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摘要

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

摘要

体外过继转移扩大了自体肿瘤浸润淋巴细胞（肿瘤浸润淋巴细胞）可以调节的转移性黑色素瘤患者显著的子集耐用和完整的答复。这种方法的主要障碍是转移的T细胞，引起端粒缩短的可行性减少的，并且从患者获得的肿瘤浸润淋巴细胞的数量有限。分化少T细胞端粒长就过继性T细胞治疗的理想T细胞亚群;然而，产生大量的这些分化较少的T细胞是有问题的。过继性T细胞疗法的这种限制可以通过使用诱导多能干细胞（iPS细胞）在理论上克服自我更新，维持多能性，具有细长的端粒，并提供自体T细胞的免疫治疗的一个无限源。在这里，我们提出了一个协议，以产生使用仙台病毒载体的重编程因子转导入肿瘤浸润淋巴细胞iPS细胞。该协议产生S完全重新编程，免费矢量克隆。这些TIL衍生的iPSC可能能够产生用于过继性T细胞疗法分化少患者 - 和肿瘤特异性T细胞。

引言

细胞重新编程的技术，通过一组已定义的转录因子的过表达允许产生诱导性多能干细胞（iPS细胞）的保持在基于细胞的疗法1,2-领域大有希望。这些iPS细胞表现出转录和后生特征和具有自我更新和多能性的能力，类似于胚胎干细胞（ESC）3-5。在重编程技术在过去十年取得了显着的进步，使我们能够产生甚至从终末分化细胞，如T细胞6-8人的iPS细胞。 T细胞来源的iPS细胞（TiPSCs）保留的T细胞受体（TCR）链基因作为原始T细胞相同的重排结构，它允许从TiPSCs 9-11抗原特异性T细胞的再生。

近80％的黑色素瘤浸润淋巴细胞（的TIL）中获得来自病人的肿瘤特异性识别肿瘤相关抗原的ND保持对原有的肿瘤细胞杀伤12。值得注意的是，在的TIL细胞程序性死亡蛋白-1（PD-1）的表达被发现以识别自体肿瘤反应性的剧目，包括突变的特定新抗原-CD8 +淋巴细胞13。在组合离体扩增的自体肿瘤浸润淋巴细胞的过继转移用制备lymphodepleting方案和白细胞介素-2（IL-2）的全身给药会引起患者14亚转移性黑素瘤的实质性退化。尽管取得了令人鼓舞的临床前模型和患者中的结果，注入的T细胞的存活差和免疫抑制途径的存在似乎妥协过继性T细胞疗法的潜能。目前临床协议需要自体T细胞的广泛离体操作，以便获得大的数字。这导致具有不良存活终末分化的T细胞，降低海峡的产生iferative容量，以及高含量的PD-1 15。

继T细胞疗法的这种限制可以通过使用iPS细胞，可以提供自体T细胞免疫治疗无限源理论上克服。我们最近已报道黑素瘤的TIL的表达由仙台病毒（SeV载体）的四个转录因子介导的转导，OCT3 / 4，SOX2，KLF4和c-Myc的16个高层次的PD-1的重编程。虽然逆转录病毒载体需要整合到宿主染色体以表达重编程基因，SeV载体是非整合并最终被从细胞质淘汰。重新编程的效率是与SeV的系统高得多慢病毒或逆转录病毒载体6-8相比。此外，SeV载体能特异性重新编程在外周血单核细胞（PBMC）的T细胞，而通过慢病毒或逆转录病毒载体产生的一些的iPSC克隆可从非淋巴谱系6-8。在这里，我们详细介绍实施了人体黑素瘤的TIL的分离和活化和用于使用的SeV重新编程系统的TIL衍生的iPSC的生成的程序。

研究方案

注:患者应知情同意参加机构审查委员会和人类多能干细胞委员会批准研究。

1.分离肿瘤浸润淋巴细胞培养

  1. 获得不需要从病理学服务/组织采购芯病理诊断肿瘤材料。放置20-100克肿瘤标本，在50毫升试管用30ml肿瘤收集培养基（ 表1）。
  2. 解剖坚实牢固，使用剪刀脆弱和/或血性坏死区肿瘤标本的正常组织。去除坏死组织后，用剪刀把剁碎的样本尽可能小。
  3. 解离切碎样品成单细胞悬浮液使用根据制造商的说明一个离解和肿瘤的离解试剂盒（人）。过滤该悬浮液与被在50毫升管设置一个70微米的细胞过滤并用洗涤过滤器2次2毫升RPMI 1640。
  4. 在200 xg离心离心在室温下5分钟。弃上清，重悬细胞在10ml的T细胞培养基（ 表1）。
  5. 制备的两步梯度溶液如聚蔗糖（梯度溶液）在50毫升的管中，用10毫升100％梯度溶液低级步骤和用Dulbecco磷酸盐稀释30毫升的75％梯度溶液的中间步骤缓冲盐水，无钙，无镁（D-PBS（ - ））。
  6. 层细胞悬浮液（来自步骤1.4）的梯度溶液（来自步骤1.5）。离心在20°C 400 XG 45分钟。
  7. 收集含富集的TIL在100％梯度溶液和在50毫升的管中的75％的梯度溶液之间的界面层。通过加入20-30毫升的D-PBS中稀释的富集的TIL溶液的层（ - ）。
  8. 在200 xg离心离心在室温下5分钟。弃上清，悬浮TIL浓缩部分在10毫升T细胞介质。
  9. 培养馏分（来自步骤1.8）与2ml的T细胞培养基和6000单位/ ml重组人（rh的），IL-2在一个6孔板，在37℃，5％ 的 CO 2。
  10. 更改一半的媒体第5天的文化开始后，此后每2-3天。
  11. 分裂细胞以1:2的比例没有胰蛋白酶消化后轻轻悬浮，达到80-90％汇合时加倍井的数量。添加新鲜T细胞培养基和重组人IL-2的一半体积（1毫升）中的6000国际单位/毫升。

2.丝裂霉素C处理的SNL饲养细胞板的制作

  1. 达到在0.1％明胶包被的10cm皿10毫升SNL饲养细胞培养基（ 表1）的直至80-90％汇合（3-4×10 6细胞）培养SNL饲养细胞。
  2. 添加310微升的0.4毫克/毫升丝裂霉素C溶液直接进入SNL饲养细胞培养皿，并在37℃，5％CO 2的2小时和15分钟孵育。吸媒体一次用5毫升的D-PBS洗涤细胞两次（ - ）。
  3. 加入0.5毫升0.25％胰蛋白酶/ 1mM EDTA中并在室温下孵育1分钟以解离细胞。添加4.5毫升SNL饲养细胞培养基中，以中和重新悬浮细胞成一个单一的悬浮液中。
  4. 转移细胞入15ml管中并离心，在200×g离心5分钟。吸出介质并在10ml SNL饲养细胞培养基的再悬浮后计数与血球细胞。
  5. 板每SNL饲养细胞的孔1.5×10 6个细胞于10cm培养皿，在37℃下孵育，5％ 的 CO 2。使用3天之内的SNL饲养细胞。

3.使用iPS细胞的仙台病毒的产生（SEV）的矢量

  1. 收获肿瘤浸润淋巴细胞（来自步骤1.11），并激活的TIL的5×10 5个细胞与板结合的小鼠抗人CD3（1微克/毫升）和可溶性小鼠抗人CD28（5微克/毫升），用重组人IL-2在一个6孔板（6000国际单位/毫升）在2毫升的T细胞培养基中的37℃，5％CO 2的5天。
  2. 收获肿瘤浸润淋巴细胞（来自步骤3.1）使用移液管在一个15毫升管和计数与血球细胞数。
  3. 激活的TIL与板结合的小鼠抗人CD3（1微克/ ml）的1×10 5个细胞和可溶性小鼠抗人CD28（5微克/毫升），其中的rhIL-2（60单位/毫升）的500微升每孔重新编程介质（ 表1）在一个24孔板在37℃，24小时，5％CO 2。准备3孔为SeV载体感染:OCT3 / 4，SOX2，KLF4和c-MYC（1孔）; SeV载体感染（GFP:绿色荧光蛋白）（1井）;和细胞计数（1孔）。
  4. 24小时后（从步骤3.3），计数与血球细胞数量和确定每个病毒感染的各个（3-20）多重性（MOI）的体积。从-80℃贮存取出一组仙台病毒载体管。迅速解冻SeV载体在水浴（37℃），将它们放在冰上。
    病毒的体积（微升）= MOI（CIU /细胞）细胞的x个病毒/滴度（CIU /毫升）×10-3（微升/毫升）
  5. 通过加入SeV载体的混合物在10-20的MOI添加的每个单独地进行OCT3 / 4，SOX2，KLF4和c-Myc的四个仙台病毒载体管的计算出的卷到媒体，包括活化的TIL。
  6. 为了确定转导效率，添加的SeV-GFP的计算的体积成活化的TIL的阱。
  7. 放置盘（来自步骤3.5和步骤3.6）在培养箱中在37℃，5％CO 2的24小时。 24小时后，估计使用荧光显微镜下感染的SeV-GFP的TIL感染效率。
  8. 收集在15ml试管中的细胞（来自步骤3.5）。在200 xg离心离心在室温下5分钟。
  9. 弃上清，悬浮颗粒在0.5与灵长类ES细胞培养基和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，4纳克/毫升）胚胎干细胞媒体毫升。
  10. 转移悬浮液到一个10cm皿该CONTA插件丝裂霉素C处理的SNL饲养细胞在10毫升人类胚胎干细胞媒体。更改胚胎干细胞媒体隔日，直到菌落生长。
  11. 约18天到21，在净化台使用10微升末端除去在显微镜下菌落周围的SNL饲养细胞。
  12. 使用10微升尖端刮落，并用200微升尖成每96孔培养板的孔100微升iPS细胞介质的转让。吸管上下在2-3次打破菌落成小团块具有50-100微米的平均尺寸。
  13. 转移小块到6孔组织培养板用丝裂霉素C处理的SNL饲养细胞（来自步骤2）在2毫升每iPSCs的媒体以及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，4纳克/毫升）。每天换iPSCs的媒体。
  14. 用1mg / ml胶原酶IV传送的iPSC到6孔组织培养板中的新鲜丝裂霉素C处理的SNL饲养细胞每5-6天。每次准备每个克隆的与免疫的板2口井ostaining。
  15. 由多潜能标志物（SSEA3，SSEA4，TRA-1-60，TRA-1-81，和OCT3 / 4）1的免疫组织化学染色测定各克隆的完整重新编程。
    注:多能性潜力的进一步评估，确认完全重新编程iPSC系可以由胚体的形成和分化测定或畸胎瘤形成分析16分化成三个胚层。
  16. 确认完全重新编程iPSC系通过展示细胞遗传学分析正常核型。
  17. 畸胎瘤的形成，注入未分化的TIL衍生的iPSC（1×10 6）悬浮在100μl含有10％FCS入6-8周龄雌性NOD / SCID小鼠的皮下组织的DMEM。染色畸胎瘤切片行HE。

4.为iPS细胞SSEA3，SSEA4，TRA1-60和TRA1-81免疫荧光染色

  1. 洗的iPSC用1毫升的PBS并用1ml 4％每年的固定iPSCs的10分钟raformaldehyde溶液。去除4％多聚甲醛溶液，并用1毫升的PBS洗涤3次的iPSCs的。
    注:使用多聚甲醛的时候，因为它是有毒的注意。
  2. 预处理用30分钟封闭缓冲液（ 表1）的iPSC。同时，稀释用PBS的TritonX稀释第一抗体（大鼠抗人SSEA3，小鼠抗人SSEA4，小鼠抗人TRA1-60和小鼠抗人TRA1-81）1:50 1.5％山羊血清溶液-100（总体积:1ml）中。
  3. 除去封闭缓冲液（ 见表1）。添加稀释的初级抗体溶液孵育在室温下1小时。同时，稀释的第二抗体（抗小鼠IgG和IgM或抗大鼠IgM）1:50 1.5％山羊血清溶液。
  4. 除去稀释的初级抗体溶液，并用1毫升的PBS 3次，每次洗的iPSC 5分钟。添加稀释的二级抗体溶液孵育在室温下在暗室中45分钟。
  5. 除去稀释二级抗体溶液并用1ml的PBS中的3次，每次洗的iPSC 5分钟。观察与免疫荧光显微镜的iPS细胞。

5. iPS细胞的免疫荧光染色进行的Oct3 / 4

  1. 洗的iPSC用1毫升的PBS并用1ml的4％低聚甲醛溶液中10分钟固定的iPSC。去除4％多聚甲醛溶液，并用PBS洗涤3次的iPSCs的。
  2. 添加透化缓冲液（ 表1）并在室温下孵育10分钟。除去透化缓冲液，并添加封闭缓冲液（ 表1）。
  3. 在室温下孵育30分钟。同时，稀释第一抗体（小鼠抗人的Oct3 / 4）1:50在封闭缓冲液。
  4. 添加稀释的初级抗体溶液中并在4℃孵育过夜。
  5. 除去稀释的初级抗体溶液并用PBS 1ml的洗涤iPSCs的3次，每次5分钟。与此同时，二在封闭缓冲液100:琵琶二次抗体（山羊抗小鼠IgG / IgM抗体）1。
  6. 添加稀释的第二抗体溶液并在黑暗的房间45分钟，在室温下孵育。
  7. 除去稀释次级溶液并用1ml的PBS中的3次，每次洗的iPSC 5分钟。根据观察免疫荧光显微镜的iPS细胞。

结果

图1显示了涉及黑素瘤的TIL与重组人IL-2，这是随后用抗CD3 / CD28激活和OCT3 / 4，KLF4，Sox2和c-Myc的基因转移到的TIL的初始膨胀过程的概要为iPS细胞的产生。通常情况下，对文化的TIL用的rhIL-2开始形成球体培养开始后21-28天。在这一点上，肿瘤浸润淋巴细胞准备用抗CD3激活/ CD28。 图2A示出的TIL，在培养用的rhIL-2在第21天，这是准备与被活化的抗CD3 / CD28。...

讨论

在这里，我们证明了通过四个转录的SeV介导转导重新编程黑素瘤的TIL到的iPSC一个协议因素OCT3 / 4，SOX2，KLF4和c-MYC。这种方法，采用了SeV载体系统重新编程的T细胞，提供了一个非整合方法7的优点。

先前的研究表明，重编程的SeV体系是高效可靠的改编不仅成纤维细胞，而且外周血T细胞7,17。此外，我们最近表明，黑色素瘤的TIL是更加分化和表达更高水平的抑制?...

披露声明

The authors declare that they have no competing financial interests.

致谢

We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
gentle MACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237
gentle MACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
Tumor Dissociation Kit, humanMiltenyi Biotec130-095-929
RPMI 1640Life technologies11875-093
Falcon 70 um Cell StrainerBD352350
BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubesBD352070
IMDMLife technologies12440053
human AB serumLife technologies34005100
L-glutamine (200mM)Life technologies25030-081
2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)Life technologies21985-023
Penicillin-Streptomycin Life technologies15140-122
gentamicinLife technologies15750-060
Ficoll-Paque PLUSGE17-1440-02
D-PBS (-)Life technologies14040-133
recombinant human (rh) IL-2Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3BD555329
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28BD555725
X-VIVO 15Lonza04-418Q
FBSGibco26140-079
HEPESLife technologies15630-080
N-AcetylcysteineCumberland Pharmaceuticals Inc.NDC 66220-207-30
Falcon Tissue Culture Plates (6-well)Corning353046
Falcon Tissue Culture Plates (24-well)Corning353047
Sendai virus vectorDNAVEC
SNL feeder cellsCell Biolabs, IncCBA-316
mitomycin CSIGMAM4287soluble in water (0.5 mg/ml)
gelatinSIGMAG1890
basic fibroblast growth factor (bFGF)Life technologiesPHG0264

参考文献

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