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Resumen

Se presenta un protocolo para la evaluación funcional de amplias bibliotecas de saturación de un solo sitio de mutagénesis de proteínas utilizando secuenciación de alto rendimiento. Es importante destacar que este enfoque utiliza pares de cebadores para multiplexar ortogonales construcción de la biblioteca y secuenciación. Se proporcionan resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamasa seleccionado en una dosis clínicamente relevante de ampicilina.

Resumen

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 β-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to β-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

Introducción

Mutagénesis mucho tiempo se ha empleado en el laboratorio para estudiar las propiedades de los sistemas biológicos y su evolución, y para producir proteínas o organismos mutantes con funciones mejoradas o novedosas. Mientras que los primeros enfoques se basaban en métodos que producen mutaciones aleatorias en los organismos, el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante permitió a los investigadores para introducir cambios en el ADN de selección de una manera específica de sitio, es decir., Mutagénesis dirigida 1,2. Con las técnicas actuales, típicamente usando oligonucleótidos mutagénicos en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es relativamente fácil para crear y evaluar un número pequeño de mutaciones (por ejemplo., Mutaciones puntuales) en un gen dado 3,4. Es mucho más difícil, sin embargo, cuando los enfoques de la meta, por ejemplo, la creación de mutaciones y la evaluación de todos los posibles en un solo sitio (o de orden superior).

Aunque se ha aprendido mucho desde los primeros estudios que intentan evaluar un gran número de mutations en los genes, las técnicas utilizadas eran a menudo laborioso, por ejemplo, que requiere la evaluación de cada mutación de forma independiente mediante supresor sin sentido cepas 5-7, o estaban limitados en su capacidad cuantitativa debido a la profundidad bajo la secuenciación de Sanger 8 de secuencia. Las técnicas usadas en estos estudios han sido ampliamente suplantado por métodos que utilizan la tecnología de secuenciación de alto rendimiento 9-12. Estos enfoques conceptualmente simple implican la creación de una biblioteca que comprende un gran número de mutaciones, sometiendo la biblioteca a una pantalla o de selección de función, y luego profundo-secuenciación (es decir., Del orden de> 10 6 secuenciación lee) la biblioteca obtenida antes y después de la selección. De esta manera, los fenotípicas o la aptitud efectos de un gran número de mutaciones, representan como el cambio en la frecuencia de la población de cada mutante, puede evaluarse de forma simultánea y más cuantitativamente.

previamente hemos introducido un simp(. es decir, todo-proteína bibliotecas de mutagénesis de saturación) enfoque le para la evaluación de las bibliotecas de todas las posibles mutaciones de un solo aminoácido en las proteínas, aplicable a los genes con una longitud más larga que la secuenciación leer longitud 11,13: En primer lugar, cada posición de aminoácido es aleatorizado por PCR dirigida al sitio mutagénico. Durante este proceso, el gen se divide en grupos compuestos de posiciones contiguas con una longitud total acomodado por la plataforma de secuenciación. Los productos de PCR mutagénicos para cada grupo se combinan entonces, y cada grupo se sometieron independientemente a la selección y secuenciación de alto rendimiento. Al mantener una correspondencia entre la ubicación de las mutaciones en la secuencia y la longitud de lectura de secuenciación, este enfoque tiene la ventaja de maximizar la profundidad de secuenciación: mientras que uno puede simplemente secuenciar tales bibliotecas en ventanas cortas sin división en grupos (por ejemplo, una escopeta estándar. enfoque de secuenciación), la mayoría lee obtenido sería de tipo salvaje y por lo tanto el mayoría de rendimiento secuenciación perdido (por ejemplo, para una biblioteca de mutagénesis de saturación conjunto de proteínas de una proteína de ácido amino 500 secuenciado en 100 aminoácidos (300 pb) ventanas, como mínimo 80% de lee será la secuencia de tipo salvaje).

Aquí, un protocolo se presenta que utiliza secuenciación de alto rendimiento para la evaluación funcional de las bibliotecas de mutagénesis de saturación de toda la proteína, utilizando el enfoque anterior (descrito en la Figura 1). Es importante destacar que, se introduce el uso de cebadores ortogonales en el proceso de clonación de la biblioteca de código de barras de cada grupo de secuencias, lo que les permite ser multiplexadas en una biblioteca, se somete simultáneamente a la detección o la selección y, a continuación multiplexados DE para secuenciación profunda. Dado que los grupos de secuencias no se someten a selección de forma independiente, esto reduce la carga de trabajo y se asegura de que cada mutación experimenta el mismo nivel de selección. TEM-1 β-lactamasa, una enzima que confiere resistencia de alto nivel aantibióticos β-lactámicos (por ejemplo., ampicilina) en bacterias se utiliza como un sistema modelo 14-16. Un protocolo se describe para la evaluación de una biblioteca de mutagénesis de saturación conjunto de proteínas de TEM-1 en E. coli bajo selección en un nivel en suero aproximada para una dosis clínica de ampicilina (50 mg / ml) 17,18.

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Protocolo

Nota: Véase la Figura 1 para el esquema del protocolo. Varios pasos y reactivos en el protocolo requieren medidas de seguridad (indicadas con "PRECAUCIÓN"). Consulte las hojas de datos de seguridad antes de su uso. Todos los pasos del protocolo se llevan a cabo a temperatura ambiente a no ser que otro indicó.

1. Preparar Medios de cultivo y placas

  1. Preparar y esterilizar en autoclave 1 L de agua purificada, 100 ml de Super Broth Optimal (SOB; Tabla 1), 1 caldo L Luria-Bertani (LB; Tabla 2) y 1 L de LB-agar (Tabla 3). Preparar separado y esterilizar tres matraces de cultivo que contienen cada uno 1 L LB.
    Nota: A lo largo del protocolo de "agua" se refiere a autoclave-esterilizada agua purificada; SOB, LB y LB-agar se refieren a las soluciones de autoclave esterilizado.
  2. Preparar una 12 mg de la / ml de Tet disolviendo 0,12 g de hidrocloruro de tetraciclina en 10 ml de 70% de etanol. Esterilizar el uso de un filtro de 0,2 micras y almacenara 4 ° C al abrigo de la luz.
  3. Fresco LB-agar a 50 ° C y luego agregar 1 ml de Tet Stock (concentración final de 12 mg / ml Tet). Verter en placas de Petri y enfriar a temperatura ambiente protegido de la luz. Almacenar a 4 ° C al abrigo de la luz.

2. Construcción del Todo-gen mutagénesis de saturación Biblioteca

Nota: Los cebadores; ITP ha completado, la digestión de restricción y ligaduras; y muestras de ADN purificadas se pueden almacenar a -20 ° C.

  1. El diseño de cebadores de mutagénesis
    1. Para mutar cada posición de aminoácido a todos los aminoácidos posibles, diseñar un par de cebadores de mutagénesis complementarios (sentido / antisentido hacia adelante y / retroceso) para cada posición del aminoácido con las siguientes directrices:
      1. Reemplazar el codón correspondiente al aminoácido que se va a mutagénesis por NNS (donde N es una mezcla de las cuatro bases de nucleótidos y S es una mezcla de citosina (C) y guanina (G)) y el centro en el primer, flanqueado por aproximadamente 15 nucleótidos a cada lado.
      2. Asegúrese de que el 5 'y 3' terminan en C o G y que la temperatura de fusión (T m) es aproximadamente 70 ° C 3. Utilice la secuencia de comandos NNS_PrimerDesign.m computacional (Ver archivo de código complementario) para diseñar cebadores de mutagénesis NNS acuerdo con estas directrices.
    2. cebadores de orden de una fuente comercial. Para facilidad de uso, los han sintetizado en formato de placa de 96 pocillos y se pre-diluido en agua a 50 M, con un conjunto de placas que contienen los cebadores de mutagénesis sentido y otro los cebadores antisentido.
    3. Llene un lavabo pipeta con agua y utilizar una pipeta multicanal para transferir 95 l a 263 pozos en tres placas de 96 pocillos. Diluir los cebadores 20 veces a 2,5 M utilizando una pipeta multicanal para transferir 5 l de las placas de 96 pocillos que contenían los cebadores sentido de mutagénesis a los pocillos afines de las placas que contienen agua.
    4. Repetir2.1.3 Protocolo de paso para diluir los cebadores antisentido de mutagénesis.
  2. Síntesis de NNS sub-bibliotecas para cada posición de aminoácido por PCR de dos etapas de mutagénesis dirigida al sitio
    1. Realizar las PCR mutagénicas de la primera ronda. Para cada cebador de la mutagénesis, preparar una 25 l de reacción de PCR utilizando pBR322_AvrII plásmido como molde y los cebadores AatII_F o AvrII_R (cebadores sentido de mutagénesis con el cebador emparejado AvrII_R, y los cebadores de mutagénesis con el cebador antisentido pares AatII_F; total de 526 PCR). Véase la Tabla de Materiales para las secuencias AatII_F y AvrII_R.
      1. Preparar una PCR "mezcla maestra" mediante la adición de los reactivos de la Tabla 4 a un tubo cónico de 15 ml. Transferencia a una cuenca pipeta. Usar una pipeta multicanal para transferir 15 l a 263 pozos en tres placas de 96 pocillos de PCR. Usar una pipeta multicanal para transferir 10 l de las placas de 96 pocillos que contenían los cebadores sentido de mutagénesis diluidas a los pocillos afines in las placas de PCR.
      2. Cubrir cada placa de PCR con un sello de placa de 96 pocillos. Centrifugar a 200 xg durante 2 min.
      3. La transferencia de las placas de PCR para termociclador y ejecute el siguiente programa: 98 ° C durante 30 segundos; 20 ciclos: 98 ° C durante 10 s, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 1 min; 72 ° C durante 2 min; mantener a 4 ° C.
      4. Repetir los pasos protocolo 2.2.1.1 - 2.2.1.3 de las placas de 96 pocillos que contenían los cebadores de mutagénesis antisentido diluidas.
    2. Realizar las PCR mutagénicos de segunda ronda. Para cada posición de aminoácido, preparar una reacción de PCR de 25 l usando cebadores AatII_F y AvrII_R, y la mezcla y se diluye en la primera ronda de PCR mutagénicos productos como plantilla (un total de 263 PCR).
      1. Llene un lavabo pipeta con agua y utilizar una pipeta multicanal para transferir 198 l a 263 pozos en tres placas de 96 pocillos.
      2. Combinar y diluir 100 veces los productos de PCR mutagénicos para cada posición de aminoácido utilizando una pipeta multicanal paraprimera transferencia de 1 l de las placas de 96 pocillos de PCR que contienen los productos de PCR resultantes de los cebadores de sentido de mutagénesis a los pocillos afines de las placas que contienen agua. A continuación, repita la transferencia de los productos resultantes de la PCR de los cebadores antisentido de mutagénesis.
      3. Preparar una PCR "mezcla maestra" mediante la adición de los reactivos de la Tabla 5 a un tubo cónico de 15 ml. Transferencia a una cuenca pipeta. Usar una pipeta multicanal para transferir 24 l a 263 pozos en tres placas de 96 pocillos de PCR. Usar una pipeta multicanal para transferir 1 l de las placas de 96 pocillos que contienen la mezcla y se diluyó primera ronda productos de PCR mutagénicos a los pocillos afines en las placas de PCR.
      4. Cubrir cada placa de PCR con un sello de placa de 96 pocillos. Se centrifuga a aproximadamente 200 xg durante 2 min. placas de transferencia de termociclador y se ejecutan el mismo programa que en el paso de protocolo 2.2.1.3.
    3. Analizar los resultados de las PCR mutagénicos de segunda ronda por electroforesis en gel.Asegúrese de que todos los productos son del tamaño correcto y ausente de contaminación de los productos.
      1. Añadir 2 ml de 2x colorante de carga de gel a una cuenca pipeta y luego utilizar una pipeta multicanal para transferir 6 l de 263 pozos en tres placas de 96 pocillos. Usar una pipeta multicanal para transferir 6 l de las placas de 96 pocillos de PCR que contienen las segunda ronda productos de PCR mutagénicos a los pocillos afines de las placas de 96 pocillos que contienen colorante.
      2. Preparar un gel de agarosa al 1,5% con 0,2 mg / ml de bromuro de etidio (Precaución).
      3. escalera de ADN de carga en los carriles primero y último de cada fila. A continuación, utilice una pipeta multicanal para cargar 10 l de muestras de la etapa de protocolo 2.2.3.1.
      4. Correr el gel a 100 V durante 40 minutos y la imagen en un transiluminador UV.
      5. Repita los pasos del protocolo 2.2.3.2 - 2.2.3.4 hasta que se analizaron todas las muestras.
    4. Medir con precisión la concentración de cada sub-biblioteca NNS producto de PCR utilizando un reactivo de cuantificación ADN de doble cadena.
      1. Transferiraproximadamente 15 ml de tampón EB a una cuenca pipeta. Utilizar una pipeta multicanal para transferir 49 l de 263 pozos en tres placas de 96 pocillos de paredes negras, fondo claro de ensayo.
      2. Usar una pipeta multicanal para transferir 1 l de cada producto de PCR de segunda etapa (etapa protocolo 2.2.2) a los pocillos afines de las placas de ensayo de 96 pocillos.
      3. Preparar una curva patrón de concentración de ADN mediante la dilución de ADN de fago lambda a 2 ng / l en 300 l de tampón EB y luego hacer diez diluciones de dos veces (para un total de 11 concentraciones). Transferencia de 50 l a primeros once columnas de una fila de una de las placas de ensayo de 96 pocillos procedentes de la etapa anterior que no contiene muestra; a la duodécima columna de añadir 50 l de tampón EB (blanco de reactivo).
      4. Preparar el reactivo de cuantificación ADN de doble cadena mediante la adición de 75 l de reactivo (véase la Tabla de Materiales) a un tubo cónico de 15 ml, a continuación, añadir 15 ml de tampón EB. Mezclar invirtiendo el tubo y luego transferir a una cuenca pipeta. Proteger reactivo de la luz.
      5. Usar una pipeta multicanal para transferir 50 l de reactivo preparado cuantificación dsDNA a cada pocillo de las placas de ensayo. Mezclar pipeteando arriba y hacia abajo. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 5 min protegido de la luz.
      6. Medir la fluorescencia de cada muestra usando un lector de microplacas y longitudes de onda de fluoresceína estándar (excitación 485 nm, emisión 520 nm; 0,1 seg).
      7. Restar el valor de fluorescencia del blanco de reactivos de todas las muestras. Generar una curva estándar a partir de las mediciones de fluorescencia de muestras de fagos lambda. Calcular la concentración de cada muestra usando sus respectivas mediciones de fluorescencia y la curva estándar.
  3. Clonación de NNS sub-bibliotecas en vectores de selección
    1. Mezclar 100 ng de cada sub-biblioteca NNS producto de PCR en cinco subgrupos de biblioteca NNS. Siguiendo las instrucciones del fabricante, limpiar muestras usando un kit de purificación de ADN y luego medir la concentración utilizando un DSreactivo de cuantificación de ADN.
      Nota: Cada grupo se compone de aproximadamente 53 aminoácidos contiguos posiciones espaciadas a lo largo de la secuencia de TEM-1 (grupos NNS sub-biblioteca 1-5 se componen de las posiciones 26-78, 79-132, 133-183, 184-236, y 237-290, respectivamente; numeración de acuerdo con Ambler et al 19)..
    2. Crear vectores de clonación para cada grupo de sub-biblioteca de la SNN.
      1. Preparar cinco ITP 100 l de acuerdo con la Tabla 6, usando cebadores AvrII_F y AatII_OP1_R - AatII_OP5_R, y los plásmidos pBR322_OP1-5 como plantilla (AatII_OP1_R emparejado con pBR322_OP1, etc.).
      2. Traslado al termociclador y ejecute el siguiente programa: 98 ° C durante 30 segundos; 25 ciclos: 98 ° C durante 10 s, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 1,5 min; 72 ° C durante 2 min; mantener a 4 ° C. Ver T capaces de materiales para las secuencias de AatII_R y AvrII_F.
      3. Preparar un gel de agarosa al 1% con 0,2 mg / ml de bromuro de etidio (Precaución).
      4. Añadir 20 l de colorante de carga 6x gel a cada muestra de PCR. Cargar el primer carril del gel con escalera de ADN; cargar todo el volumen de cada muestra, saltando al menos un pozo entre las muestras.
      5. gel a 100 V una duración de 50 min.
      6. Visualizar en gel usando un iluminador UV de longitud de onda larga (PRECAUCIÓN). rodajas de impuestos especiales que contienen el producto de PCR en ~ 3500 pb; transferir para separar tubos de microcentrífuga. cortes de gel se pueden almacenar a -20 ° C.
      7. Siguiendo las instrucciones del fabricante, purificar muestras usando un kit de extracción de gel y la concentración medida usando un reactivo de cuantificación ADN de doble cadena.
    3. Tanto para los grupos NNS sub-biblioteca (paso protocolo 2.3.1) y vectores de clonación (paso protocolo 2.3.2), creado restricción digiere con enzimas AatII y AvrII acuerdo con la T abla 7. Se incuba a 37 ° C durante 1 hora. Siguiendo las instrucciones del fabricante, limpiar muestras usando un kit de purificación de ADN y luego medir la concentración de ADN de doble cadena usando un quantitareactivo ción.
    4. Establecieron reacciones de ligación siguiente Tabla 8 para cada grupo de sub-biblioteca digerido por restricción con NNS afín digerido por restricción vector de clonación (NNS grupo de sub-biblioteca con 1 pBR322_OP1, etc.). Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. Limpiar las reacciones utilizando un kit de purificación de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante; eluir el ADN con 20 l de agua.
    5. Transformar la totalidad de las reacciones de ligación purificados en la biblioteca de eficiencia E. células de E. coli por electroporación.
      1. Descongelar E. electrocompetentes coli células y luego las células de lugar y reacciones de ligación se purificó sobre hielo.
      2. Transferencia de 10 l descongelan las células a cada reacción de ligación purificada y luego se transfieren a la cubeta de electroporación. Electroporate en el 1,8 kV.
      3. Recuperar las células mediante resuspensión en 1 ml de SOB. Se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
      4. Resuspender 10 l de cada cultura recuperación de 990 l LB; extendido 100 l de LB-agar containing 12 mg / ml Tet. Incubar las placas O / N (~ 16 horas) a 37 ° C.
      5. Para cada cultivo recuperación, preparar un frasco de cultivo de 250 ml con 50 ml de LB y 50 l Tet de valores. Transferir al matraz los restantes ~ 1 ml de cultivo de recuperación. Incubar O / N (~ 16 h) a 37 ° C con agitación vigorosa (~ 200 rpm).
    6. Contar el número de colonias en cada placa. Calcular el número de transformantes exitosos como figure-protocol-13864 , dónde figure-protocol-13940 es el número de colonias, figure-protocol-14034 es el volumen de cultivo de recuperación (1,000 l) y figure-protocol-14155 es el volumen de la cultura recuperación plateado (1 l).
      Nota: Para asegurar una cobertura completa de todas las mutaciones, como regla general, el número de transformantes exitosos debe ser ≥100 veces más que el número de mutaciones esperadas. Cada sub-biblioteca NNS tiene ~ 53 posiciones, por lo que el número esperado de mutaciones es de 53 × 32 posiciones de codones / posición ≈ 1,7 × 10 3; para dar un tamaño de la biblioteca ≥100 veces (≥1.7 × 10 5) no debe haber ≥170 colonias en cada placa.
    7. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, aislar ADN de plásmido a partir de cultivos usando un kit de purificación de plásmido y luego medir las concentraciones usando un reactivo de cuantificación dsDNA. Mezcle 100 ng de cada plásmido. Esto crea la biblioteca de mutagénesis de saturación de todo el final de proteína.

3. Selección del Todo-proteína TEM-1 Mutagénesis de saturación Biblioteca de resistencia a los antibióticos

  1. Preparación de la cultura pre-selección.
    1. Diluir el plásmido de la etapa protocolo 2.3.7 a 0.5 ng / l en el agua y la transferencia de 20 l a un tubo de microcentrífuga. Realizar la transformación, redescubrimiento, chapado y O / N de crecimiento como se describe anteriormente en el paso de protocolo 2.3.5, a excepción de transferencia de 1 l de la cultura recuperación SOB a 999 l LB.
    2. Contar el número de colonias. Para asegurar una cobertura completa de todas las mutaciones no debe haber ≥ 100 colonias, lo que indica ≥ 10 6 transformantes exitosos (100 × 263 × 32 posiciones de codones / posición ≈ 10 6).
    3. Medir la concentración de la cultura / N 50 ml O.
      1. Preparar un blanco LB mediante la adición de 1 ml de LB a una cubeta de espectrofotómetro. Medir OD600 en un espectrofotómetro.
      2. Se diluye la S / N de cultivo de 10 veces por resuspensión en 100 l 900 l LB. Medir la DO600. Restar la lectura DO600 de la pieza en bruto y se multiplica por 10 para dar la DO600 del cultivo O / N.
    4. Pre-calentar los tres frascos de cultivo de la etapa de protocolo 1.1 para ~ 30 min a 37 ° C. Diluir la cultura O / N a DO600 = 0,1 y se añade 1 ml a un matraz (OD600 final = 0,001). Tla suya es la "cultura de preselección".
    5. Incubar la "cultura pre-selección" a 37 ° C con agitación vigorosa (200 rpm). Periódicamente controlar el crecimiento mediante la medición de DO600 como en el paso protocolo 3.1.3 (no es necesario diluir la cultura 10 veces) hasta OD600 = 0,1 (~ 2,5 h).
    6. Transferir 100 ml del cultivo de pre-selección a dos tubos de 50 ml cónicos. Se centrifuga a 4.000 g durante 6 min a 4 ° C. Eliminar la mayor parte de sobrenadante y se combinan en un solo tubo cónico de 15. Repita centrifugación y eliminar todo el sobrenadante. Almacenar a -20 ° C.
  2. La selección para resistencia a la ampicilina.
    1. Mientras que la cultura pre-selección está incubando, preparar una 50 mg / ml de stock de Amp en agua por disolución de 0,5 g de ampicilina de sodio en 10 ml de agua. Esterilizar utilizando un filtro y tienda de 0,2 micras a 4 ° C.
    2. Para los otros dos matraces, añadir Tet a una concentración final de 12 mg / ml y un volumen de la pre-selección de cultivo tales tha t el OD600 final = 0,001. A un matraz, añadir 1 ml de amplificador, para una concentración final de 50 mg / ml - esta es la "cultura de la selección".
    3. Incubar los cultivos a 37 ° C con agitación vigorosa (200 rpm). Monitor de crecimiento del cultivo para el que no se añadió la ampicilina en el paso anterior, hasta OD600 = 0,1 (~ 2,5 h). En este momento, también medir la DO600 del cultivo de selección.
    4. Divida la DO600 del cultivo selección en 0,1 y se multiplica por 100 ml. Transferir este volumen (~ 400 ml) a 50 ml tubos cónicos y se centrifuga a 4.000 g durante 6 min a 4 ° C. Eliminar la mayor parte de sobrenadante y se combinan en un solo tubo cónico de 15. Repita centrifugación y eliminar todo el sobrenadante.
    5. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, aislar ADN plasmídico a partir de la pre-selección (paso protocolo 3.1.6) y la selección (paso protocolo 3.2.4) sedimentos de células de cultivo y luego medir las concentraciones usando un reactivo de cuantificación dsDNA.
tle "> 4. La secuenciación de alto rendimiento para determinar los efectos en la eficacia de las mutaciones

  1. Preparación de muestras para secuenciación de alto rendimiento
    1. Preparar 25 l PCR para demultiplexar los grupos NNS sub-biblioteca con cebadores ortogonales
      1. Prepare una mezcla maestra de PCR de acuerdo con la Tabla 9; transferir 23 l a diez tubos de PCR.
      2. Añadir 1 l de 0,5 ng de ADN plásmido / l purificado a partir del cultivo de preselección a la PCR tubos 1 - 5 y de la cultura de la selección a los tubos 6 - 10.
      3. Mezclar 50 l de 50 mM adelante cebadores ortogonales OP1_F - OP5_F con los respectivos cebadores inverso ortogonales OP1_R - OP5_R. En el mismo orden, la transferencia de 1 l a tubos de PCR 1 - 5 y 6 - 10. Véase la Tabla de Materiales para las secuencias de OP1_F - OP5_F y OP1_R - OP5_R.
      4. Transferir los tubos de PCR para termociclador. Ejecute el siguiente programa: 98 ° C durante 30 segundos; 20 ciclos: 98 ° C durante 10 s, 55 °; C durante 20 s, 72 ° C durante 1,5 min; 72 ° C durante 2 min; mantener a 4 ° C.
    2. Preparar 25 l PCR para aislar cada uno de los grupos sub-biblioteca NNS
      1. Diluir 100 veces las PCRs diez de la etapa 4.1.1.4 protocolo mediante la transferencia de 1 l de cada para separar los tubos de PCR y la adición de 99 l de agua. Mezcla, a continuación de la pipeta de 99 l y desechar.
      2. Mezclar 50 l de 50 mM cebadores directos Group1_F - Group5_F con los respectivos cebadores Group1_R inversa - Group5_R. En el mismo orden, de transferencia de 1 l de PCR tubos 1 - 5 y 6 - 10. Véase la Tabla de Materiales para las secuencias de Group1_F - Group5_F y Group1_R - Group5_R.
      3. Prepare una mezcla maestra de PCR de acuerdo con la Tabla 9, la transferencia de 23 l a cada tubo de PCR. Transferir los tubos de PCR para termociclador; ejecutar el mismo programa que en el paso de protocolo 2.2.1.3.
    3. Llevar a cabo los últimos 25 l PCR para agregar secuencias de indexación
      1. dilaúd 100 veces las PCR diez de la etapa 4.1.2.3 protocolo mediante la transferencia de 1 l de cada una de separar los tubos de PCR y la adición de 99 l de agua. Mezcla, a continuación de la pipeta de 99 l y desechar.
      2. Prepare una mezcla maestra de PCR de acuerdo con la Tabla 9, la transferencia de 23 l a cada tubo de PCR.
      3. Para los tubos con la plantilla procedentes de grupos sub-biblioteca NNS 1-5, transferir 0,5 l por tubo cebadores directos 501_F - 505_F respectivamente. Para tubos con la plantilla resultante de la preselección y selección culturas, transferir 0,5 l por tubo de cebadores 701_R y 702_R inversa, respectivamente. Véase la Tabla de Materiales para las secuencias de 501_F - 505_F, y 701_R y 702_R.
      4. Transferir los tubos de PCR para el termociclador y ejecute el programa desde el paso 2.2.1.3.
    4. Mezclar y purificar las muestras
      1. medir concentraciones usando un reactivo de cuantificación de ADNds de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezclar 100 ng de cada producto de PCR intOA solo tubo de microcentrífuga.
      2. Preparar un gel de agarosa al 2% con 0,2 mg / ml de bromuro de etidio (Precaución).
      3. Añadir colorante de carga de gel 6x para los productos de PCR muestra mixta. Cargar el primer carril del gel con escalera de ADN; cargar todo el volumen de la muestra.
      4. gel a 100 V una duración de 50 min. Visualizar en gel usando un iluminador UV de longitud de onda larga (PRECAUCIÓN). rebanada de Impuestos Especiales que contiene el producto de PCR en ~ 360 pb; transferir a microcentrífuga tubo. rebanada de gel se puede almacenar a -20 ° C.
      5. Siguiendo las instrucciones del fabricante, purificar muestra usando un kit de extracción de gel y medir la concentración utilizando un reactivo de cuantificación ADN de doble cadena. Esta es la muestra final para la secuenciación de alto rendimiento.
    5. Secuencia en una plataforma de secuenciación de alto rendimiento (véase la Tabla de Materiales para la plataforma utilizados en este protocolo).
      1. Calcular la concentración de la muestra en nM como figure-protocol-22998, Donde figure-protocol-23072 es la concentración de la muestra en ng / l y figure-protocol-23186 es la longitud de la secuencia de la muestra de ADN (~ 360 pb). Diluir la muestra a 4 nM en tampón EB.
      2. Siga las instrucciones del fabricante para desnaturalizar la muestra y diluir a 9 pm en tampón de hibridación.
      3. Carga de 600 l de muestra en el cartucho de reactivo. Secuencia siguiendo las instrucciones del fabricante y las instrucciones que aparecen en pantalla.
  2. Análisis de los datos de secuenciación
    1. Descargar Flash (ajuste rápido Longitud de corto lee) 20, coloque en la carpeta junto con los archivos fastq.gz obtenidos a partir de la secuenciación.
    2. El uso de Flash para unirse a los archivos fastq.gz correspondientes a la gama emparejado lee para cada par de índices (directa e inversa lee para cada grupo de sub-biblioteca NNS para la preselección y selección de cultivos).
      1. Abra Símbolo del sistema y cambie el directorio a la carpeta en el paso de protocolo 4.2.1. Une cada par de lecturas con el comando: inflamación , donde mates1.fastq.gz y mates2.fastq.gz son los archivos que contienen el avance y retroceso lee, respectivamente.
    3. Después de unirse a cada par de lecturas, colocar el archivo de salida out.extendedFrags.fastq en carpetas separadas para los resultados de la preselección o selección culturas. Cambie el nombre del archivo de salida out.extendedFrags.fastq según el grupo sub-biblioteca NNS a la que corresponde (es decir., 1.fastq, 2.fastq, etc.).
    4. Ejecutar la secuencia de comandos NNS_DataAnalyzer.m computacional (Ver archivo de código complementario) de cada carpeta para calcular los recuentos para cada mutación de un solo aminoácido, y los recuentos de los de tipo silvestre, para cada grupo de sub-biblioteca de la SNN.
    5. Calcular el efecto de la aptitud figure-protocol-25137 de cada mutación figure-protocol-25222 en cada posición figure-protocol-25318 como la base diez logaritmo de la relación de los recuentos obtenidos en la selección ( figure-protocol-25476 ) Frente a la pre-selección ( figure-protocol-25576 ) Condición, en relación con la de tipo salvaje:
      figure-protocol-25701 .

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Resultados

El mapa del plásmido para los cinco plásmidos pBR322 modificados que contienen sitios de cebado ortogonales (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) se muestra en la Figura 2A. Para probar si los cebadores ortogonales son específicos, se realizaron PCRs utilizando todos los pares de cebadores ortogonales individualmente, junto con los cinco plásmidos pBR322_OP1-5, o con todos los plásmidos menos el plásmido que coincida con el par de cebadores ortogonal. El producto se obtuvo cor...

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Discusión

Aquí un protocolo se describe para la realización de la evaluación funcional de las bibliotecas de mutagénesis de saturación de toda la proteína, utilizando la tecnología de secuenciación de alto rendimiento. Un aspecto importante del método es la utilización de cebadores ortogonales durante el proceso de clonación. En pocas palabras, cada posición de aminoácido es al azar por PCR mutagénico, y se mezclaron conjuntamente en grupos de posiciones cuya secuencia de longitud combinada se aloja por secuenciaci?...

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Divulgaciones

The authors declare they have no competing financial interests

Agradecimientos

R.R. acknowledges support from the National Institutes of Health (RO1EY018720-05), the Robert A. Welch Foundation (I-1366), and the Green Center for Systems Biology.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
TyptoneResearch Products Intl. Corp.T60060-1000.0
Yeast extractResearch Products Intl. Corp.Y20020-500.0
Sodium chlorideFisher ScientificBP358-212
Potassium chlorideSigma-AldrichP9333-500G
Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506-500G
AgarFisher ScientificBP1423-500
Tetracycline hydrochlorideSigma-AldrichT7660-5G
Petri platesCorning351029
MATLAB Mathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/
Oligonucleotide primersIntegrated DNA Technologieshttps://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos25 nmol scale, standard desalting
pBR322_AvrIIavailable upon requestpBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene
pBR322_OP1 – pBR322_OP5available upon requestfive modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites
Q5 high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0491Lincludes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer)
15 ml conical tubeCorning430025
Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus)Eppendorf
PCR plate, 96 wellFisher Scientific14230232
96 well plate sealExcel ScientificF-96-100
Veriti 96-well thermal cyclerApplied Biosystems4375786
6x gel loading dyeNew England BiolabsB7024S
AgaroseResearch Products Intl. Corp.20090-500.0
Ethidium bromideBio-Rad161-0433
UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech)Fotodyne Inc.http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB bufferQiagen19086
96-well black-walled, clear bottom assay platesCorning3651
Lambda phage DNANew England BiolabsN3011S
PicoGreen dsDNA reagentInvitrogenP7581dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4
Victor 3 V microplate readerPerkinElmer
DNA purification kitZymo ResearchD4003
Microcentrifuge tubesCorning3621
Long-wavelength UV illuminatorFisher ScientificFBUVLS-80
Agarose gel DNA extraction bufferZymo ResearchD4001-1-100
AatIINew England BiolabsR0117S
AvrIINew England BiolabsR0174L
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202S
EVB100 electrocompetent E. coliAvidityEVB100
Electroporator (E. coli Pulser)Bio-Rad1652102
Electroporation cuvettesBio-Rad165-2089
Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro)Amersham Biosciences80211237
50 ml conical tubesCorning430828
Plasmid purification kitMacherey-Nagel740588.25
8 well PCR strip tubesAxygen321-10-551
Qubit dsDNA HS assay kitInvitrogenQ32854dsDNA quantitation reagent
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
Qubit fluorometerInvitrogenQ32866
Ampicillin sodium saltAkron Biotechnology50824296
MiSeq reagent kit v2 (500 cycles)IlluminaMS-102-2003
MiSeq desktop sequencerIlluminahttp://www.illumina.com/systems/miseq.htmlalternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform
FLASh softwareJohn Hopkins University - open sourcehttp://ccb.jhu.edu/software/FLASH/software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data
AatII_FGATAATAATGGTTTCTTAGACG
TCAGGTGGC
AvrII_RCTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT
TAAAAATGAAG
AvrII_FCTTCATTTTTAATTTAAAAGGA
CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_RACCTGACGTCCGTATTTCAAC
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_RACCTGACGTCCGCTCACGGA
GTGTACTAATTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_RACCTGACGTCGTACGTCTGA
ACTTGGGACTTAAGAAACCA
TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_RACCTGACGTCCCGTTCTCGAT
ACCAAGTGATAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_RACCTGACGTCGTCCGTCGGA
GTAACAATCTTAAGAAACCAT
TATTATCATGACATTAAC
OP1_FGACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_RCGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_FATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_RAGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_FAGTCCCAAGTTCAGACGTAC
OP3_RGAAAAGTCCCAATGAGTGCC
OP4_FTCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_RTATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_FAGATTGTTACTCCGACGGAC
OP5_RTATAACAGGCTGCTGAGACC
Group1_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC
Group2_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC
Group3_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC
AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC
AATGATACCGCGAGACCC
Group5_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG
GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACTATAGCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
502_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACATAGAGGCACA
CTCTTTCCCTACACGAC
503_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACCCTATCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
504_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACGGCTCTGAACA
CTCTTTCCCTACACGAC
505_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACAGGCGAAGACA
CTCTTTCCCTACACGAC
701_RCAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATCGAGTAATGTGACTG
GAGTTCAGACGTG
702_RCAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATTCTCCGGAGTGACTG
GAGTTCAGACGTG

Referencias

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