Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de melanoma humano linfocitos infiltrantes de tumores,

Resumen

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Resumen

La transferencia adoptiva de la expandidas ex vivo linfocitos autólogos infiltrantes de tumor (TIL) puede mediar respuestas duraderas y completas en subconjuntos significativos de los pacientes con melanoma metastásico. Los principales obstáculos de este enfoque son la reducción de la viabilidad de las células T transferidas, causadas por acortamiento de los telómeros y el número limitado de TIL obtenidos a partir de pacientes. células T diferenciadas menos con telómeros largos serían un subconjunto de células T ideal para la terapia adoptiva de células T, sin embargo, la generación de un gran número de estas células T menos diferenciadas-es problemática. Esta limitación de la terapia adoptiva de células T puede ser teóricamente superar mediante el uso de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) que auto-renovación, mantener los telómeros pluripotencia, han alargado, y proporcionar una fuente ilimitada de células T autólogas para la inmunoterapia. A continuación, se presenta un protocolo para generar células iPS utilizando vectores de virus Sendai para la transducción de factores de reprogramación en los TIL. Este protocolo generas, clones libres de vectores totalmente reprogramadas. Estas células iPS derivadas de TIL podrían ser capaces de generar células T en el paciente y específicos de tumores menos diferenciados para la terapia adoptiva de células T.

Introducción

Tecnología de reprogramación celular que permite la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a través de la sobreexpresión de un conjunto definido de factores de transcripción es una gran promesa en el campo de las terapias basadas en células ^1,2. Estas células iPS exhibir características transcripcionales y epigenéticos y tienen la capacidad de auto-renovación y pluripotencia, de manera similar a las células madre embrionarias (ESC) ^3-5. Notables progresos realizados en la técnica de reprogramación durante la última década ha permitido generar células iPS humanas, incluso a partir de células terminalmente diferenciadas, tales como las células T ^6-8. T iPSCs derivadas de células (TiPSCs) conservan la misma configuración reordenado de genes de la cadena del receptor de células T (TCR) como las células T originales, lo que permite la regeneración de las células T específicas de antígeno de TiPSCs ^9-11.

Casi el 80% de los linfocitos infiltrantes de melanoma (TIL) obtenido a partir de tumor de un paciente reconoce específicamente asociado a un tumor antígenos unand mantener la citotoxicidad contra las células cancerosas originales ^12. En particular, se encontró que la expresión de la muerte celular programada proteína-1 (PD-1) en los TIL para identificar el repertorio reactivos con tumor autólogo, incluyendo mutado CD8-neoantígeno específica ⁺ linfocitos ^13. La transferencia adoptiva de ex-vivo TILs autólogos expandidos en combinación con regímenes de lymphodepleting preparativa y la administración sistémica de la interleucina-2 (IL-2) puede causar regresión sustancial de melanoma metastásico en subgrupos de pacientes ^14. A pesar de los resultados alentadores en modelos preclínicos y en pacientes, la mala supervivencia de las células T infundidos y la existencia de vías inmunosupresores parecen poner en peligro todo el potencial de la terapia adoptiva de células T. Protocolos clínicos actuales requieren una extensa manipulación ex vivo de las células T autólogas con el fin de obtener grandes cantidades. Esto resulta en la generación de células T diferenciadas terminalmente que tienen pobre supervivencia, reducción de la proliferative capacidad, y altos niveles de PD-1 ^15.

Esta limitación de la terapia adoptiva de células T puede ser teóricamente superar mediante el uso de células iPS que pueden proporcionar una fuente ilimitada de células T autólogas para la inmunoterapia. Recientemente hemos informado de la reprogramación del melanoma TIL que expresan altos niveles de PD-1 por el virus Sendai (SEV) transducción mediada de los cuatro factores de transcripción, OCT3 / 4, Sox2, Klf4 y c-MYC ^16. Mientras que los vectores retrovirales requieren la integración en los cromosomas del hospedador para expresar genes de reprogramación, vectores SeV no se permite la integración y finalmente son eliminados del citoplasma. La reprogramación de la eficiencia es mucho mayor con un sistema de SeV en comparación con lentivirus o retrovirus vectores ^6-8. Además, SEV puede reprogramar específicamente a las células T en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), mientras que algunos clones IPSC generados por lentivirus o vectores de retrovirus pueden ser de linajes linfoides ^6-8. A continuación, detallamoslos procedimientos implementados para el aislamiento y la activación de melanoma humano TIL y para la generación de iPSCs derivados de TIL utilizando un sistema de reprogramación de SeV.

Protocolo

NOTA: Los pacientes deben dar su consentimiento informado para participar en la Junta de Revisión Institucional y Pluripotentes Stem Cell Comité aprobó el estudio.

1. Aislamiento y cultivo de TIL

1. Obtener material tumor que no se requiere para el diagnóstico histopatológico del núcleo de contrato de servicios de patología / tejido. Coloque 20-100 g de muestras de tumor en un tubo de 50 ml con 30 ml de medio de recogida tumorales (Tabla 1).
2. Diseccionar sólida, firme, el tejido normal de la muestra de tumor de las zonas necróticas frágiles y / o con sangre con unas tijeras. Después de eliminar el tejido necrótico, utilizar las tijeras para picar la muestra lo más pequeño posible.
3. Disociar el espécimen picado en una suspensión de una sola célula usando un kit de disociación disociador y tumor (humano) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se filtra la suspensión con un filtro de células de 70 micras que se establece en un tubo de 50 ml y lavar el filtro 2 veces con2 ml de RPMI 1640.
4. Centrifugar a 200 xg a temperatura ambiente durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de medio de células T (Tabla 1).
5. Preparar una solución de gradiente de dos pasos, tales como Ficoll (solución de gradiente) en un tubo de 50 ml, con un paso inferior de 10 ml de solución de gradiente de 100% y un paso de medio de 30 ml de solución de gradiente de 75% diluido con fosfato de Dulbecco solución salina tamponada, no de calcio, no de magnesio (D-PBS (-)).
6. Capa de la suspensión de células (de la etapa 1.4) en la solución de gradiente (del Paso 1.5). Centrifugar a 400 xg, a 20 ° C durante 45 min.
7. Recoger la capa que contiene los TIL enriquecidos en la interfaz entre la solución de gradiente de 100% y la solución de gradiente de 75% en un tubo de 50 ml. Se diluye la capa de la solución con los TIL enriquecidos mediante la adición de 20 a 30 ml de D-PBS (-).
8. Centrifugar a 200 xg a temperatura ambiente durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender la fracción enriquecida-TIL en 10 mlde medio de células T.
9. Cultura la fracción (del Paso 1.8) con 2 ml de medio de células T y 6000 UI / ml recombinante humana (rh) IL-2 en una placa de 6 pocillos a 37 ° C, 5% de CO _2.
10. Cambie la mitad los medios de comunicación en el día 5 después del inicio del cultivo y cada 2-3 días a partir de entonces.
11. Dividir las células en una proporción de 1: 2 sin tripsinización después de suspender suavemente, duplicando el número de pozos cuando se alcanza el 80-90% de confluencia. Añadir un volumen de medio (1 ml) de los medios de células T frescas y rhIL-2 en 6000 IU / ml.

2. Preparación del tratado con mitomicina-C de la célula Alimentador de Placas SNL

1. Cultura células alimentadoras SNL en 10 ml de medio de células SNL alimentador (Tabla 1) en una gelatina recubierta de plato 0,1% 10 cm hasta 80-90% de confluencia (3-4 x 10 ⁶ células) se alcanza.
2. Añadir 310 l de solución de 0,4 mg / ml de mitomicina C directamente en la placa de cultivo de células de alimentación SNL y se incuba a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 2 horas y 15 min. Aspirar los medios de comunicación unand lavar las células dos veces con 5 ml de D-PBS (-).
3. Añadir 0,5 ml de 0,25% de tripsina EDTA mM / 1 e incubar a temperatura ambiente durante 1 min para disociar las células. Añadir 4,5 ml de medio de células de alimentación SNL para neutralizar y volver a suspender las células en una suspensión.
4. Transferencia de las células en un tubo de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min. Aspirar los medios de comunicación y contar las células con un hemocitómetro después de volver a suspender en 10 ml de SNL medios de células alimentadoras.
5. Plate 1,5 x 10 ⁶ células por pocillo de las células alimentadoras SNL en un plato de 10 cm y se incuba a 37 ° C, 5% de CO _2. Utilizar las células alimentadoras SNL plazo de 3 días.

3. Generación de iPSCs que utiliza el virus Sendai (SEV) Vector

1. Recoger los TIL (de la etapa 1.11) y activar 5 x 10 ⁵ células de TIL con el ratón unido a la placa anti-CD3 humano (1 mg / ml) y el ratón soluble CD28 anti-humano (5 mg / ml), con rhIL-2 (6000 IU / ml) en 2 ml de medio de células T en una placa de 6 pocillos a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 5 días.
2. Recoger los TIL (del Paso 3.1) en un tubo de 15 ml con una pipeta y contar el número de células con un hemocitómetro.
3. Reactive 1 x 10 ⁵ células de TIL con el ratón unido a la placa anti-CD3 humano (1 mg / ml) y de ratón soluble anti-humano CD28 (5 mg / ml), con rhIL-2 (60 IU / ml) en 500 l de los medios de reprogramación (Tabla 1) por pocillo en una placa de 24 pocillos a 37 ° C, 5% de _CO2 durante 24 hr. Preparar 3 pozos para la infección SEV: OCT3 / 4, Sox2, Klf4 y c-myc (1 también); infección SEV (GFP: proteína fluorescente verde) (1 también); y recuento de células (1 también).
4. Después de 24 hr (del Paso 3.3), contar el número de células con un hemocitómetro y determinar el volumen de cada virus para varios (3-20) multiplicidades de infección (MOI). Retire un conjunto de tubos vector de virus Sendai desde el -80 ° C almacenamiento. Descongelar los vectores SeV rápidamente en un baño de agua (37 ° C) y colocarlos en hielo.
   Volumen de virus (l)= MOI (CIU / célula) x número de células / título de virus (CIU / ml) × 10-3 (l / ml)
5. Añadir los volúmenes calculados de cada uno de los cuatro tubos de vector de virus Sendai que llevaron individualmente OCT3 / 4, Sox2, Klf4 y c-MYC mediante la adición de una mezcla de vectores de SeV a 10-20 MOI en los medios de comunicación, incluyendo los TIL activado.
6. Para determinar la eficacia de transducción, añada los volúmenes calculados de SEV-GFP en un pozo de TIL activados.
7. Coloque el plato (del Paso 3.5 y 3.6 Paso) en la incubadora a 37 ° C, 5% de _CO2 durante 24 horas. Después de 24 h, estimar la eficacia de la infección utilizando TIL infectadas con VSe-GFP con microscopía de fluorescencia.
8. Recoger las células (de la etapa 3.5) en un tubo de 15 ml. Centrifugar a 200 xg a temperatura ambiente durante 5 min.
9. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 0,5 ml de medio de células madre con Primate ES medio celular y el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, 4 ng / ml).
10. Transferir la suspensión en una placa de 10 cm, que contains mitomicina-C-tratada células alimentadoras SNL en 10 ml de medio de células madre. Cambiar el soporte de células madre cada dos días hasta que las colonias se cultivan.
11. Alrededor del día 18 al 21, eliminar las células alimentadoras SNL alrededor de las colonias con un microscopio utilizando una punta de 10 l en la mesa de trabajo limpia.
12. Raspar las colonias usando una punta de 10 l y transferirlos usando una punta de 200 l en 100 l de los medios de comunicación iPSCs por pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Pipetear arriba y abajo en 2-3 veces para romper las colonias en pequeños grupos con un tamaño medio de 50 a 100 micras.
13. La transferencia de los pequeños grupos en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos con las células tratadas con mitomicina C del alimentador SNL (del paso 2) en 2 ml por pocillo de medio iPSCs con factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, 4 ng / ml). Cambio de medio iPSCs todos los días.
14. La transferencia de los iPSCs a placas de cultivo tisular de 6 pocillos con células alimentadoras SNL tratados con mitomicina-C frescas con 1 mg / ml de colagenasa IV cada 5-6 días. Preparar 2 pozos por placas de cada clon para Immunostaining.
15. Determinar la reprogramación completa de cada clon mediante tinción inmunohistoquímica de los marcadores de pluripotencia (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, y Oct3 / 4) ^1.
    NOTA: Para mayor evaluación del potencial de pluripotencia, confirman que las líneas de IPSC reprogramadas completamente pueden diferenciarse en tres capas germinales por una formación de cuerpos embrioides y ensayo de diferenciación o un ensayo de formación de teratomas ^16.
16. Confirman que las líneas de IPSC reprogramadas totalmente demuestran un cariotipo normal por análisis citogenético.
17. Para la formación de teratoma, inyectar una indiferenciada IPSC derivados de TIL (1 x 10 ⁶⁾ la suspensión en 100 l de DMEM que contiene 10% de FCS en el tejido subcutáneo de ratones de NOD / SCID hembra de 6-8 semanas. teratoma secciones se tiñen con hematoxilina y eosina.

4. Inmunofluorescencia La tinción de células iPS para SSEA3, SSEA4, TRA1-60 y TRA1-81

1. Lavar iPSCs con 1 ml de PBS y fijar las células iPS con 1 ml de 4% anualsolución raformaldehyde para 10 min. Eliminar la solución de paraformaldehído al 4% y se lavan las iPSCs con 1 ml de PBS 3 veces.
   NOTA: Tenga cuidado al usar paraformaldehído porque es tóxico.
2. Tratar previamente la iPSCs con tampón de bloqueo (Tabla 1) durante 30 min. Mientras tanto, diluir los anticuerpos primarios (rata anti-humano SSEA3, ratón anti-humano SSEA4, ratón anti-humano TRA1-60, y el ratón TRA1-81 anti-humano) solución de suero de cabra 1:50 en 1,5% diluida con PBS y Triton X -100 (volumen total: 1 ml).
3. Eliminar el tampón de bloqueo (Tabla 1). Añadir la solución de anticuerpo primario diluido y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Mientras tanto, diluir el anticuerpo secundario (IgG anti-ratón y IgM o anti-IgM de rata) 1:50 en 1,5% de solución de suero de cabra.
4. Retirar la solución de anticuerpo primario diluido y lavar las iPSCs con 1 ml de PBS 3 veces, cada uno de 5 min. Añadir la solución de anticuerpo secundario diluido y se incuba durante 45 min a temperatura ambiente en un cuarto oscuro.
5. Retirar la solución de anticuerpo secundario diluido y lavar las iPSCs con 1 ml de PBS 3 veces, cada uno de 5 min. Observar las células iPS con microscopía de inmunofluorescencia.

5. Inmunofluorescencia La tinción de las células iPS para Oct3 / 4

1. Wash iPSCs con 1 ml de PBS y fijar las iPSCs con 1 ml de solución de paraformaldehído al 4% durante 10 min. Eliminar la solución de paraformaldehído al 4% y se lavan las células iPS con PBS 3 veces.
2. Añadir tampón de permeabilización (Tabla 1) y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. Eliminar el tampón de permeabilización y añadir tampón de bloqueo (Tabla 1).
3. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Mientras tanto, diluir el anticuerpo primario (anti-ratón humano Oct3 / 4) 1:50 en tampón de bloqueo.
4. Añadir la solución de anticuerpo primario diluido y se incuba a 4 ° C durante la noche.
5. Retirar la solución de anticuerpo primario diluido y lavar las iPSCs con 1 ml de PBS 3 veces, cada uno de 5 min. Mientras tanto, dilaúd el anticuerpo secundario (de cabra anti-ratón IgG / IgM) 1: 100 en tampón de bloqueo.
6. Añadir la solución de anticuerpo secundario diluido y se incuba a temperatura ambiente en una habitación oscura durante 45 min.
7. Eliminar la solución secundario diluido y lavar las iPSCs con 1 ml de PBS 3 veces, cada uno de 5 min. Tenga en cuenta las iPSCs bajo microscopía de inmunofluorescencia.

Resultados

La figura 1 muestra la visión general del procedimiento que implica la expansión inicial del melanoma TIL con rhIL-2, que es seguido por la activación con anti-CD3 / CD28 y la transferencia de genes de OCT3 / 4, Klf4, SOX2, y c-MYC a TILs para la generación de iPSCs. Por lo general, los TIL en cultivo con rhIL-2 se empiezan a formar esferas 21-28 días después del inicio del cultivo. En este punto, los TIL son listo para ser activado con anti-CD3 / CD28. La ...

Discusión

Aquí, hemos demostrado un protocolo para la reprogramación de los TIL de melanoma de células iPS por transducción mediada por SeV de los cuatro factores de transcripción OCT3 / 4, Sox2, Klf4 y c-myc. Este enfoque, utilizando un sistema de SeV para reprogramar las células T, ofrece la ventaja de un método no integración de ^7.

Un estudio previo mostró que un sistema de reprogramación de SeV fue altamente eficaz y fiable para reprogramar fibroblastos no sólo, sino también...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentle MACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentle MACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Tumor Dissociation Kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929
RPMI 1640	Life technologies	11875-093
Falcon 70 um Cell Strainer	BD	352350
BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes	BD	352070
IMDM	Life technologies	12440053
human AB serum	Life technologies	34005100
L-glutamine (200mM)	Life technologies	25030-081
2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)	Life technologies	21985-023
Penicillin-Streptomycin	Life technologies	15140-122
gentamicin	Life technologies	15750-060
Ficoll-Paque PLUS	GE	17-1440-02
D-PBS (-)	Life technologies	14040-133
recombinant human (rh) IL-2	Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3	BD	555329
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28	BD	555725
X-VIVO 15	Lonza	04-418Q
FBS	Gibco	26140-079
HEPES	Life technologies	15630-080
N-Acetylcysteine	Cumberland Pharmaceuticals Inc.	NDC 66220-207-30
Falcon Tissue Culture Plates (6-well)	Corning	353046
Falcon Tissue Culture Plates (24-well)	Corning	353047
Sendai virus vector	DNAVEC
SNL feeder cells	Cell Biolabs, Inc	CBA-316
mitomycin C	SIGMA	M4287	soluble in water (0.5 mg/ml)
gelatin	SIGMA	G1890
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life technologies	PHG0264