Geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de melanoma humano linfócitos tumor infiltrantes

Resumo

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Resumo

A transferência adoptiva de expandidas ex vivo linfócitos infiltrantes tumorais autólogas (TIL) podem mediar respostas duráveis e completas em subconjuntos significativos de pacientes com melanoma metastático. Os principais obstáculos desta abordagem são a viabilidade reduzida das células T transferidas, causada pelo encurtamento dos telómeros, e o número limitado de TILs obtidos a partir de pacientes. As células T menos diferenciadas com longos telómeros seria um subconjunto de células T ideal para terapia adoptiva de células T, no entanto, a geração de grandes números de células T estas menos diferenciadas é problemática. Esta limitação da terapia celular adotiva T pode ser, teoricamente, superado usando células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) que se auto-renovar, manter os telômeros pluripotência, foram alongadas, e fornecer uma fonte ilimitada de células T autólogas para imunoterapia. Aqui, apresentamos um protocolo para gerar iPSCs usando vetores de vírus Sendai para a transdução de fatores de reprogramação em TIL. Este protocolo gerars clones totalmente reprogramadas, livre do vector. Estes iPSCs TIL derivados podem ser capazes de gerar células T específicos do paciente e de tumor menos diferenciadas para terapia adoptiva de células T.

Introdução

Tecnologia de reprogramação celular que permite a geração de células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs) através de sobre-expressão de um conjunto definido de factores de transcrição é uma grande promessa no domínio das terapias à base de células ^1,2. Estes iPSCs exibem características de transcrição e epigenéticos e ter a capacidade de auto-renovação e pluripotência, semelhante às células estaminais embrionárias (CES) ^3-5. Progressos notáveis em tecnologia de reprogramação durante a última década nos permitiu gerar iPSCs humanos, mesmo a partir de células terminalmente diferenciadas, como células T ^6-8. IPSCs derivadas de células T (TiPSCs) reter a mesma configuração rearranjados de genes das cadeias do receptor de célula T (TCR), como as células T originais, o que permite a regeneração de células T específicas para o antigénio de TiPSCs ^9-11.

Cerca de 80% de linfócitos infiltrantes de melanoma (TIL) obtidos a partir de tumor de um paciente reconhecem especificamente antígenos associados a tumores umnd manter a citotoxicidade contra as células cancerosas originais ^12. Notavelmente, a expressão de morte celular programada proteína-1 (DP-1) em TILs foi encontrada para identificar o repertório de tumor autólogo-reactivo, incluindo CD8 específicas do neo-antigénio mutado linfócitos ^{+ 13.} A transferência adoptiva de ex-vivo TILs autólogos expandidos em combinação com regimes lymphodepleting preparativa e a administração sistémica de interleucina-2 (IL-2) pode causar regressão substancial de melanoma metastático em subconjuntos de pacientes ^14. Apesar resultados encorajadores em modelos pré-clínicos e em pacientes, pobre sobrevivência de células T infundidos e a existência de vias imunossupressores parecem comprometer todo o potencial da terapia celular adoptiva t. Protocolos clínicos em curso exige uma extensiva manipulação ex vivo de células T autólogas, a fim de obter um grande número. Isto resulta na geração de células T terminalmente diferenciadas que têm baixa sobrevivência reduzida, Prolcapacidade iferative, e altos níveis de PD-1 ^15.

Esta limitação da terapia celular adotiva T pode ser, teoricamente, superado usando iPSCs que podem fornecer uma fonte ilimitada de células T autólogas para imunoterapia. Recentemente, relatou a reprogramação de melanoma TIL expressando altos níveis de PD-1 por vírus Sendai (vários) transdução mediada por um dos quatro fatores de transcrição, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 e C-MYC ^16. Enquanto vetores retrovirais requerem integração cromossomas do hospedeiro para expressar genes de reprogramação, vetores SEV são não-integração e, eventualmente, são eliminados do citoplasma. A reprogramação da eficiência é muito maior com um sistema de SeV comparação com lentivírus de retrovírus ou vectores ^6-8. Além disso, SeV pode reprogramar especificamente células T em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), enquanto alguns clones IPSC gerados por lentivírus ou vectores retrovirais pode ser a partir de linhagens não linfóides ^6-8. Aqui, nós detalheos procedimentos realizados para o isolamento e a activação de TIL de melanoma humano e para a geração de iPSCs TIL derivadas utilizando um sistema de reprogramação SeV.

Protocolo

NOTA: Os pacientes devem dar consentimento informado para participar do Conselho de Revisão Institucional e pluripotentes estaminais humanas Comissão celular estudo aprovado.

1. Isolamento e Cultura de TIL

1. Obter material de tumor que não é necessária para o diagnóstico histopatológico do núcleo aquisição de serviços de patologia / tecido. Coloque 20-100 g de espécimes de tumores em um tubo de 50 ml com 30 ml de meio recolha do tumor (Tabela 1).
2. Dissecar sólida, firme, tecido normal da amostra de tumor de áreas necróticas frágeis e / ou com sangue usando uma tesoura. Depois de remover o tecido necrótico, utilizar a tesoura para picar a amostra tão pequena quanto possível.
3. Dissociar o espécime picada em uma suspensão de uma única célula, utilizando um kit de dissociação Dissociator e tumor (humano) de acordo com as instruções do fabricante. Filtrar a suspensão com um filtro de células 70 mm que é definida em um tubo de 50 ml e lavar o filtro 2 vezes com2 ml de meio RPMI 1640.
4. Centrifugar a 200 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de meio de células T (Tabela 1).
5. Prepara-se uma solução de gradiente de dois passos tal como Ficoll (solução gradiente) num tubo de 50 ml, com um passo inferior de 10 ml de solução de gradiente de 100% e um passo de meio de 30 ml de solução de gradiente de 75% diluída com fosfato de Dulbecco solução salina tamponada, sem cálcio, nenhum magnésio (D-PBS (-)).
6. Camada de suspensão de células (do Passo 1.4) na solução de gradiente (do Passo 1.5). Centrifuga-se a 400 xg a 20 ° C durante 45 min.
7. Recolher a fase que contém os TILs enriquecidas na interface entre a solução de gradiente de 100% e a solução de gradiente de 75% em um tubo de 50 ml. Dilui-se a camada da solução com as TILs enriquecidos por adição de 20-30 ml de D-PBS (-).
8. Centrifugar a 200 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o TIL fracção enriquecida em 10 mlde meios de células T.
9. Cultura a fracção (a partir do Passo 1.8) com 2 ml de meio de células T e 6000 UI / ml de recombinante humana (rh) IL-2 em uma placa de 6 poços, a 37 ° C, 5% de CO _2.
10. Alterar a metade da media no dia 5 após o início da cultura e cada 2-3 dias depois.
11. Dividir as células numa proporção de 1: 2, sem tripsinização após suavemente a suspensão, a duplicação do número de poços quando se atinge 80-90% de confluência. Adicionar um volume de metade (1 ml) de meio de células T fresco e rhIL-2 a 6,000 UI / ml.

2. Preparação de-tratadas com mitomicina-C SNL alimentador de placa da pilha

1. Culturas SNL células alimentadoras em 10 ml de meio celular SNL alimentador (Quadro 1) sobre um 0,1% de gelatina revestidos por placa de 10 cm, até 80-90% de confluência (3-4 x 10 ⁶ células) é alcançado.
2. Adicionar 310 ul de solução C 0,4 mg / ml de mitomicina directamente na placa de cultura de células de alimentação SNL e incubar a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 2 h e 15 min. Aspirar a mídia aND lavar as células duas vezes com 5 ml de D-PBS (-).
3. Adicionar 0,5 ml de 0,25% de tripsina / EDTA a 1 mM e incuba-se à temperatura ambiente durante 1 min para dissociar as células. Adicionar 4,5 ml de meio de células de alimentação SNL para neutralizar e re-suspender as células em uma única suspensão.
4. Transferir as células num tubo de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Aspirar os meios de comunicação e contagem das células com um hemocitómetro, após re-suspensão em 10 ml de meio de células de alimentação SNL.
5. Placa de 1,5 x 10 ⁶ culas por po de células alimentadoras SNL em uma placa de 10 cm e incuba-se a 37 ° C, 5% de CO _2. Usar as células alimentadoras SNL dentro de 3 dias.

3. Geração de iPSCs utilizando o vírus Sendai (vários) Vector

1. Recolher as TILs (do Passo 1,11) e activar a 5 x 10 ⁵ células de TIL com rato ligado à placa anti-CD3 humano (1 jig / ml) e de rato solúvel de CD28 anti-humano (5 ug / ml), com rhIL-2 (6000 UI / ml) em 2 ml de meio de células T em uma placa de 6 poços a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 5 dias.
2. Recolher as TILs (do Passo 3,1) num tubo de 15 ml usando uma pipeta e contar o número de células com um hemocitómetro.
3. Reactivar 1 x 10 ⁵ células de TIL com rato ligado à placa anti-CD3 humano (1 jig / ml) e de rato solúvel anti-humano CD28 (5 ug / ml), com rhIL-2 (60 UI / mL) em 500 uL meios de reprogramação (Tabela 1) por poço numa placa de 24 poços a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 24 horas. Prepare 3 poços para a infecção SeV: OCT3 / 4, SOX2, KLF4, e c-Myc (1 cavidade); infecção SeV (GFP: proteína fluorescente verde) (1 poço); e contagem de células (1 cavidade).
4. Depois de 24 h (a partir do Passo 3.3), contar o número de células com um hemocitómetro e determinar o volume de cada vírus por vários (3-20) multiplicidades de infecção (MOI). Remover um conjunto de Sendai tubos vírus vetor da -80 ° C armazenamento. Descongelar os vectores SeV rapidamente num banho de água (37 ° C) e colocá-los em gelo.
   Volume de vírus (ul)= MOI (CIU / célula) x número de células / título do vírus (CIU / ml) × 10-3 (ul / ml)
5. Adicionar os volumes calculados de cada um dos quatro tubos de Sendai virus vector que individualmente transportados OCT3 / 4, SOX2, KLF4, e c-myc por adição de uma mistura de vectores SeV a 10-20 MOI para os meios de comunicação, incluindo TILs activadas.
6. Para determinar a eficiência de transdução, adicionar os volumes calculados de SEV-GFP em um poço de TILs activados.
7. Colocar a cápsula (a partir do Passo 3.5 Passo 3.6 e) na incubadora a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 24 horas. Após 24 h, estimar a eficiência de infecção usando TIL infectadas com SEV-GFP sob microscopia de fluorescência.
8. Recolher as células (do passo 3.5) em um tubo de 15 ml. Centrifugar a 200 xg à temperatura ambiente durante 5 min.
9. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 0,5 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas com Primata ES meio de células e factor de crescimento de fibroblasto básico (bFGF, 4 ng / ml).
10. Transferir a suspensão para um prato de 10 centímetros que Contains mitomicina-C-tratados células alimentadoras SNL em 10 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas. Troque a mídia CTEh a cada dois dias até que as colónias são cultivadas.
11. Por volta do dia 18 a 21, remover as células alimentadoras SNL em torno das colónias sob um microscópio utilizando uma ponta de 10 ul na bancada limpa.
12. Raspar as colónias usando uma ponta de 10 ul e transferi-las utilizando uma ponta de 200 uL em 100 uL de meios iPSCs por poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Pipetar cima e para baixo em 2-3 vezes para quebrar as colónias em pequenos aglomerados com um tamanho médio de 50-100 um.
13. Transferir os pequenos aglomerados em 6-se placas de cultura de tecidos com células alimentadoras SNL tratadas com mitomicina-C (a partir do Passo 2) em 2 ml por poço de meio de iPSCs com factor de crescimento de fibroblasto básico (bFGF, 4 ng / ml). Mudança de mídia iPSCs todos os dias.
14. Transferir os iPSCs a 6-se placas de cultura de tecidos com células alimentadoras SNL tratadas com mitomicina-C frescas com 1 mg / ml de colagenase IV a cada 5-6 dias. Prepare 2 poços por placas de cada clone para immunostaining.
15. Determinar a reprogramação completa de cada clone por coloração imuno-histoquímica de marcadores de pluripotência (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 e OCT3 / 4) ^1.
    NOTA: Para uma avaliação mais aprofundada do potencial pluripotência, confirme que as linhas de IPSC totalmente reprogramadas podem se diferenciar em três camadas germinativas por uma formação do corpo embryoid e ensaio de diferenciação ou um ensaio de formação de teratomas ^16.
16. Confirme que as linhas de IPSC totalmente reprogramadas demonstrar uma cariótipo normal por análise citogenética.
17. Para a formação de teratoma, injectar um indiferenciada iPSC TIL derivados (1 x 10 ⁶⁾ suspensão em 100 ul de DMEM contendo FCS a 10% para dentro do tecido subcutâneo de ratos NOD / SCID fêmeas de 6-8 semanas de idade. seções teratoma mancha com hematoxilina e eosina.

4. Imunofluorescência Coloração de iPSCs para SSEA3, SSEA4, TRA1-60 e TRA1-81

1. Wash iPSCs com 1 ml de PBS e corrigir as iPSCs com 1 ml de 4% aaraformaldehyde solução durante 10 min. Remover a solução de paraformaldeído a 4% e lavar as iPSCs com 1 ml de PBS 3 vezes.
   NOTA: Tenha cuidado ao usar paraformaldeído porque é tóxico.
2. Pretreat as iPSCs com tampão (Tabela 1) de bloqueio, durante 30 min. Entretanto, dilui-se os anticorpos primários (rato anti-humano SSEA3, de ratinho anti-humano SSEA4, de ratinho anti-humano TRA1-60, e TRA1-81 rato anti-humano de cabra) solução de soro 1:50 em 1,5% diluído com PBS e TritonX -100 (volume total: 1 mL).
3. Remover o tampão de bloqueamento (Tabela 1). Adicionar a solução de anticorpo primário diluído e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Entretanto, dilui-se o anticorpo secundário (anti-IgG de ratinho e IgM ou anti-IgM de rato) 1:50 em 1,5% de solução de soro de cabra.
4. Remover a solução de anticorpo primário diluído e lava-se as iPSCs com 1 ml de PBS 3 vezes, cada uma durante 5 minutos. Adicionar a solução de anticorpo secundário diluído e incuba-se durante 45 minutos à temperatura ambiente num quarto escuro.
5. Remover a solução de anticorpo secundário diluído e lava-se as iPSCs com 1 ml de PBS 3 vezes, cada uma durante 5 minutos. Observe as iPSCs com microscopia de imunofluorescência.

5. Imunofluorescência Coloração de iPSCs para OCT3 / 4

1. Lavar iPSCs com 1 ml de PBS e fixar as iPSCs com 1 ml de solução de paraformaldeído a 4% durante 10 min. Remover a solução de paraformaldeído a 4% e lavar as iPSCs com PBS 3 vezes.
2. Adicionar tampão de permeabilização (Tabela 1) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Remover o tampão de permeabilização e adicionar um tampão de bloqueio (Tabela 1).
3. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min. Entretanto, dilui-se o anticorpo primário (murganho anti-humano OCT3 / 4) a 1:50 em tampão de bloqueio.
4. Adicionar a solução de anticorpo primário diluído e incuba-se a 4 ° C durante a noite.
5. Remover a solução de anticorpo primário diluído e lava-se as iPSCs com 1 ml de PBS 3 vezes, cada uma durante 5 minutos. Enquanto isso, dilute o anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-rato IgG / IgM) 1: 100 em tampão de bloqueio.
6. Adicionar a solução de anticorpo secundário diluído e incuba-se à temperatura ambiente num quarto escuro durante 45 min.
7. Remover a solução diluída secundário e lava-se as iPSCs com 1 ml de PBS 3 vezes, cada uma durante 5 minutos. Observe as iPSCs sob microscopia de imunofluorescência.

Resultados

A Figura 1 mostra a vista geral do procedimento que envolve a expansão inicial de melanoma TILs com rhIL-2, o qual é seguido pela activação com anti-CD3 / CD28 e a transferência de genes de OCT3 / 4, KLF4, SOX2, e c-myc para TILs para a geração de iPSCs. Normalmente, TIL em cultura com rhIL-2 início para formar esferas 21-28 dias após o início da cultura. Neste ponto, TILs está pronto para ser activadas com anti-CD3 / CD28. A Figura 2A mostra ...

Discussão

Aqui, demonstramos um protocolo para a reprogramação TIL de melanoma de iPSCs por transdução mediada por SeV dos quatro factores de transcrição OCT3 / 4, SOX2, KLF4, e c-myc. Esta abordagem, utilizando um sistema de SeV para reprogramar células T, oferece a vantagem de um método não-integrando ^7.

Um estudo anterior mostrou que um sistema de reprogramação SeV foi altamente eficiente e confiável para reprogramar fibroblastos não só, mas também as células T do sangue ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentle MACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentle MACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Tumor Dissociation Kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929
RPMI 1640	Life technologies	11875-093
Falcon 70 um Cell Strainer	BD	352350
BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes	BD	352070
IMDM	Life technologies	12440053
human AB serum	Life technologies	34005100
L-glutamine (200mM)	Life technologies	25030-081
2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)	Life technologies	21985-023
Penicillin-Streptomycin	Life technologies	15140-122
gentamicin	Life technologies	15750-060
Ficoll-Paque PLUS	GE	17-1440-02
D-PBS (-)	Life technologies	14040-133
recombinant human (rh) IL-2	Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3	BD	555329
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28	BD	555725
X-VIVO 15	Lonza	04-418Q
FBS	Gibco	26140-079
HEPES	Life technologies	15630-080
N-Acetylcysteine	Cumberland Pharmaceuticals Inc.	NDC 66220-207-30
Falcon Tissue Culture Plates (6-well)	Corning	353046
Falcon Tissue Culture Plates (24-well)	Corning	353047
Sendai virus vector	DNAVEC
SNL feeder cells	Cell Biolabs, Inc	CBA-316
mitomycin C	SIGMA	M4287	soluble in water (0.5 mg/ml)
gelatin	SIGMA	G1890
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life technologies	PHG0264