İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Özet

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Özet

Ex vivo Evlatlık transferi metastatik melanom hastalarında önemli alt gruplarında dayanıklı ve tam yanıtlara aracılık edebilir otolog tümör infiltre lenfositleri (TILS) genişletti. Bu yaklaşımın en önemli engeller telomerik kaynaklanan transfer T hücrelerinin, azalmış canlılığı, ve TILS sınırlı sayıda hastadan elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu daha az farklılaşmış T hücrelerinin çok sayıda üretilmesi problemlidir, uzun telomerlerin ile daha az farklılaşmış T hücreleri adoptif T hücresi terapisi için ideal bir T hücresi alt kümesi olabilir. adoptif T hücresi tedavisinin bu sınırlama teorik kullanılarak uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) aşılabilir, kendi kendini yenileme pluripotense, uzamış telomer korumak ve immünoterapi için otolog T hücrelerinin sınırsız bir kaynak sağlar. Burada, TILS içine yeniden programlama faktörleri iletimi için Sendai virüsü vektörleri kullanılarak iPSCs üretmek için bir protokol mevcut. Bu protokol oluşturmakTamamen yeniden programlanması, vektör ücretsiz klonlar s. Bu TIL türetilmiş iPSCs adoptif T hücre tedavisi için daha az farklılaşmış hastaya ve tümör-spesifik T hücrelerini elde etmek mümkün olabilir.

Giriş

Transkripsiyon faktörleri, tanımlanmış bir dizi aşırı ekspresyonu ile uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) üretilmesini sağlar Hücresel yeniden programlama teknolojisi hücre bazlı terapiler ^1,2 alanında büyük ümit vaat etmektedir. Bu iPSCs transkripsiyonel ve epigenetik özelliklerini sergilemek ve benzer embriyonik kök hücreleri (EKH) ^3-5 kendini yenileme ve pluripotensin kapasitesine sahip. Geçtiğimiz on yıl içinde yeniden programlama teknolojisi yapılan kayda değer ilerleme bize bile böyle T hücreleri ^6-8 olarak terminal olarak farklılaşmış hücreler, insan iPSCs oluşturmak için izin verdi. T hücresi-kaynaklı iPSCs (TiPSCs) TiPSCs ^9-11 antijen-spesifik T hücrelerinin yenilenmesini sağlayan özgün T hücreleri gibi T hücresi reseptörü (TCR) zincir genlerinin aynı yeniden düzenlenmiş konfigürasyonunu muhafaza eder.

melanom süzücü limfositlerin yaklaşık% 80 (TILS), bir hastanın tümör spesifik tümör bağlantılı antijenleri tanıyan eldeND, orijinal Kanser hücreleri ¹² karşı sitotoksisite korumak. Özellikle, TILS ile programlanmış hücre ölümü proteini-1 (PD-1) ifadesi mutasyona uğramış neoantijen özgü CD8 ^{+ 13} lenfositlerin dahil olmak üzere, otolog tümör reaktif repertuarı tespit bulunmuştur. Hazırlayıcı lymphodepleting rejimleri ve interlökin-2 (IL-2), sistemik tatbikat ile kombinasyon halinde, ex-vivo genişletilmiş otolog TILS adoptif nakli hastalarında ¹⁴ alt-metastatik melanom büyük gerilemesine neden olabilir. klinik öncesi modellerde ve hastalarda cesaret verici sonuçlar rağmen, yoksul infüzyon T hücrelerinin hayatta kalma ve bağışıklık baskılayıcı yolların varlığı evlatlık T hücre tedavisi tam potansiyelini tehlikeye görünmektedir. Mevcut klinik protokoller sayıda elde edilmesi için otolog T hücrelerinin geniş bir ex vivo işleme gerektirir. Bu sonuç, zayıf yaşam süresine sahiptir terminal olarak farklılaşmış T hücreleri, indirgenmiş Proteinlerin üretimi ile sonuçlanıriferative kapasitesi ve PD-1 ¹⁵ yüksek düzeyde.

adoptif T hücresi tedavisinin Bu sınırlama teorik immünoterapi için otolog T hücrelerinin sınırsız kaynağı sağlayabilir iPSCs kullanılarak aşılabilir. Son zamanlarda Sendai virüsü (sev) dört transkripsiyon faktörlerinin aracılı transdüksiyonu, OKT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc ¹⁶ PD-1 yüksek seviyede ifade eden melanoma TILS yeniden programlamayı bildirmiştir. retrovirüs vektörleri yeniden programlama genleri ifade etmek konak kromozom entegrasyonu gerektiren ederken, SeV vektörleri olmayan entegre ve sonunda sitoplazmaya çıkarılmıştır. Verimliliği yeniden programlanması lentivirüs veya retrovirüs vektörleri ^6-8 ile karşılaştırıldığında SeV sistemi ile çok daha yüksektir. Lentivirüs veya retrovirüs vektörleri tarafından üretilen bazı iPSC klonlar nonlymphoid soy ^6-8 arasında olabilir iken Ayrıca, SeV özel olarak ise, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) T hücreleri yeniden programlamak için. Burada, detayprosedürler insan melanoma TILS izolasyonu ve aktivasyonu için bir SeV yeniden programlama sistemi kullanılarak TIL türetilmiş iPSCs üretimi için uyguladı.

Protokol

NOT: Hastalar Hücre Komitesi çalışmayı onayladı Kök Kurumsal Değerlendirme Kurulu ve insan pluripotent katılmak için bilgilendirilmiş onam vermelidir.

1. İzolasyon ve Kültürü TILS

1. patoloji servisi / doku tedarik çekirdekten histopatolojik tanı için gerekli değildir tümör materyal elde. 30 mi, tümör toplama ortamı (Tablo 1) 50 ml bir tüp içinde tümör numunelerinin 20-100 g yerleştirin.
2. Katı, sert, makas kullanarak kırılgan ve / veya kanlı nekrotik alanlar tümör örneğinin normal doku teşrih. nekrotik doku çıkarıldıktan sonra, mümkün olduğu kadar küçük örnek kıymaya makas kullanın.
3. üreticinin talimatlarına göre bir ayıracı ve tümör ayrılma kiti (insan) ile tek bir hücre süspansiyonu içine kıyılmış örnek ayrıştırmaları. 50 ml'lik bir tüp ayarlanır 70 mikron hücre süzgecinden ile süspansiyonu Filtre ve süzgeç 2 kez yıkayınRPMI 1640 2 mi.
4. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, 200 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve T hücre ortamı (Tablo 1), 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
5. Bu Ficoll% 100 gradyan çözeltisi, 10 ml daha düşük bir adımı ve Dulbecco fosfat- ile seyreltildi% 75 gradyan çözeltisi 30 ml'lik bir orta aşama ile 50 ml bir tüp içinde (gradyan çözeltisi) gibi bir iki-aşamalı gradyan çözeltisi hazırlayın tamponlu tuzlu su, herhangi bir kalsiyum, Resim magnezyum (D-PBS (-)).
6. (Adım 1.5 dan itibaren) gradyan çözümü (Adım 1.4) hücre süspansiyonu Katman. 45 dakika boyunca 20 ° C'de 400 x g'de santrifüjleyin.
7. % 100 gradyan çözeltisi ve 50 ml'lik bir tüp içinde% 75 gradyan çözeltisi arasında arayüzde zenginleştirilmiş TILS içeren tabakayı toplayın. D-PBS 20-30 ml ekleyerek zenginleştirilmiş TILS çözelti tabakası seyreltilmiş (-).
8. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, 200 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant atın ve 10 ml TIL zenginleştirilmiş fraksiyonu tekrar süspansiyonT hücre ortamı.
9. Kültür, 37 ° C 'de 6-çukurlu plaka içindeki 2 T hücre ortamı ml ve 6.000 lU / ml rekombinant insan (rh), IL-2 ile (Aşama 1.8) fraksiyonu,% 5 _CO2.
10. Kültür başlangıcından 5 gün sonra yarım medya değiştirin ve daha sonra her 2-3 günde bir.
11. 1 oranında hücreleri bölme: 2 trypsinization olmadan usulca% 80-90 confluency ulaştığında kuyu sayısını iki katına, askıya sonra. 6000 lU / ml taze T hücresi ortam ve rhlL-2 yarım hacmi (1 mi) eklenir.

Mitomisin-C ile tedavi edilen SNL Besleyici Hücre Plate 2. Hazırlık

1. % 80-90 (3-4 x 10 ⁶ hücre) kadar% 0.1 jelatin kaplı 10 cm tabak üzerine SNL besleme hücre ortamı (Tablo 1) 10 ml kültür SNL besleme hücreleri ulaşılır.
2. Şirketinden SNL besleyici hücre kültürü çanağı içinde 0.4 mg / ml mitomisin C çözeltisi 310 ul ilave edin ve 37 ° C'de 2 saat ve 15 dakika için,% 5 _CO2 inkübe edilir. medya a aspireND, 5 ml D-PBS ile iki kez yıkama hücreleri (-).
3. 0.5 mi% 0.25 tripsin / 1 mM EDTA ekleyin ve hücreleri ayırmak 1 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. nötralize etmek SNL besleyici hücre medya 4,5 ml ekleyin ve bir tek süspansiyon içine hücreleri yeniden askıya.
4. 5 dakika boyunca 200 x g'de 15 ml'lik bir tüp ve santrifüj içine hücreleri aktarın. ortamı aspire ve SNL besleyici hücre ortamının 10 ml'si içinde tekrar süspansiyon haline sonra hemasitometre ile hücre sayımı.
5. Plaka 1.5 x 10 ^6, 10 cm tabak üzerine SNL besleyici hücreler göz başına hücre ve 37 ° C'de inkübe,% 5 _CO2. 3 gün içinde SNL besleyici hücreler kullanın.

Sendai Virüs kullanılması iPSCs 3. Nesil (SeV) Vektör

1. Hasat TILS ve plaka bağlı fare anti-insan CD3 (1 ug / ml) ile TILS 5 x 10 ⁵ hücre aktive ve çözünebilir fare anti-insan CD28 (ug / ml 5 ug) (Kademe 1.11 arasında), rhlL-2 3 'ucunda bir 6-yuvalı plaka içinde, T hücre ortamı 2 ml (6.000 lU / ml)7 ° C, 5 gün süreyle% 5 CO _2.
2. bir pipet kullanılarak 15 ml bir tüp içinde (Kademe 3.1) TILS hasat ve bir hemositometrede hücre sayısını.
3. 500 ul rhlL-2 ile 1 tabak bağlı fare anti-insan CD3 (1 ug / ml) ile TILS x 10 ⁵ hücre ve çözünebilir fare anti-insan CD28 (5 ug / ml), (60 lU / ml) Yeniden 37 ° C'de 24 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına yeniden programlama ortamı (Tablo 1), 24 saat boyunca% 5 _CO2. SeV enfeksiyonu 3 kuyu hazırlayın: OCT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc (1 de); SeV enfeksiyonu (GFP: yeşil floresan protein) (1 kuyu); ve hücre sayımı (1 kuyu).
4. (Kademe 3,3) 24 saat sonra, bir hemasitometre hücre sayısını ve enfeksiyonun çeşitli (3-20) çokluklar (İB) için her virüsün hacmini belirler. -80 ° C depolama Sendai virüsü vektörü tüpler bir set çıkarın. su banyosunda (37 ° C) hızla SeV vektörleri çözülme ve buz üzerine koyun.
   Virüsün hacmi (ul)= İçişleri Bakanlığı (UKÜ / hücre) virüsünün / titre hücrelerinin sayısı x (UKÜ / ml) x 10-3 (ul / ml)
5. aktif TILS de dahil olmak üzere ortam içine 10-20 MOI'da SeV vektörlerinin bir karışımın ilave edilmesiyle tek tek OCT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc taşıyan dört Sendai virüsü vektörü tüplerinin her hesaplanan miktarlar ekleyin.
6. transdüksiyon etkinliğini belirlemek için, aktive edilmiş TILS bir kuyuya SeV-GFP hesaplanan miktarlar ekleyin.
7. (Kademe 3.5 ila 3.6 adım) tabağına yerleştirin, 24 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 inkübatörde. 24 saat sonra, floresan mikroskobu altında sev-GFP ile enfekte edilmiş TILS kullanılarak enfeksiyonun etkinliğini tahmin ediyoruz.
8. 15 ml'lik bir tüp içinde (Kademe 3.5 ila) hücreler toplanır. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, 200 x g'de santrifüjleyin.
9. Süpernatant atılır ve primat ES hücre ortamı ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 4 ng / ml) ile HESC ortamın 0.5 ml pelletini.
10. Conta 10 cm çanak içine süspansiyon aktarınINS HESC ortam, 10 ml SNL besleyici hücreler mitomisin C ile muamele edilmiş. koloniler yetiştirilen kadar her gün HESC ortamı değiştirmek.
11. 21 gün 18 civarında, temiz tezgah 10 ul ucu kullanarak bir mikroskop altında koloniler etrafında SNL besleyici hücreleri çıkarmak.
12. 10 ul ucu ile koloniler kazıyın ve 96 oyuklu doku kültür plakasının her bir oyuğuna iPSCs ortam 100 ul bir 200 ul ucu kullanarak transfer edin. Pipet yukarı ve 2-3 kez aşağı 50-100 mikron ortalama boyutu küçük kümeleri içine koloniler kırmak için.
13. Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 4 ng / ml) ile iPSCs ortam oyuk başına 2 ml (Kademe 2 de) mitomisin C ile muamele edilmiş SNL besleyici hücreler 6 oyuklu doku kültürü plakaları halinde küçük öbekler aktarın. Her gün iPSCs ortamı değiştirmek.
14. 5-6 gün 1 mg / ml kollajenaz IV, taze, mitomisin-C ile tedavi edilen SNL besleyici hücreler 6 oyuklu doku kültür plakalarına iPSCs aktarın. Immun her klon plakaları başına 2 kuyu hazırlayınostaining.
15. Pluripotency belirteçlerinin (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 ve Zeiss OCT3 / 4) ¹ immünohistokimyasal boyama ile her klon tam yeniden programlanması belirleyin.
    NOT: Pluripotency potansiyelinin daha fazla değerlendirilmesi için, tam yeniden programlanması iPSC hatları bir embriyoid vücut oluşumu ve farklılaşma tahlil ya da bir teratom oluşum deneyi ¹⁶ tarafından üç germ içine ayırt edebilirsiniz onaylayın.
16. Tam yeniden programlanması iPSC hatları sitogenetik analizi ile normal karyotipe göstermek onaylayın.
17. Teratom oluşumu için, farklılaşmamış bir TIL türetilmiş IPSC DMEM 6-8 haftalık dişi NOD / SCID farelerinin deri altı doku içine% 10 FCS içeren 100 ul (1 x 10 ⁶⁾ süspansiyonu enjekte edilir. hematoksilen ve eozin ile leke teratom bölümleri.

SSEA3, SSEA4, TRA1-60 ve TRA1-81 için iPSCs 4. immünofloresan boyama

1. Yıkama 1 ml PBS ile iPSCs ve% 4 pa 1 ml iPSCs gidermek10 dakika boyunca raformaldehyde çözeltisi. % 4 paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve PBS 3 kez 1 ml iPSCs yıkayın.
   NOT: toksik olduğu için paraformaldehid kullanırken dikkatli olun.
2. 30 dakika süre ile tampon (Tablo 1) engelleme iPSCs ön muamele. Bu arada, PBS ve Triton® X ile seyreltildi primer antikor (fare anti-insan SSEA3, fare anti-insan SSEA4, fare anti-insan TRA1-60 ve fare anti-insan TRA1-81) 01:50 1.5% keçi serumu çözeltisi seyreltilmiş -100 (toplam hacim: 1 ml).
3. Engelleme tampon (Tablo 1) sökün. seyreltilmiş birincil antikor solüsyonu ilave edildi ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. Diğer taraftan, ikincil antikor (anti-fare IgG ve IgM veya anti-sıçan IgM) 01:50% 1.5 keçi serumu çözeltisi seyreltilir.
4. seyreltilmiş primer antikor çözeltisi çıkarın ve 5 dakika için 1 ml PBS 3 kez, her biri iPSCs yıkayın. seyreltilmiş sekonder antikor solüsyonu eklenir ve karanlık bir odada, oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir.
5. seyreltilmiş sekonder antikor çözeltisi çıkarın ve 5 dakika boyunca PBS 3 kez 1 ml, her biri iPSCs yıkayın. mikroskobik inceleme ile iPSCs gözlemleyin.

Oct3 için iPSCs 5. İmmünofloresan Boyama / 4

1. Yıkama 1 ml PBS ile iPSCs ve 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisi 1 ml iPSCs düzeltin. % 4 paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve PBS ile 3 kez iPSCs yıkayın.
2. Permeabilizasyon tamponu (Tablo 1) ilave edilir ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Permeabilizasyon tamponu çıkarın ve tampon (Tablo 1) bloke ekleyin.
3. 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Bu arada bloklama tamponunu birincil antikor (fare anti-insan Oct3 / 4) 1:50 seyreltin.
4. seyreltilmiş birincil antikor solüsyonu eklenir ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
5. seyreltilmiş primer antikor çözeltisi çıkarın ve 5 dakika boyunca PBS ile 1 ml 3 kez, her biri iPSCs yıkayın. Bu arada, di(Anti-fare IgG / IgM keçi) Ud ikincil antikor 1: 100 blokaj tamponunda.
6. seyreltilmiş sekonder antikor solüsyonu ilave edin ve 45 dakika için karanlık bir odada, oda sıcaklığında inkübe edin.
7. seyreltilmiş ikincil çözelti çıkarın ve 5 dakika boyunca PBS 3 kez 1 ml, her biri iPSCs yıkayın. mikroskobik inceleme altında iPSCs uyun.

Sonuçlar

Şekil 1, anti-CD3 / CD28 ile aktivasyon ve TILS için OKT3 / 4, Klf4 Sox2 ve c-myc gen transferi takip etmektedir rhlL-2 melanom TILS, ilk genişleme içerir prosedür genel görünüşünü göstermektedir iPSCs üretimi için. Genellikle, rhIL-2 başlaması ile birlikte kültür üzerine TILS küreler kültür başlandıktan sonra 21-28 gün oluşturmak için. Bu noktada, TILS anti-CD3 ile aktif hale hazırız / CD28. Şekil 2A kültürü TILS, rhIL-2...

Tartışmalar

Burada, OCT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc, dört transkripsiyon SeV aracılı transdüksiyonu ile iPSCs için melanom TILS yeniden programlanması için bir protokol faktörleri gösterdi. Bu yaklaşım, T hücrelerini yeniden programlamak için SeV sistemi kullanılarak olmayan bir entegre yöntem ⁷ olanaklar sunar.

Bir önceki çalışma SeV yeniden programlama sistemi fibroblastlar değil, aynı zamanda periferik kan T hücrelerini ^7,17 sadece yeniden programlamak yüksek...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentle MACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentle MACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Tumor Dissociation Kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929
RPMI 1640	Life technologies	11875-093
Falcon 70 um Cell Strainer	BD	352350
BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes	BD	352070
IMDM	Life technologies	12440053
human AB serum	Life technologies	34005100
L-glutamine (200mM)	Life technologies	25030-081
2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)	Life technologies	21985-023
Penicillin-Streptomycin	Life technologies	15140-122
gentamicin	Life technologies	15750-060
Ficoll-Paque PLUS	GE	17-1440-02
D-PBS (-)	Life technologies	14040-133
recombinant human (rh) IL-2	Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3	BD	555329
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28	BD	555725
X-VIVO 15	Lonza	04-418Q
FBS	Gibco	26140-079
HEPES	Life technologies	15630-080
N-Acetylcysteine	Cumberland Pharmaceuticals Inc.	NDC 66220-207-30
Falcon Tissue Culture Plates (6-well)	Corning	353046
Falcon Tissue Culture Plates (24-well)	Corning	353047
Sendai virus vector	DNAVEC
SNL feeder cells	Cell Biolabs, Inc	CBA-316
mitomycin C	SIGMA	M4287	soluble in water (0.5 mg/ml)
gelatin	SIGMA	G1890
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life technologies	PHG0264