sequenzierungstiefe: während man einfach könnte sequenzieren solche Bibliotheken in kurzen Fenstern ohne Aufteilung in Gruppen (beispielsweise durch eine Standard - Schrotflinte. Sequenzierung Ansatz), die meisten liest wäre erhaltenen Wildtyp und damit die majority von Sequenzierungsdurchsatz verschwendet (beispielsweise für ein ganzes Protein Sättigungsmutagenese Bibliothek eines Proteins 500 Aminosäure in 100 Aminosäure sequenziert (300 bp) Fenster, bei mindestens 80% der liest , wird die Wildtyp - Sequenz ist).

Hier wird ein Protokoll vorgestellt , das Hochdurchsatz - Sequenzierung für die funktionelle Beurteilung des gesamten Protein - Sättigungsmutagenese - Bibliotheken verwendet, die obige Ansatz (skizziert in Abbildung 1). Wichtig ist, stellen wir die Verwendung von orthogonalen Primern in der Bibliothek Klonierungsverfahren jede Sequenzgruppe zu Barcode, der sie in einer Bibliothek gemultiplext werden können, gleichzeitig Screening oder Selektion unterzogen und dann für tiefe Sequenzierung demultiplexiert. Da die Sequenzgruppen nicht unabhängig Selektion unterzogen werden, verringert sich die Arbeitsbelastung und stellt sicher, dass jede Mutation, das gleiche Niveau der Auswahl erfährt. TEM-1-β-Lactamase, ein Enzym, das auf hohem Niveau Resistenz verleihtβ-Lactam - Antibiotika (z. B. Ampicillin) in Bakterien wird als Modellsystem 14-16 verwendet. Ein Protokoll wird für die Beurteilung der Gesamtprotein Sättigungsmutagenese Bibliothek von TEM-1 in E. beschrieben coli unter Selektion bei einer ungefähren Serumspiegel für eine klinische Dosis von Ampicillin (50 ug / ml) 17,18.

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Protokoll

Hinweis: Siehe Abbildung 1 für Umriss des Protokolls. Mehrere Schritte und Reagenzien, die in dem Protokoll erfordern Sicherheitsmaßnahmen (mit "Vorsicht" gekennzeichnet). Wenden Sie Sicherheitsdatenblätter vor dem Gebrauch. Alle Protokollschritte werden bei RT, sofern nicht andere angegeben.

1. Bereiten Sie Kultur, Medien und Platten

  1. Vorbereiten und Sterilisieren durch Autoklavieren 1 L gereinigtes Wasser, 100 ml SOB-Medium (SOB; Tabelle 1), 1 L Luria-Bertani - Brühe (LB; Tabelle 2) und 1 l LB-Agar (Tabelle 3). Bereiten Sie separat und zu sterilisieren drei Kulturflaschen mit jeweils 1 L LB.
    Hinweis: Während das Protokoll "Wasser" bezieht sich auf im Autoklaven sterilisiert gereinigtes Wasser; SOB, LB und LB-Agar beziehen sich auf die im Autoklaven sterilisiert Lösungen.
  2. Bereiten Sie eine 12 mg / ml Stamm von Tet durch Auflösen von 0,12 g Tetracyclin-Hydrochlorid in 10 ml 70% Ethanol. Sterilisieren einen 0,2 um Filter und Speicher mitbei 4 ° C vor Licht geschützt.
  3. Kühle LB-Agar auf 50 ° C abgekühlt und dann 1 ml Tet Lager (Endkonzentration von 12 ug / ml Tet). Gießen Sie in Petrischalen und kühl bei RT vor Licht geschützt. Lagerung bei 4 ° C vor Licht geschützt.

2. Aufbau des Voll Gen Sättigungsmutagenese Bibliothek

Hinweis: Die Primer; fülltes PCRs, Restriktionsverdau und Ligationen; und gereinigtes DNA-Proben können bei -20 ° C gelagert werden.

  1. Entwerfen Mutagenese - Primer
    1. Um jede Aminosäureposition auf alle möglichen Aminosäuren mutieren, entwerfen ein Paar von komplementären Mutagenese-Primer (Sense / Vorwärts und Antisense / rückwärts) für jede Aminosäureposition mit den folgenden Richtlinien:
      1. Replace das Codon der Aminosäure entspricht, die durch NNS zu mutagenisierenden (wobei N eine Mischung aller vier Nukleotidbasen ist und S eine Mischung von Cytosin (C) und Guanin (G)) und in der Mitte in der primer, flankiert von etwa 15 Nukleotide auf jeder Seite.
      2. Stellen Sie sicher , dass die 5 'und 3' Enden enden in C oder G ist und daß die Schmelztemperatur (T m) beträgt etwa 70 ° C 3. Verwenden Sie das Rechen Skript NNS_PrimerDesign.m (siehe Zusatzcode-Datei) NNS Mutagenese-Primer zu entwerfen, nach diesen Richtlinien.
    2. Um Primer aus einer kommerziellen Quelle. Zur leichteren Verwendung wurden sie in 96-Well-Plattenformat und vorverdünnt in Wasser auf 50 & mgr; M, mit einem Satz von Platten, die die Sinnes Mutagenese-Primer und eine andere, die Antisense-Primer synthetisiert.
    3. Füllen Sie eine Pipette Becken mit Wasser und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette 95 & mgr; l bis 263 Brunnen über drei 96-Well-Platten zu übertragen. Verdünnen Sie die Primer 20-fachen bis 2,5 & mgr; M von einer Mehrkanalpipette unter Verwendung von 5 & mgr; l aus den 96-Well-Platten zu übertragen, die Sinn Mutagenese Primer an die artverwandten Vertiefungen der Platten, die Wasser enthalten.
    4. WiederholenProtokollschritt 2.1.3 die Antisense-Mutagenese-Primer zu verdünnen.
  2. Synthese von NNS Unterbibliotheken für jede Aminosäureposition durch zweistufige PCR ortsgerichtete Mutagenese
    1. Führen Sie die ersten Runde mutagene PCRs. Für jede Mutageneseprimers, bereiten eine 25 & mgr; l PCR-Reaktion pBR322_AvrII Plasmid als Matrize und Primer AatII_F oder AvrII_R mit (Sense-Mutagenese-Primer gepaart mit Primer AvrII_R und Antisense-Primer-Mutagenese mit dem Primer AatII_F gepaart; insgesamt 526 PCRs). Siehe Tabelle der Materialien für AatII_F und AvrII_R Sequenzen.
      1. Vorbereiten eines PCR "Master Mix" durch Zugabe der Reagenzien aus Tabelle 4 zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Übertragung auf eine Pipette Becken. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette 15 ul bis 263 Brunnen über drei 96-Well-PCR-Platten zu übertragen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette 10 & mgr; l aus den 96-Well-Platten zu übertragen, die verdünnte Sinn Mutagenese Primer an die artverwandten Vertiefungen, die in die PCR-Platten.
      2. Cover jede PCR-Platte mit einer 96-Well-Platte Dichtung. Zentrifuge bei 200 × g für 2 min.
      3. Übertragen Sie die PCR-Platten zu Thermocycler und führen Sie das folgende Programm: 98 ° C für 30 Sekunden; 20 Zyklen: 98 ° C für 10 sec, 55 ° C für 20 sec, 72 ° C für 1 min; 72 ° C für 2 min; bei 4 ° C zu halten.
      4. Wiederholungsprotokollschritte 2.2.1.1 - 2.2.1.3 für die 96-Well-Platten, die die verdünnten Antisense-Mutagenese-Primer enthält.
    2. Führen Sie die zweite Runde mutagenen PCR-Reaktionen. Für jede Aminosäureposition, bereiten eine 25 & mgr; l PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer AatII_F und AvrII_R, und die gemischte und verdünnt ersten Runde mutagenen PCR-Produkte als Vorlage (insgesamt 263 PCRs).
      1. Füllen Sie eine Pipette Becken mit Wasser und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette 198 & mgr; l auf 263 Bohrlöchern über drei 96-Well-Platten zu übertragen.
      2. Kombinieren und verdünnen das 100-fache der mutagenen PCR-Produkte für jede Aminosäureposition durch die Verwendung einer Mehrkanalpipette zuerste Transfer 1 ul aus den 96-Well-PCR-Platten, die die PCR-Produkte von den Sinnes Mutagenese Primer an die artverwandten Vertiefungen der Platten resultierende Wasser enthält. Dann wiederholen Sie die Übertragung für die PCR-Produkte aus den Antisense-Mutagenese-Primer führt.
      3. Vorbereiten eines PCR "Master Mix" durch Zugabe der Reagenzien aus Tabelle 5 zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Übertragung auf eine Pipette Becken. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette 24 & mgr; l bis 263 Brunnen über drei 96-Well-PCR-Platten zu übertragen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette 1 ul aus den 96-Well-Platten zu übertragen, die gemischt und verdünnt ersten Runde mutagenen PCR-Produkte zu den artverwandten Brunnen in den PCR-Platten enthalten.
      4. Cover jede PCR-Platte mit einer 96-Well-Platte Dichtung. Zentrifuge bei etwa 200 × g für 2 min. Übertragungsplatten zu Thermocycler und das gleiche Programm wie in Protokoll Schritt 2.2.1.3 ausgeführt werden.
    3. Analysieren Ergebnisse der zweiten Runde mutagene PCR durch Gelelektrophorese.Stellen Sie sicher, dass alle Produkte in der richtigen Größe sind und fehlen Produkte verunreinigen.
      1. 2 ml 2x Gel Laden Farbstoff zu einer Pipette Becken und dann einer Mehrkanalpipette verwenden, um 6 ul übertragen zu 263 Bohrlöcher über drei 96-Well-Platten. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette 6 ul der 96-Well-PCR-Platten zu übertragen, die zweite Runde mutagenen PCR-Produkte zu den artverwandten Vertiefungen der 96-Well-Platten, die Farbstoff enthält.
      2. Bereiten Sie eine 1,5% Agarose-Gel mit 0,2 ug / ml Ethidiumbromid (ACHTUNG).
      3. Laden DNA-Leiter in der ersten und letzten Spuren von jeder Zeile. Dann mit einem Mehrkanalpipette 10 ul-Proben von Protokollschritt 2.2.3.1 zu laden.
      4. Führen Sie das Gel bei 100 V für 40 min und Bild auf einem UV-Transilluminator.
      5. Wiederholen Sie die Schritte Protokoll 2.2.3.2 - 2.2.3.4, bis alle Proben analysiert werden.
    4. genau messen die Konzentration jedes NNS Teilbibliothek PCR-Produkt eine dsDNA Quantifizierung Reagenz.
      1. Übertragungca. 15 ml EB-Puffer auf eine Pipette Becken. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette 49 & mgr; l bis 263 Brunnen über drei 96-Loch-schwarz-walled, klarer Boden Assayplatten zu übertragen.
      2. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette 1 ul jeder zweiten Schritt PCR-Produkt (Protokoll Schritt 2.2.2) mit den zugehörigen Vertiefungen der 96-Well-Assayplatten zu übertragen.
      3. Bereiten Sie eine DNA-Konzentration Standardkurve von Lambda-Phagen-DNA auf 2 ng / ul in 300 ul EB-Puffer verdünnt und dann zu zehn Mal zweifachen Verdünnungen (für insgesamt 11 Konzentrationen). Dann werden 50 & mgr; l zu ersten elf Spalten einer Reihe von einem der 96-Well-Assayplatten aus dem vorherigen Schritt, die keine Probe enthält; der zwölften Spalte 50 ul EB-Puffer (Reagenzienblind) hinzufügen.
      4. Bereiten Sie dsDNA Quantifizierung Reagenz durch Zugabe von 75 & mgr; l Reagens (siehe Tabelle der Materialien) zu einem 15 ml konischen Röhrchen, dann 15 ml EB Puffer hinzuzufügen. Mischen von Rohr Umkehren und dann übertragen auf eine Pipette Becken. Schützen Reagenz aus Licht.
      5. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette 50 ul vorbereitete dsDNA Quantifizierung Reagenz in jede Vertiefung der Testplatten zu übertragen. Mischen durch Pipettieren von up-and-down. Die Platten bei RT für 5 min vor Licht geschützt.
      6. Messen Sie Fluoreszenz jeder Probe unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader und Standard-Fluoreszenzwellenlängen (Anregung 485 nm, Emission 520 nm, 0,1 sec).
      7. Ziehen Sie den Fluoreszenzwert des Reagenzienblind aus allen Proben. Generieren Sie eine Standardkurve aus den Fluoreszenzmessungen von Lambda-Phagen-Proben. Berechnen Sie die Konzentration jeder Probe unter Verwendung ihrer jeweiligen Fluoreszenzmessungen und die Standardkurve.
  3. Klonierung von NNS Teilbibliotheken in Selektionsvektoren
    1. Mischen Sie 100 ng jedes NNS Teilbibliothek PCR-Produkt in fünf NNS Unterbibliothek Gruppen. Nach den Anweisungen des Herstellers, aufzuräumen Proben, die einen DNA-Reinigung-Kit und dann Konzentration messen einen DS mitDNA-Quantifizierung Reagenz.
      Hinweis: Jede Gruppe besteht aus etwa 53 zusammenhängende Positionen Aminosäuren im Abstand entlang der TEM-1-Sequenz (NNS Unterbibliothek Gruppen 1 bis 5 bestehen aus Positionen 26-78, 79-132, 133-183, 184-236, und 237-290 sind; Nummerierung nach Ambler et al 19)..
    2. Erstellen Vektoren für jede NNS Unterbibliothek Gruppe klonen.
      1. Bereiten fünf 100 ul PCRs gemäß Tabelle 6, unter Verwendung von Primern und AvrII_F AatII_OP1_R - AatII_OP5_R und Plasmiden pBR322_OP1-5 als Templat (AatII_OP1_R mit pBR322_OP1 gepaart, etc.).
      2. Transfer zum Thermocycler und führen Sie das folgende Programm: 98 ° C für 30 Sekunden; 25 Zyklen: 98 ° C für 10 sec, 55 ° C für 20 sec, 72 ° C für 1,5 min; 72 ° C für 2 min; bei 4 ° C zu halten. Siehe T können von Materialien für die Sequenzen von AatII_R und AvrII_F.
      3. Bereiten Sie eine 1% Agarose-Gel mit 0,2 ug / ml Ethidiumbromid (ACHTUNG).
      4. In 20 ul 6x Gelauftrag Farbstoff zu jeder PCR-Probe. Legen Sie die erste Spur des Gels mit DNA-Leiter; laden gesamte Volumen jeder Probe, mindestens eine Vertiefung zwischen den Proben zu überspringen.
      5. Führen Gel bei 100 V für 50 min.
      6. Visualisieren Gel mit einer langwelligen UV-Illuminator mit (VORSICHT). Excise Scheiben des PCR-Produkts bei ~ 3500 bp enthält; Transfer-Mikrozentrifugenröhrchen zu trennen. Gel-Scheiben können bei -20 ° C gelagert werden.
      7. Nach den Anweisungen des Herstellers, zu reinigen Proben mit einem Gel-Extraktions-Kits und messen Konzentration eine dsDNA Quantifizierung Reagenz verwendet wird.
    3. Sowohl für die NNS Unterbibliothek Gruppen (Protokoll Schritt 2.3.1) und Klonierungsvektoren (Protokollschritt 2.3.2), die Einschränkung auf verdaut mit AatII und AvrII Enzyme gemäß T 7 ​​in der Lage. 1 h bei 37 ° C inkubieren. Nach den Anweisungen des Herstellers, aufzuräumen Proben, die einen DNA-Reinigung-Kit und dann Konzentration messen eine dsDNA quanti mittion Reagenz.
    4. Richten Sie Ligasierungsreaktionen folgende Tabelle 8 für jede restringiert NNS Teilbibliothek Gruppe mit artverwandten restringiert Klonierungsvektor (NNS Unterbibliothek Gruppe 1 mit pBR322_OP1, etc.). für 1 h bei RT inkubiert. Clean up Reaktionen eine DNA-Reinigungs-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird; DNA mit 20 ul Wasser ausströmen.
    5. Wandeln Sie die Gesamtheit der gereinigten Ligasierungsreaktionen in Bibliothek effiziente E. coli - Zellen durch Elektroporation.
      1. Thaw elektrokompetete E. coli - Zellen und dann Ortszellen und gereinigte Ligasierungsreaktionen auf Eis.
      2. Transfer 10 ul Zellen zu jeder gereinigten Ligationsreaktion aufgetaut und dann übertragen auf Elektroporationsküvette. Elektroporation bei 1,8 kV.
      3. Recover Zellen durch in 1 ml SOB Resuspendieren. bei 37 ° C für 1 Stunde inkubiert.
      4. 10 ul jeder Erholung Kultur in 990 & mgr; l LB resuspendieren; verteilt 100 & mgr; l auf LB-Agar-Platten containing 12 ug / ml Tet. Inkubieren Platten O / N (~ 16 Stunden) bei 37 ° C.
      5. Für jede Erholung Kultur, bereiten Sie einen 250 ml Kulturflasche mit 50 ml LB und 50 ul Tet Lager. Übertragen Sie die restlichen ~ 1 ml Erholung Kultur in den Kolben. Inkubieren O / N (~ 16 Stunden) bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln (~ 200 rpm).
    6. Zähle die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte. Berechnen Sie die Anzahl der erfolgreichen Trans als figure-protocol-13200 , woher figure-protocol-13277 ist die Anzahl der Kolonien, figure-protocol-13375 ist die Erholung Kulturvolumen (1000 ul) und figure-protocol-13489 ist Volumen der Erholung Kultur (1 ul) plattiert.
      Hinweis: Um eine vollständige Abdeckung aller Mutationen zu gewährleisten, als Faustregel gilt: die Zahl der erfolgreichen Trans sein sollte ≥100-fache der Anzahl der erwarteten Mutationen über. Jede NNS Unterbibliothek hat ~ 53 - Positionen, so dass die erwartete Anzahl von Mutationen beträgt 53 Positionen × 32 Codons / Position ≈ 1,7 × 10 3; zu geben , sollte eine Bibliothek Größe ≥100-fach (≥1.7 × 10 5) dort ≥170 Kolonien auf jeder Platte sein.
    7. Nach den Anweisungen des Herstellers, Isolat Plasmid-DNA aus Kulturen ein Plasmid Purification Kit und anschließend Konzentrationen messen einen dsDNA Quantifizierung Reagenz. Mischen Sie 100 ng jedes Plasmid. Dies schafft die endgültige Voll Protein Sättigungsmutagenese Bibliothek.

3. Auswahl des TEM-1 Whole-Protein Sättigungsmutagenese Bibliothek für Antibiotika-Resistenz

  1. Herstellung der Vorselektion Kultur.
    1. Man verdünnt das Plasmid aus Protokollschritt 2.3.7 bis 0,5 ng / ul in Wasser zugeben und 20 & mgr; l auf ein Reaktionsgefäß. Führen Transformation, reErholung, Beschichtungs- und O / N Wachstum wie zuvor in Protokollschritt 2.3.5 beschrieben, mit der Ausnahme Transfer 1 ul der SOB Erholung Kultur zu 999 & mgr; l LB.
    2. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien. Um eine vollständige Abdeckung aller Mutationen sollte es ≥100 Kolonien sein, was darauf hinweist ≥10 6 erfolgreiche Trans (100 × 263 × 32 Positionen Codons / Position ≈ 10 6).
    3. Messen der Konzentration der 50 ml O / N-Kultur.
      1. Bereiten Sie eine LB Rohling durch Zugabe von 1 ml LB zu einer Spektrophotometerküvette. Messung der OD600 auf einem Spektralphotometer.
      2. Verdünne das O / N-Kultur 10-fach durch Resuspendieren in 100 & mgr; l 900 & mgr; l LB. Messen Sie die OD 600. Ziehen Sie die OD600 Lesen des Zuschnitts und mit 10 multiplizieren die OD600 des O / N-Kultur zu geben.
    4. Pre-warm die drei Kulturflaschen aus Protokollschritt 1.1 für ~ 30 min bei 37 ° C. Verdünnen Sie die O / N-Kultur zu OD 600 = 0,1 und 1 ml zu einem Kolben (endgültige OD 600 = 0,001). Tsein ist die "Pre-Selection-Kultur".
    5. Inkubiere die "Vorauswahl culture" bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln (200 rpm). Periodisches Wachstum OD600 überwachen, indem wie in Protokoll Messschritt 3.1.3 (es ist nicht notwendig, ist die Kultur verdünnt werden 10-fach) bis OD600 = 0,1 (~ 2,5 h).
    6. Übertragung von 100 ml der Vorselektion Kultur zu zwei 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 4.000 xg für 6 min bei 4 ° C. Entfernen Sie die meisten Überstand und kombinieren in einem einzigen 15 konischen Röhrchen. Wiederholen der Zentrifugation und entfernen Sie alle Überstand. Lagerung bei -20 ° C.
  2. Selektion auf Ampicillinresistenz.
    1. Während die Vorauswahl Kultur brütet, bereiten in 10 ml Wasser mit einer 50 mg / ml Lager von Amp in Wasser durch Lösen von 0,5 g Natrium Ampicillin. Sterilisieren einen 0,2 um Filter und lagern bei 4 ° C verwendet wird.
    2. Zu den anderen zwei Kolben, fügen Tet zu einer Endkonzentration von 12 & mgr; g / ml und einem Volumen der Vorselektion Kultur solcher Tha t die endgültige OD 600 = 0,001. Zu einem Kolben, 1 ml Amp, für eine Endkonzentration von 50 ug / ml - das ist die "Auswahl-Kultur".
    3. Inkubieren der Kulturen bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln (200 rpm). Überwachen Wachstum der Kultur für die kein Ampicillin wurde in dem vorhergehenden Schritt zugegeben, bis OD600 = 0,1 (~ 2,5 h). Zu diesem Zeitpunkt messen auch die OD600 der Selektionskultur.
    4. Teilen Sie die OD600 der Auswahl Kultur in 0,1 und multiplizieren mit 100 ml. Übertragen, um dieses Volumen (~ 400 ml) auf 50 ml konischen Röhrchen und zentrifugiert bei 4.000 xg für 6 min bei 4 ° C. Entfernen Sie die meisten Überstand und kombinieren in einem einzigen 15 konischen Röhrchen. Wiederholen der Zentrifugation und entfernen Sie alle Überstand.
    5. Nach den Anweisungen des Herstellers, Isolat Plasmid-DNA aus der Vorauswahl (protocol Schritt 3.1.6) und Auswahl (protocol Schritt 3.2.4) -Pellets Kulturzelle und dann Konzentrationen messen einen dsDNA Quantifizierung Reagenz.
tle "> 4. Hochdurchsatz-Sequenzierung, um die Fitness Auswirkungen von Mutationen bestimmen

  1. Vorbereitung von Proben für Hochdurchsatz - Sequenzierung
    1. Bereiten Sie 25 ul PCR-Reaktionen zu de-multiplexen die NNS Unterbibliothek Gruppen mit orthogonalen Primer
      1. Bereiten Sie eine PCR - Master - Mix gemäß Tabelle 9; Transfer 23 ul zu zehn PCR-Röhrchen.
      2. 1 ul 0,5 ng / & mgr; l gereinigter Plasmid-DNA aus der Vorselektion Kulturröhrchen PCR 1 - 10 - 5 und von der Selektionskultur 6 bis Rohren.
      3. Mischen Sie 50 ul 50 uM Vorwärtsorthogonaltransformation Primer OP1_F - OP5_F mit dem jeweiligen Umkehr orthogonalen Primer OP1_R - OP5_R. In der gleichen Reihenfolge, Transfer 1 & mgr; l PCR - Röhrchen 1 - 5 und 6 - 10. Siehe Tabelle der Materialien für Sequenzen von OP1_F - OP5_F und OP1_R - OP5_R.
      4. Übertragen PCR-Röhrchen zu Thermocycler. Führen Sie das folgende Programm: 98 ° C für 30 Sekunden; 20 Zyklen: 98 ° C für 10 sec, 55 °; C für 20 sec, 72 ° C für 1,5 min; 72 ° C für 2 min; bei 4 ° C zu halten.
    2. Bereiten Sie 25 ul PCR-Reaktionen jedes der NNS Teilbibliothek Gruppen zu isolieren
      1. Verdünnen Sie das 100-fache der zehn PCRs von Protokollschritt 4.1.1.4 durch die Übertragung von 1 ul jeder PCR-Röhrchen zu trennen und das Hinzufügen von 99 & mgr; l Wasser. Mix, dann 99 ul Pipette heraus und entsorgen.
      2. Mischen Sie 50 ul 50 uM Vorwärtsprimer Group1_F - Group5_F mit dem jeweiligen Reverse Primer Group1_R - Group5_R. Group5_F und Group1_R - - Group5_R 5 und 6 - - für Sequenzen von Group1_F 10. Siehe Tabelle der Materialien in der gleichen Reihenfolge, Transfer 1 ul Röhrchen 1 bis PCR.
      3. Bereiten Sie eine PCR - Master - Mix gemäß Tabelle 9, übertragen 23 & mgr; l jedes PCR - Röhrchen. Übertragen PCR-Röhrchen zu Thermocycler; Führen Sie das gleiche Programm wie in Protokoll Schritt 2.2.1.3.
    3. Führen Sie die letzten 25 ul PCRs Indizierung Sequenzen hinzugefügt werden
      1. DiLaute 100-fach die zehn PCRs von Protokollschritt 4.1.2.3 von 1 ul jeder Übertragung von PCR-Röhrchen zu trennen und das Hinzufügen von 99 & mgr; l Wasser. Mix, dann 99 ul Pipette heraus und entsorgen.
      2. Bereiten Sie eine PCR - Master - Mix gemäß Tabelle 9, übertragen 23 & mgr; l jedes PCR - Röhrchen.
      3. Für Rohre mit Vorlage von NNS Unterbibliothek Gruppen Ursprung 1-5, Transfer 0,5 ul pro Röhrchen Forward-Primer 501_F - 505_F sind. Für Rohre mit Vorlage aus den Kulturen Vorauswahl und Selektion resultierenden Transfer 0,5 ul pro Röhrchen Reverse-Primer 701_R und 702_R sind. Siehe Tabelle der Materialien für Sequenzen von 501_F - 505_F und 701_R und 702_R.
      4. Übertragen PCR-Röhrchen zum Thermocycler und starten Sie das Programm von dem Schritt 2.2.1.3.
    4. Mischen Sie und reinigen Proben
      1. Measure Konzentrationen unter Verwendung eines Reagens dsDNA Quantifizierung gemäß den Anweisungen des Herstellers. Mischungs 100 ng jedes PCR-Produkt intoa einzigen Reaktionsgefäß.
      2. Bereiten Sie eine 2% Agarose-Gel mit 0,2 ug / ml Ethidiumbromid (ACHTUNG).
      3. In 6x Gel Laden Farbstoff zu dem gemischten PCR-Produkte Probe. Legen Sie die erste Spur des Gels mit DNA-Leiter; laden gesamte Volumen der Probe.
      4. Führen Gel bei 100 V für 50 min. Visualisieren Gel mit einer langwelligen UV-Illuminator mit (VORSICHT). Excise Scheibe das PCR-Produkt bei ~ 360 bp enthält; Rohrweiche zu Mikrofuge. Gelstück kann bei -20 ° C gelagert werden.
      5. Nach den Anweisungen des Herstellers, zu reinigen Probe ein Gel-Extraktions-Kits verwenden und messen Konzentration eines dsDNA Quantifizierung Reagenz. Dies ist die letzte Probe für die Hochdurchsatz-Sequenzierung.
    5. Sequenz auf einem Hochdurchsatz - Sequenzierung Plattform (siehe Tabelle der Materialien für die Plattform in diesem Protokoll verwendet).
      1. Berechnen Probenkonzentration in nM figure-protocol-22007, Wobei figure-protocol-22082 ist die Konzentration der Probe in ng / ul und figure-protocol-22198 ist die Sequenzlänge der Probe DNA (~ 360 bp). Verdünnte Probe bis 4 nM in EB-Puffer.
      2. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers Probe zu denaturieren und zu 21.00 Uhr in Hybridisierungspuffer verdünnen.
      3. Last 600 ul der Probe in Reagenzkassette. Sequence folgenden Anweisungen des Herstellers und auf dem Bildschirm.
  2. Analyse der Sequenzierungsdaten
    1. Download Flash Player (schnelle Verstellung des Kurz liest) 20, legen Sie in den Ordner zusammen mit fastq.gz Dateien aus Sequenzierung erhalten.
    2. Verwenden Sie Flash die fastq.gz Dateien entsprechend dem Paired-End zu verbinden für jedes Paar von Indizes liest (vorwärts und rückwärts liest für jede NNS Teilbibliothek Gruppe für die Vorauswahl und Auswahl Kulturen).
      1. Öffnen Sie die Eingabeaufforderung, und ändern Sie das Verzeichnis in Protokollschritt 4.2.1 in den Ordner. Registriert jedes Paar liest Befehl: Flash , wobei mates1.fastq.gz und mates2.fastq.gz sind die Dateien enthält, die vorwärts und rückwärts liest, respectively.
    3. jedes Paar liest Nach dem Verbinden, legen Sie die out.extendedFrags.fastq Ausgabedatei in separate Ordner für die Ergebnisse der Vorauswahl oder Auswahl Kulturen. Benennen Sie die out.extendedFrags.fastq Ausgabedatei entsprechend der NNS Unterbibliothek , zu welcher Gruppe sie entspricht (dh., 1.fastq, 2.fastq, etc.).
    4. Führen Sie das Rechen Skript NNS_DataAnalyzer.m (siehe Zusatzcode-Datei) von jedem Ordner die Zählungen für jede einzelne Aminosäure-Mutation zu berechnen, und die Zählungen für den Wildtyp, für jede NNS Teilbibliothek Gruppe.
    5. Berechnen Sie den Fitness-Effekt figure-protocol-24025 jeder Mutation figure-protocol-24109 an jeder Position figure-protocol-24207 als Basis zehn Logarithmus des Verhältnisses der Zählungen in der Selektion erhalten ( figure-protocol-24365 ) Im Vergleich zu der Vorauswahl ( figure-protocol-24471 ) Zustand, bezogen auf den Wildtyp:
      figure-protocol-24584 .

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Ergebnisse

Die Plasmid - Karte für die fünf modifizierten pBR322 Plasmiden , die orthogonal Primingstellen (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) ist in 2A gezeigt. Um zu testen, ob die orthogonal Primer sind spezifisch, PCRs wurden durchgeführt, um jedes Paar von orthogonalen Primer einzeln, zusammen mit allen fünf pBR322_OP1-5 Plasmiden oder mit allen Plasmiden minus dem Plasmid, das das orthogonale Primerpaars entspricht. Die richtige Produkt wurde nur erhalten , wenn die passenden Plasm...

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Diskussion

Hier ist ein Protokoll zum Durchführen der funktionellen Bewertung des gesamten protein Sättigungsmutagenese Bibliotheken beschriebenen Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologie. Ein wichtiger Aspekt des Verfahrens ist die Verwendung von orthogonalen Primern während des Klonens. Kurz gesagt, wird jede Aminosäureposition durch mutagene PCR randomisiert, und zusammen in Gruppen von Positionen, deren kombinierte Sequenzlänge von Hochdurchsatz-Sequenzierung untergebracht ist gemischt. Diese Gruppen kloniert in Plasmid-Ve...

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Offenlegungen

The authors declare they have no competing financial interests

Danksagungen

R.R. acknowledges support from the National Institutes of Health (RO1EY018720-05), the Robert A. Welch Foundation (I-1366), and the Green Center for Systems Biology.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
TyptoneResearch Products Intl. Corp.T60060-1000.0
Yeast extractResearch Products Intl. Corp.Y20020-500.0
Sodium chlorideFisher ScientificBP358-212
Potassium chlorideSigma-AldrichP9333-500G
Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506-500G
AgarFisher ScientificBP1423-500
Tetracycline hydrochlorideSigma-AldrichT7660-5G
Petri platesCorning351029
MATLAB Mathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/
Oligonucleotide primersIntegrated DNA Technologieshttps://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos25 nmol scale, standard desalting
pBR322_AvrIIavailable upon requestpBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene
pBR322_OP1 – pBR322_OP5available upon requestfive modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites
Q5 high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0491Lincludes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer)
15 ml conical tubeCorning430025
Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus)Eppendorf
PCR plate, 96 wellFisher Scientific14230232
96 well plate sealExcel ScientificF-96-100
Veriti 96-well thermal cyclerApplied Biosystems4375786
6x gel loading dyeNew England BiolabsB7024S
AgaroseResearch Products Intl. Corp.20090-500.0
Ethidium bromideBio-Rad161-0433
UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech)Fotodyne Inc.http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB bufferQiagen19086
96-well black-walled, clear bottom assay platesCorning3651
Lambda phage DNANew England BiolabsN3011S
PicoGreen dsDNA reagentInvitrogenP7581dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4
Victor 3 V microplate readerPerkinElmer
DNA purification kitZymo ResearchD4003
Microcentrifuge tubesCorning3621
Long-wavelength UV illuminatorFisher ScientificFBUVLS-80
Agarose gel DNA extraction bufferZymo ResearchD4001-1-100
AatIINew England BiolabsR0117S
AvrIINew England BiolabsR0174L
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202S
EVB100 electrocompetent E. coliAvidityEVB100
Electroporator (E. coli Pulser)Bio-Rad1652102
Electroporation cuvettesBio-Rad165-2089
Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro)Amersham Biosciences80211237
50 ml conical tubesCorning430828
Plasmid purification kitMacherey-Nagel740588.25
8 well PCR strip tubesAxygen321-10-551
Qubit dsDNA HS assay kitInvitrogenQ32854dsDNA quantitation reagent
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
Qubit fluorometerInvitrogenQ32866
Ampicillin sodium saltAkron Biotechnology50824296
MiSeq reagent kit v2 (500 cycles)IlluminaMS-102-2003
MiSeq desktop sequencerIlluminahttp://www.illumina.com/systems/miseq.htmlalternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform
FLASh softwareJohn Hopkins University - open sourcehttp://ccb.jhu.edu/software/FLASH/software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data
AatII_FGATAATAATGGTTTCTTAGACG
TCAGGTGGC
AvrII_RCTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT
TAAAAATGAAG
AvrII_FCTTCATTTTTAATTTAAAAGGA
CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_RACCTGACGTCCGTATTTCAAC
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_RACCTGACGTCCGCTCACGGA
GTGTACTAATTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_RACCTGACGTCGTACGTCTGA
ACTTGGGACTTAAGAAACCA
TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_RACCTGACGTCCCGTTCTCGAT
ACCAAGTGATAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_RACCTGACGTCGTCCGTCGGA
GTAACAATCTTAAGAAACCAT
TATTATCATGACATTAAC
OP1_FGACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_RCGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_FATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_RAGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_FAGTCCCAAGTTCAGACGTAC
OP3_RGAAAAGTCCCAATGAGTGCC
OP4_FTCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_RTATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_FAGATTGTTACTCCGACGGAC
OP5_RTATAACAGGCTGCTGAGACC
Group1_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC
Group2_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC
Group3_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC
AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC
AATGATACCGCGAGACCC
Group5_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG
GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACTATAGCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
502_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACATAGAGGCACA
CTCTTTCCCTACACGAC
503_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACCCTATCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
504_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACGGCTCTGAACA
CTCTTTCCCTACACGAC
505_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACAGGCGAAGACA
CTCTTTCCCTACACGAC
701_RCAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATCGAGTAATGTGACTG
GAGTTCAGACGTG
702_RCAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATTCTCCGGAGTGACTG
GAGTTCAGACGTG

Referenzen

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