ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

要約

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

要約

ex vivoでの養子移入は、転移性黒色腫を有する患者のかなりの部分集合で、耐久性と完全な応答を媒介することができる自己腫瘍浸潤リンパ球（TILを）を拡大しました。このアプローチの主要な障害は、テロメアの短縮に起因する転送T細胞の減少生存率であり、のTILの限られた数の患者から得られました。長いテロメアを有するあまり分化T細胞は、養子T細胞療法のための理想的なT細胞のサブセットであろうが、これらのあまり分化T細胞を大量に生成することは問題があります。この養子T細胞療法の制限理論的にその自己複製人工多能性幹細胞（iPS細胞）を使用することによって克服することができる、多能性を維持するためには、テロメアの伸長、および免疫療法のための自己T細胞の無制限の供給源を提供しています。ここで、我々はのTILへの再プログラミング因子の伝達にセンダイウイルスベクターを用いてiPS細胞を生成するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、生成します完全に再プログラム、ベクトルフリーのクローンです。これらのTIL由来のiPS細胞は養子T細胞療法のためのあまり分化patient-および腫瘍特異的T細胞を生成することができるかもしれません。

概要

転写因子の定義されたセットの過剰発現を介して人工多能性幹細胞（iPS細胞）の生成を可能にする細胞再プログラミング技術は、細胞ベースの治療法^1,2の分野において非常に有望です。これらのiPS細胞は、転写およびエピジェネティックな特徴を示すと同様に、胚性幹細胞^（ESC）3-5の自己再生および多能性の能力を有します。過去10年間にリプログラミング技術で作られた著しい進歩は、私たちはあっても、このようなT細胞^6-8のような分化細胞からヒトiPS細胞を生成することができました。 T細胞由来のiPS細胞（TiPSCs）はTiPSCs ^9-11からの抗原特異的T細胞の再生を可能にする、元のT細胞などのT細胞受容体（TCR）鎖遺伝子の再配列と同じ構成を保持します。

患者の腫瘍から得られた黒色腫浸潤リンパ球（TILを）のほぼ80％は、具体的には、A、腫瘍関連抗原を認識するNDオリジナルの癌細胞¹²に対する細胞傷害性を維持します。注目すべきこと、のTILのプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）の発現は、突然変異した新生抗原特異的CD8 ⁺リンパ球^13を含む自己腫瘍反応性レパートリーを同定することが見出されました。取リンパ球枯渇レジメンおよびインターロイキン2（IL-2）の全身投与と組み合わせてex vivoで拡大した自己のTILの養子移入は、患者¹⁴のサブセットに転移性メラノーマの実質的な後退を引き起こす可能性があります。前臨床モデルおよび患者に結果を励みにもかかわらず、貧しい注入されたT細胞の生存および免疫抑制経路の存在は、養子T細胞療法の可能性を最大限に妥協するように見えます。現在の臨床プロトコルは、多数を得るために、自己T細胞の大規模なex vivoでの操作を必要とします。これは、悪い生存率を有する最終分化T細胞の生成をもたらす、減少proliferative容量、およびPD-1 ¹⁵の高レベル。

養子T細胞療法のこの制限は、理論的には、免疫療法のための自己T細胞の無制限の供給源を提供することができるiPS細胞を使用することによって克服することができます。我々は最近、センダイウイルス（SeVを）4転写因子の媒介形質導入、OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC ¹⁶によるPD-1の高レベルで発現メラノーマのTILの再プログラミングを報告しています。レトロウイルスベクターは、再プログラミング遺伝子を発現するために宿主染色体への統合を必要とするが、センダイウイルスベクターは、非組み込みがあり、最終的に細胞質から排除されています。リプログラミング効率がレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを^6-8と比較したSeVシステムとはるかに高いです。レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターにより生成されるいくつかのIPSCのクローンは非リンパ系系列^6-8由来することができるしながらさらに、センダイウイルスは、具体的には、末梢血単核細胞（PBMC）中のT細胞を再プログラムすることができます。ここでは、詳細手順は、ヒトメラノーマのTILの単離および活性化のためにとのSeVの再プログラミング・システムを使用してTIL由来のiPS細胞の生成のために実装されています。

プロトコル

注：患者は、治験審査委員会に参加するためにインフォームドコンセントを与えるべきであり、ヒト多能性幹細胞の委員会は、研究を承認しました。

1.単離とのTILの文化

1. 病理サービス/組織の調達コアからの病理組織学的診断のために必要とされない腫瘍材料を入手します。メディアを収集する30ミリリットルの腫瘍（ 表1）を用いて50 mlチューブに腫瘍標本の20〜100グラムを置きます。
2. 固体、しっかりと、はさみを使用して、脆弱および/または血の壊死領域からの腫瘍標本の正常組織を解剖。壊死組織を除去した後、可能な限り小さく、試料をミンチするはさみを使用してください。
3. 製造者の指示に従って解離および腫瘍解離キット（ヒト）を使用して単一細胞懸濁液に刻んだ試料を解離させます。 50ミリリットルチューブに設定されている70μmのセルストレーナーでサスペンションを濾過して、ストレーナを2回洗浄RPMI1640培地2mlの。
4. 5分間、室温で200×gで遠心分離します。上清を捨て、T細胞培地（ 表1）の10ミリリットル中に細胞を懸濁します。
5. 100％勾配液及びダルベッコのリン酸で希釈した75％の勾配溶液30mlの中間ステップを10mlの下段で、50 mlチューブにかかるフィコール（勾配液）としての2段階勾配液を調製緩衝生理食塩水、無カルシウム、無マグネシウム（D-PBS（ - ））。
6. （ステップ1.5）の勾配溶液に（工程1.4からの）細胞懸濁液レイヤ。 45分間20℃で400×gで遠心分離します。
7. 100％勾配溶液、50 mlチューブ75％勾配液との界面に濃縮されたのTILを含む層を集め。 （ - ）D-PBS 20〜30 mlで添加することによって富化のTILの溶液の層を希釈します。
8. 5分間、室温で200×gで遠心分離します。上清を捨て、10mlのTIL濃縮画分を再懸濁T細胞メディア。
9. 37℃、5％CO ₂で6ウェルプレート中のT細胞培地を2ml 6,000 IU / mlの組換えヒト（RH）IL-2との培養（工程1.8からの）画分。
10. 培養開始後5日目に半分メディアを変更し、その後2〜3日ごと。
11. 80〜90％コンフルエントに達したとき、ウェルの数を2倍、そっと懸濁した後、トリプシン処理することなく、2：1の割合で細胞を分割します。 6000 IU / mlで新鮮なT細胞培地とのrhIL-2の半分の体積（1ミリリットル）を追加します。

マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞プレートの調製

1. 0.1％ゼラチンでコーティングした10cmディッシュ上のSNLフィーダー細胞培地（ 表1）10ml中の培養SNLフィーダー細胞を80〜90％コンフルエンス（3-4×10 ⁶細胞）に到達するまで。
2. 直接SNLフィーダー細胞培養皿に0.4 mg / mlでマイトマイシンC溶液310μLを加え、37℃で2時間15分間、5％CO ₂でインキュベートします。メディアAを吸引（ - ）ND 5ミリリットルのD-PBSで2回細胞を洗浄します。
3. 0.5ミリリットル0.25％のトリプシン/ 1mMのEDTAを添加し、細胞を解離するために1分間室温でインキュベートします。単一の懸濁液に細胞を中和し、再懸濁するためにSNLフィーダー細胞培地の4.5ミリリットルを追加します。
4. 5分間、200×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機に細胞を移します。メディアを吸引し、SNLフィーダー細胞培地10mlに再懸濁した後、血球計算板を用いて細胞を数えます。
5. プレート10cmディッシュ上のSNLフィーダー細胞のウェル当たり1.5×10 ⁶細胞を、37℃、5％CO ₂でインキュベートします。 3日以内のSNLフィーダー細胞を使用してください。

センダイウイルス（SeVの）ベクトルを用いたiPS細胞の3世代

1. （ステップ1.11から）のTILを収穫し、プレート結合マウス抗ヒトCD3（1μg/ ml）および可溶性マウス抗ヒトCD28（5μg/ ml）でのTILの5×10 ⁵細胞を活性化し、のrhIL-2と3で6ウェルプレート中のT細胞培地2ml中（6,000 IU / ml）を7℃で、5日間、5％CO _2。
2. ピペットを用いて15mlチューブ（ステップ3.1）からのTILを採取し、血球計で細胞数を数えます。
3. 500μlの中のrhIL-2（60 IU / ml）で、プレートに結合したマウス抗ヒトCD3（1μg/ mlの）および可溶性マウス抗ヒトCD28（5μg/ ml）でのTILの1×10 ⁵個^の細胞を再活性化37℃で24ウェルプレート中のウェルあたり再プログラム培地（ 表1）、24時間、5％CO ₂の。センダイウイルス感染のための3つのウェルを準備します。OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC（1ウェル）。センダイウイルス感染（GFP：緑色蛍光タンパク質）（1ウェル）。細胞数（1ウェル）。
4. （ステップ3.3から）24時間後、血球計数器を用いて細胞数をカウントし、感染症の様々な（3-20）多重度（MOI）のために各ウイルスの量を決定します。 -80℃ストレージからセンダイウイルスベクター管の1セットを削除してください。水浴（37℃）で急速センダイウイルスベクターを解凍し、氷の上に置きます。
   ウイルスの容量（μL）ウイルスの細胞/力価（CIU / ml）を×10-3（μL/ ml）を= MOI（CIU /セル）x個
5. 活性化のTILを含む培地中に10〜20 MOIでセンダイウイルスベクターの混合物を添加することにより、個別にOCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYCを担持4センダイウイルスベクターチューブのそれぞれの計算されたボリュームを追加します。
6. 形質導入効率を決定するために、活性化したのTILのウェルにのSeV-GFPの計算されたボリュームを追加します。
7. 24時間、37℃、5％CO ₂のインキュベーター内（ステップ3.5およびステップ3.6から）の皿を置きます。 24時間後、蛍光顕微鏡下でのSeV-GFPに感染したTILを使用して、感染効率を推定します。
8. 15ミリリットルチューブに（ステップ3.5から）の細胞を収集します。 5分間、室温で200×gで遠心分離します。
9. 上清を捨て、霊長類ES細胞用培地および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、4 ngの/ ml）でのhESC培地0.5mlにペレットを再懸濁。
10. コンタ10cmの皿にサスペンションを移しインのhESC培地10mlにSNLフィーダー細胞をマイトマイシンCで処理しました。コロニーが成長するまで一日おきのhESCのメディアを変更します。
11. 18〜21日頃、クリーンベンチ内で10μlのチップを用いて、顕微鏡下でコロニーの周りのSNLフィーダー細胞を除去します。
12. 10μlのチップを用いてコロニーを掻き取り、96ウェル組織培養プレートのウェルあたりiPS細胞培地100μlの中に200μlのチップを使用して転送します。 2-3時間で上下ピペット50から100ミクロンの平均サイズが小さな塊にコロニーを破壊します。
13. 塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、4 NG / ml）を用いてiPS細胞培地のウェルあたり2ml中の（工程2から）マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞を6ウェル組織培養プレートに小塊を移します。毎日iPS細胞のメディアを変更します。
14. すべての5-6日に1mg / mlのコラゲナーゼIVで新鮮マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞を6ウェル組織培養プレートにiPS細胞を移します。 IMMUNのために各クローンのプレート当たり2つのウェルを準備ostaining。
15. 多能性マーカー（SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、およびOCT3 / ^4）1の免疫組織化学染色により各クローンの完全な再プログラミングを決定します。
    注：多能性の可能性をさらに評価するために、完全に再プログラムIPSCラインが胚様体形成および分化アッセイまたはテラトーマ形成アッセイ¹⁶により三胚葉に分化することができることを確認します。
16. 完全に再プログラムIPSCラインは細胞遺伝学的解析により、正常な核型を示すことを確認してください。
17. テラトーマ形成のために、6〜8週齢の雌NOD / SCIDマウスの皮下組織に10％FCSを含むDMEM100μl中の未分化TIL由来のIPSC（1×10 ^6）の懸濁液を注入します。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色奇形腫セクション。

SSEA3、SSEA4、TRA1-60およびTRA1-81のためのiPS細胞の4.免疫蛍光染色

1. 1 mlのPBSと4％のPAの1ミリリットルでiPS細胞を固定で洗浄性IPSC10分間raformaldehydeソリューション。 4％パラホルムアルデヒド溶液を除去し、1mlのPBSで3回iPS細胞を洗います。
   注：パラホルムアルデヒドを使用しているとき、それは毒性があるので注意してください。
2. 30分間緩衝液（ 表1）を遮断してiPS細胞を前処理。一方、PBSおよびトリトンで希釈した一次抗体（ラット抗ヒトSSEA3、マウス抗ヒトSSEA4、マウス抗ヒトTRA1-60、およびマウス抗ヒトTRA1-81）1時50分1.5％ヤギ血清溶液を希釈-100（総容量：1ミリリットル）。
3. ブロッキングバッファー（ 表1）を取り外します。希釈した一次抗体溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。一方、1.5％ヤギ血清溶液中で二次抗体（抗マウスIgGおよびIgMまたは抗ラットIgM抗体）1:50に希釈します。
4. 希釈した一次抗体溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。希釈された二次抗体溶液を添加し、暗室において室温で45分間インキュベートします。
5. 希釈した二次抗体溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。免疫蛍光顕微鏡を用いてiPS細胞を観察します。

Oct3 / 4用のiPS細胞の5.免疫蛍光染色

1. 1 mlのPBSと10分間、4％パラホルムアルデヒド溶液の1mlでiPS細胞を固定と洗浄性IPSC。 4％パラホルムアルデヒド溶液を除去し、PBSで3回iPS細胞を洗います。
2. 透過化緩衝液（ 表1）を加え、室温で10分間インキュベートします。透過化緩衝液を除去し、緩衝液（ 表1）をブロックに追加します。
3. 室温で30分間インキュベートします。一方、ブロッキング緩衝液中で一次抗体（マウス抗ヒトのOct3 / 4）1:50に希釈します。
4. 希釈した一次抗体溶液を加え、4℃で一晩インキュベートします。
5. 希釈した一次抗体溶液を除去し、5分間、PBSの1ミリリットルで3回、それぞれのiPS細胞を洗います。一方、ディブロッキング緩衝液で100：二次抗体（ヤギ抗マウスIgG / IgM抗体）1リュート。
6. 希釈された二次抗体溶液を添加し、45分間、暗室において室温でインキュベートします。
7. 希釈した二次溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。免疫蛍光顕微鏡下でiPS細胞を観察します。

結果

図1は、抗CD3 / CD28による活性化とのTILにOCT3 / 4、KLF4、SOX2、およびc-MYCの遺伝子導入が続いているのrhIL-2と黒色腫のTILの初期膨張を伴う手順の概要を示していますiPS細胞の生成のため。通常、のrhIL-2開始と文化についてのTILは21-28日間培養開始後に球を形成しました。この時点で、のTILは、抗CD3 / CD28で活性化される準備ができていること、21日目のrhIL-2と文...

ディスカッション

ここでは、OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYCは、4つの転写のセンダイウイルス媒介形質導入によりiPS細胞に黒色腫のTILを再プログラミングするためのプロトコルを要因を明らかにしました。このアプローチは、T細胞を再プログラムするためのSeVシステムを使用して、非組込み方法⁷の利点を提供します。

以前の研究では、センダイウイルスの再プログラミング・シス...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentle MACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentle MACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Tumor Dissociation Kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929
RPMI 1640	Life technologies	11875-093
Falcon 70 um Cell Strainer	BD	352350
BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes	BD	352070
IMDM	Life technologies	12440053
human AB serum	Life technologies	34005100
L-glutamine (200mM)	Life technologies	25030-081
2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)	Life technologies	21985-023
Penicillin-Streptomycin	Life technologies	15140-122
gentamicin	Life technologies	15750-060
Ficoll-Paque PLUS	GE	17-1440-02
D-PBS (-)	Life technologies	14040-133
recombinant human (rh) IL-2	Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3	BD	555329
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28	BD	555725
X-VIVO 15	Lonza	04-418Q
FBS	Gibco	26140-079
HEPES	Life technologies	15630-080
N-Acetylcysteine	Cumberland Pharmaceuticals Inc.	NDC 66220-207-30
Falcon Tissue Culture Plates (6-well)	Corning	353046
Falcon Tissue Culture Plates (24-well)	Corning	353047
Sendai virus vector	DNAVEC
SNL feeder cells	Cell Biolabs, Inc	CBA-316
mitomycin C	SIGMA	M4287	soluble in water (0.5 mg/ml)
gelatin	SIGMA	G1890
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life technologies	PHG0264